单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种革兰氏阳性人兽共患胞内寄生菌^[1]，能引起人和动物的李斯特菌病。作为重要的食源性致病菌之一^[2]，LM广泛存在于自然环境中，可在高盐、低温和低pH值条件下生存，严重威胁食品安全和公共卫生^[3-5]。同时，LM也是一种最常见的腐生菌，易污染动物饲草料，给畜牧业的发展造成严重的损失^[6]。研究发现，LM的环境耐受能力和致病性与其基因组上编码的多种应激因子（VirR、Sigma B）和调控因子（PrfA、CodY）有着密切的关系^[7]，而非编码RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）与这些蛋白分子组成了复杂的调控网络，对LM毒力和环境应激相关基因在转录、转录后和翻译水平进行精细调控^[8]。

RibonucleaseⅢ（RnaseⅢ）是一种保守性较高的双链RNA特异性核酸内切酶，其中细菌RNase Ⅲ主要在rRNA成熟，mRNA降解和sRNA加工、转换和sRNA依赖性mRNA降解中起作用^[9-10]。前期研究证实^[11]，LM RnaseⅢ是一种依赖于二价金属阳离子的磷酸二酯酶，当镁离子存在时，该酶可发挥降解双链结构的RNA的活性，且随镁离子浓度不同其降解活性不同。然而，LM RnaseⅢ发挥酶活中的关键氨基酸位点至今尚未报道。鉴于此，本研究利用SOE-PCR技术构建LM- RnaseⅢ-D50A、LM- RnaseⅢ-E122A突变体，通过体外酶活试验检测其对RNA降解活性的变化，为深入揭示LM RnaseⅢ的作用特点和调控ncRNAs的分子机制奠定前期基础。

1 材料与方法 1.1 材料

LM-SB5野毒株由石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）和pET-32a（+）原核表达载体由本实验室保存；重组RnaseⅢ RncS由本实验室前期构建保存；Taq DNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T载体、限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase、DL-2 000 DNA Marker、DL-5 000 DNA Marker、蛋白Marker、Trizol购自TaKaRa公司；MgCl₂和MnCl₂均购自北京北化精细化学品有限责任公司；兔抗LM阳性血清由本室制备；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、低背景化学发光检测试剂盒购自TIANGEN公司。

1.2 方法 1.2.1 引物设计

根据前期扩增的rncS基因序列及生物信息学分析结果，通过Primer 5.0软件设计扩增rncS基因突变型D50A、E122A的特异性引物：D50A、E122A fragment1的扩增引物分别为H1、H2和R1、R2；D50A、E122A fragment1的扩增引物分别为H3、H4和R3、R4；重叠延伸PCR的引物分别为H1、H4和R1、R4；分析表达载体pET-32a（+）多克隆位点的情况，在H1、H4和R1、R4引物的5’端分别加酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ（下划线）及保护性碱基（斜体）（表 1）。引物由北京六合华大基因生物公司合成。

1.2.2 LM rncS基因结构域分析及突变位点的选择

应用在线生物信息学分析软件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/）预测RnaseⅢ RncS蛋白结构域；在NCBI中检索大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜热杆菌、布鲁氏菌等的RnaseⅢ氨基酸序列，利用DNAMAN 5.2.2软件进行多序列比对，选择高度保守的关键氨基酸进行突变。

1.2.3 LM rncS突变基因D50A、E122A的构建与测序鉴定

提取LM-SB5菌株基因组DNA，以基因组DNA为模板，用H1/H2和H3/H4两对引物分别扩增D50A fragment1和fragment2，用R1/R2和R3/R4两对引物分别扩增E122A fragment1和fragment2。SOE-PCR采用25 μL反应体系：水14.8 μL，fragment1和fragment2各3 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/Lol/L dNTPs 1.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，13个循环；再加入H1/H4和R1/R4引物各0.5 μL扩增片段的全长，反应条件：95℃预变性4min；95℃变性50 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min 40 s，30个循环；72℃延伸l0 min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的片段，并将目的片段克隆至pMD19-T Simple载体中，挑取阳性单克隆进行测序，构建突变质粒pMD19-T-D50A和pMD19-T-E122A。

1.2.4 突变型重组表达载体的构建与鉴定

将pET-32a（+）原核表达载体与测序正确的pMD19-T-D50A和pMD19-T-E122A质粒用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切。回收目的片段和载体片段后用T4 DNA连接酶连接，构建突变型重组表达载体。经菌液PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的突变型重组表达质粒命名为pET32a（+）-D50A和pET32a（+）-E122A。

1.2.5 突变型重组蛋白的诱导表达、纯化及Western blot鉴定

将鉴定正确的突变型重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，在Amp抗性的液体LB培养基中37℃培养至OD_{600 nm}为0.6-0.7，用IPTG进行诱导8 h，同时设置空载体对照，然后进行SDS-PAGE分析，利用镍离子亲和层析法纯化突变型重组蛋白，同时，以兔抗LM阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot分析。

1.2.6 突变型重组RnaseⅢ D50A和RnaseⅢ E122A对RNA降解活性研究

提取LM总RNA，分析LM重组RnaseⅢ RncS突变对RNA降解活性的影响。设立RNA的空白对照和未突变的重组RnaseⅢ RncS对照，同时，设立不同浓度的MgCl₂和MnCl₂，采用20 μL反应体系：RNA 7 μL、RnaseⅢ RncS、RnaseⅢ D50A和RnaseⅢ E122A均3 μL、MgCl₂（MnCl₂）X，加Urtrapure water 10-X μL。将纯化好的重组RnaseⅢ RncS及突变型重组LM RnaseⅢ D50A和LM RnaseⅢ E122A适当稀释，在不同浓度MgCl₂（MnCl₂），37℃条件下水浴15 min，反应产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察，定性地分析LM重组RnaseⅢ RncS突变对RNA降解活性的变化。同时，选取最佳浓度的MgCl₂和MnCl₂，按上述操作步骤，37℃条件下水浴15 min后分别测定各组的RNA浓度，并利用统计学方法定量分析LM重组RnaseⅢ RncS突变对RNA降解活性的变化。

2 结果 2.1 LM rncS结构域分析及突变位点的选择

SMART软件分析结果显示，LM-RnaseⅢ蛋白氨基酸序列含有1个核酸酶结构域（RIBOc，19-154）和1个双链RNA结合结构域（DSRM，160-227），其中核酸酶结构域RIBOc中有含有5个活性位点（active，43、46、50、119、122）（图 1）。通过DNAMAN多序列比对发现，这5个活性位点高度保守。

2.2 LM rncS基因突变型D50A、E122A fragment1、fragment2的扩增及重叠延伸PCR扩增结果

以LM基因组DNA为模板，用H1/H2、H3/H4及R1/R2、R3/R4特异性引物分别扩增突变型D50A、E122A的fragment1和fragment2，分别扩增得到161 bp、529 bp、374 bp、316 bp的目的条带，与预期结果一致。采用重叠延伸PCR技术融合fragment1和fragment2，得到与预期值690 bp相符的目的条带（图 2）；阳性克隆pMD19-T-D50A和pMD19-T-E122A测序后的对比分析表明D50A、E122A已成功突变。

2.3 突变基因重组表达载体的构建与鉴定

突变型重组质粒pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A用EcoR I/Xho I双酶切得到均为690 bp的目的条带和5 900 bp的pET-32a（+）片段（图 3），表明成功构建了pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A突变型重组原核表达载体。

2.4 重组突变体D50A和E122A的诱导表达、纯化与Western blot分析鉴定

将构建好的突变型重组表达载体pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性菌，经IPTG诱导表达8 h后，通过SDS-PAGE分析，突变型重组菌pET-32a（+）-D50A和pET-32a（+）-E122A均出现了分子质量为42.5 kD的特异性蛋白条带。纯化蛋白经SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约42.5 kD处可见单一条带，大小与预期值一致，结果表明纯化的蛋白效果较好。经Western blot分析鉴定，该突变型重组蛋白能与兔抗LM阳性血清发生特异性反应，表明克隆的LM rncS基因突变型D50A、E122A在大肠杆菌中获得表达（图 4）。

2.5 重组突变体RnaseⅢ D50A和RnaseⅢ E122A降解RNA活性分析

结果（图 5、图 6）显示，当缺乏Mn²⁺时，RnaseⅢ不能降解RNA，在低浓度的Mn²⁺和Mg²⁺条件下，RnaseⅢ的降解活性都较低，随着离子浓度的增大，其降解活性也升高，其中Mn²⁺浓度为50 mmol/L，Mg²⁺浓度为10 mmol/L时，RnaseⅢ具有较强的降解活性，但当Mn²⁺浓度大于100 mmol/L时，其降解活性减弱；在Mn²⁺浓度为50 mmol/L，Mg²⁺浓度为10 mmol/L的条件下，与对照组相比，将RnaseⅢ RncS第50位的天冬氨酸突变后，其降解活性减弱（P < 0.001），第122位的谷氨酸突变后降解活性显著下降（P < 0.000 1）（图 7），表明RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn²⁺或Mg²⁺，其中第122位的谷氨酸是维持RnaseⅢ RncS活性的关键位点。

3 讨论

RnaseⅢ是一种广泛存在于细菌、真核生物及噬菌体中的能够切割具有双链结构RNA的核酸酶，Wanger^[12]和Darfeuille^[13]等在大肠杆菌和沙门氏菌中研究证实，RnaseⅢ均参与了ncRNA的调控，影响基因的表达，从而调控细菌在宿主体内的生存。研究发现，ncRNA在LM毒力和环境应激适应过程具有重要的作用^[14]，然而，目前有关RnaseⅢ介导的ncRNA对其调控作用尚未研究。

序列比对发现，不同来源的细菌RNase Ⅲ是一种保守性较高的酶家族，均含有9个保守氨基酸（ERLEFLGDA）组成的RNase Ⅲ识别基序，是维持其酶降解活性的重要位点。RNase Ⅲ起同源二聚体的作用，通过核糖核酸酶结构域发生二聚化，两个核糖核酸酶结构域组合形成单个加工中心，每个结构域有助于双链底物的一条RNA链的水解^[15]。Blaszczyk等^[16]在嗜热杆菌（Aquifex aeolicus）Aa-RNase Ⅲ与dsRNA复合体晶体结构中研究发现，两个RNase Ⅲ单体通过NucD区的疏水作用和氢键结合形成二聚体结构，在两个单体作用界面形成一个催化谷（valley）结构用于结合RNA。因为单体蛋白靠近，来自同一亚基的五个酸性残基E38、E41、D45、D114和E117和一个来自伴侣亚基的E65簇位于催化谷的两端组成一个活性中心。在大肠杆菌中研究发现，E38参与蛋白质二聚化；E65参与底物识别和裂变键选择^[15]；D45、D114和D117螯合Mn²⁺离子^[17]；E41、D45、D114和E117进行易断裂键的水解^[18]。本研究通过生物信息学分析发现，LM-RNaseⅢ含有1个核酸内切酶结构域（RIBOc）和1个dsRNA结合结构域（DSRM），且核酸酶结构域RIBOc中的5个活性位点在其它细菌RNaseⅢ中高度保守。

目前，细菌RNaseⅢ蛋白是研究最广泛的一类磷酸二酯酶^[19]。Sun等^[17]研究发现大肠杆菌RNaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn²⁺或Mg²⁺。另外，Blaszczyk等^[20]在嗜热杆菌中研究发现，Mn²⁺或Mg²⁺离子为RNase Ⅲ发挥活性所必须；当其第110位的E突变为K后，Aa-RNase Ⅲ-E110K能与dsRNA结合，但失去切割活性。Lioliou等^[21]将金黄色葡萄球菌RNase Ⅲ中的残基E135和D63均突变成丙氨酸后，证实Sa-RNase Ⅲ-D63A和Sa-RNase Ⅲ-E135A降解活性显著降低。许先进^[22]将布鲁氏菌RNase Ⅲ中的E54、D61、E81、E133均突变成丙氨酸后，证实这四种突变蛋白均能与布鲁氏菌自身编码的dsRNA BM-pre-0015结合，但RNaseⅢ-E133A的结合能力和切割活性显著降低，表明E133是其发挥酶活所必须的。本研究通过体外酶活试验检测发现，不同浓度的Mn²⁺或Mg²⁺对LM-RNaseⅢ的降解活性不同，其中Mn²⁺为50 mmol/L、Mg²⁺为10 mmol/L时具体较好的降解活性。另外，构建的LM-RNase Ⅲ-E122A突变体降解活性显著降低，提示LM-RNase Ⅲ中的第122位谷氨酸是其维持酶活性的关键位点，为进一步揭示RnaseⅢ对LM ncRNA的作用方式和调控机制奠定前期基础。

4 结论

本研究利用生物信息学软件分析了LM-RNaseⅢ结构域，结果显示，LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1个核酸酶结构域（RIBOc）和1个双链RNA结合结构域（DSRM），其中结构域RIBOc中有含有5个活性位点；应用SOE-PCR技术构建了突变型LM-RnaseⅢ-D50A和LM-RnaseⅢ-E122A，并通过体外酶活实验检测显示，RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn²⁺或Mg²⁺，将其第50位天冬氨酸突变后，RnaseⅢ RncS的降解活性有所降低；第122位谷氨酸突变后，RnaseⅢ RncS降解活性显著下降，提示第122位谷氨酸是维持LM RnaseⅢ RncS酶活性的关键位点。