中药是我国珍贵的瑰宝, 几千年来, 在人们的养生、保健以及治疗疾病方面发挥着不可替代的作用。中药材种类繁多, 使用历史悠久, 来源复杂。有些药材全国各地都可种植, 然道地药材疗效最佳。一些中药的近缘种属极易混淆, 甚至不同中药的药用部位极其相似, 仿品和伪品也充斥其中, 鉴定方法不完善导致多起安全性事件, 给中药临床应用带来极大挑战^[1]。中药材是药效的基础, 因此, 必须不断发展和完善中药的鉴定方法, 确保药材的质量。中药的鉴定方法从中药药师凭借其长期积累的经验^[2-3]对中药形状、颜色、气味及重量等进行鉴定, 到通过显微镜观察药材的结构、组织特征等分析其特性, 以及一系列的物理化学方法对其进行定性定量分析, 如高效液相色谱法、红外光谱鉴定法、高效液相色谱-质谱分析法等, 大大提高了鉴定的准确性, 但仍存在一定的局限^[4]。随着计算机技术和生物技术的不断发展, 以DNA分子遗传标记技术、细胞生物学技术、图像分析技术及聚类分析技术等为标志的中药鉴定新技术新方法应运而生, 如随机扩增多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)分子标记^[5], 简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)等技术, 为中药鉴定技术的发展创造了新的发展空间^[6-7]。DNA分子标记技术具有微量、快速的特点^[8], 更合适没有详细背景材料的中药材的鉴别。分子标记具有特异性高、重复性好、结果可靠、操作简单, 对DNA要求不高等特点^[9]。随着高通量测序技术的发展, 一次就可获得大量的SSR分子标记, 为药用植物种质鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析提供了有力的工具。本文是在查阅文献的基础上, 归纳总结了SSR标记技术在中药鉴定中的应用, 旨为该技术在中药材中的进一步研究提供理论参考。

1 SSR分子标记

新一代测序技术(Next-generation sequencing, NGS)的发展为分子标记技术提供了一个新的平台^[10], 如微卫星(Microsatellite)和微卫星标记(Microsatellite marker)。微卫星标记为分子标记的一种, 微卫星标记又称为短串联重复序列(Short tandem repeat, STR)或简单重复序列(SSR)^[11], 指的是基因组中由1-6个核苷酸, 如(AT)_n、(AC)_n、(GA)_n、(AAG)_n、(AAT)_n、(CATG)_n等组成的基本单位重复多次构成的一段DNA^[12]。微卫星标记是根据微卫星标记两侧的已知序列设计扩增引物获得扩增产物的分子标记, 扩增得到的是包含微卫星标记序列在内的片段, 反映的是不同微卫星标记重复次数导致的多态性, 为共显性标记^[13]。由于微卫星标记位点两端的序列保守性强, 因此可以通过设计特异性引物来检测位点的多态性^[14]。根据微卫星标记的来源可将其分为基因组微卫星标记和表达序列标签(Expressed sequence tag, EST)-微卫星标记(Simple Sequence Repeats, SSR)^[15]。近年从表达序列标签中开发出微卫星标记(EST-SSR)可以充分利用现有序列标签数据, 很大程度上降低微卫星标记引物开发的难度^[16], 因其具有较好通用性且开发方法简单、成本低等特点应用更为广泛。

SSR分子标记具有多态性高、共显性、易检测、重复性高、数量丰富及对基因组有很好的覆盖性等特点^[17]。此外, SSR标记技术需要样品量少, 对物种损坏较少, 通过非损伤取样法即可获得的大量遗传信息, 是研究珍稀濒危植物的种群遗传多样性及保护种群资源的有力工具^[18]。

微卫星标记技术凭借其突出的优越性, 广泛应用于植物学和农学领域中系谱分析与进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、品种鉴定等方面^[19-20]。目前在农作物及经济作物中应用微卫星标记进行品种鉴定的研究较为多见, 如大麦、高粱和陆地棉等。微卫星标记法鉴定品种技术规程已作为农业行业标准供参考使用^[21]。国际植物品种权保护组织将微卫星标记指定为构建DNA指纹数据库的标记方法之一, 我国还根据微卫星标记指纹技术建立了玉米和水稻品种鉴定的2个行业标准^[22]。SSR还用于人类基因作图和目的基因筛选、法医学个体识别和亲权鉴定、器官移植、人类学、民族学及考古学等方面的研究^[23]。这表明微卫星标记技术有其独特的优势。

目前, SSR标记技术在中药中的应用虽远逊于在植物学和农学领域, 但有许多学者利用微卫星分子标记法对中药材进行分析研究, 如对中药的种质鉴定与分析、亲缘关系及遗传多样性分析及构建遗传连锁图谱等^[24]。

2 SSR标记技术在中药鉴定中的应用 2.1 伪品的鉴定

SSR标记可用于鉴定中药材伪品。刘艳丽^[25]以豆科中药黄芪为材料, 利用SSR分子标记法对黄芪及其7种常见伪品进行了鉴别。其借用同科植物大豆的10对SSR引物, 其中6对引物的结果显示黄芪及7种伪品分别产生了长度不同、等位基因数相异的SSR序列, 这种SSR位点的长度多态性以及它们各自不同的等位基因数目显示了它们的差异。蒋超等^[26]通过EST来源的SSR引物jp.ssr4、jp.ssr64和jp.ssr65准确鉴别金银花的原植物忍冬, 可区分其和变种红白忍冬及伪品山银花的来源植物红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬及黄褐毛忍冬。这表明SSR标记法应用于中药鉴别具有较好的可行性。

2.2 品种的鉴定

SSR标记可用于中药材品种的鉴定。张利民等^[27]在转录组测序的基础上, 分析蒙古黄芪转录组序列中的SSR位点, 设计引物并对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行鉴定。李清等^[28]通过生物信息学手段对金钗石斛转录组序列进行SSR位点搜索、分析, 并设计出SSR特异性引物。结果表明, 金钗石斛转录组测序产生的Unigenes信息可作为开发SSR标记的有效来源, 其中的SSR位点出现密度大、类型丰富、多态性潜能高, 在金钗石斛及其近缘种的分子鉴定、遗传多样性与分子育种等方面具有较好的应用前景。厚毅清等^[29]通过SSR分子标记技术, 筛选用于黄芪与红芪鉴定的核心引物, 通过聚类分析结果确认引物的有效性和准确性, 标记核心引物的特异性位点, 生成鉴定图谱代码, 为黄芪与红芪的鉴定及遗传分析提供依据。尹跃等^[30]以16个枸杞品种为材料, 利用SSR标记构建枸杞分子身份证, 为枸杞品种鉴定和保护提供参考。陈子易等^[31]挑选引物能扩增出可区分人参和西洋参的特异性片段, 用于鉴别人参和西洋参。

2.3 种质的鉴定与分子标记辅助育种

SSR技术可用于中药材种质的鉴定。王晓丽等^[32]采用AFLP、SSR及其聚类树对24份不同天麻种质材料的遗传多样性等进行分析, 并对AFLP和SSR这2种分子标记进行比较, 结果表明2种分子标记将天麻变型种质聚类划分的结果相近, 但SSR能将野生天麻聚在一类。这说明, 天麻不同种质AFLP多态性高于天麻SSR, 但SSR对野生天麻有较强的区分能力。吴素瑞等^[33]利用简单重复序列分子标记鉴别柴胡栽培种质的方法, 初步形成了可鉴别选育品系的SSR特征谱带数据。依据遗传距离构建聚类树图, 筛选出多态性高的引物, 获得了试验种质的SSR特征谱带数据, 将不同品系的柴胡种质各独自聚为一类, 筛选出的引物对和建立的检测方法可供柴胡种质鉴别参考使用。郑纪伟等^[34]基于高通量荧光SSR标记基因分型技术构建了16份含笑种质的指纹图谱, 用优选的4对核心引物区分了16份含笑种质。郭丽丽等^[35]利用22个自主开发的SSR标记对来自5个品种群的30个牡丹种质多态性及其亲缘关系进行了分析, 表明该标记具有多态性, 能有效鉴定牡丹种质资源的遗传多样性, 研究结果可为探究牡丹遗传多样性和牡丹资源保存提供理论依据。

SSR标记可用于中药材辅助育种。代娇等^[36]通过厚朴高通量转录组测序获得的Unigene序列进行SSR位点挖掘、引物设计, 挑选引物进行PCR, 对含有SSR的Unigene进行功能分析发现, 含SSR的Unigene与能量和氧化还原等代谢过程, 以及RNA转运、剪接体和植物激素信号转导等通路有关。厚朴高通量转录组序列的SSR位点具有类型丰富、特异性强和潜能高等特点, 同时SSR序列的功能分析将为厚朴基因挖掘和分子标记辅助育种提供有利的工具。李俊仁等^[37]以穿心莲转录组测序获得的Unigene为对象, 通过设计、筛选, 获得具有潜在多态性的SSR引物组合, 有10对可以扩增出与预期大小吻合的条带。通过基因功能注释发现, 含SSR的Unigene主要与穿心莲的基础代谢功能相关。结果表明, 穿心莲转录组中SSR位点出现频率高、类型丰富、多态性潜能较高, 同时SSR序列的功能分析也为穿心莲功能基因的定位研究和分子标记辅助育种提供了有利参考。

2.4 地域来源鉴别

SSR标记可用于中药材的地域来源鉴定。袁灿等^[38]对川芎根转录组数据获得的Unigene进行了SSR检测, 对检测到的EST-SSR进行特征分析, 利用EST-SSR引物对34个川芎资源进行遗传多样性分析, 结果显示收集的川芎资源多样性较好, 聚类显示川芎资源分为两大类, 聚类结果表现出一定的地域性。王学勇等^[39]对不同产地丹参样本DNA模板的PCR筛选和条件优化, 建立最新EST-SSR分子标记所选引物, 所选引物对不同产地丹参居群的分子标记出现了多态性。其建立的丹参最新EST-SSR分子标记具有较高的覆盖度和多态性, 可用于不同产地丹参居群的遗传变异分析。李敏等^[40]提取4种白芍的DNA基因组, 筛选随机引物对浙白芍、亳白芍、山白芍和川白芍进行PCR扩增, 并聚类分析得到山白芍与亳白芍遗传相似性系数最高而与浙白芍的遗传相似性系数最低。其中筛选到浙江白芍、安徽白芍和山东白芍的分子鉴定标记, 经克隆和测序后, 可为白芍的特异性PCR鉴定的引物设计打下基础。刘玉洋等^[41]从槐叶决明转录组数据库中通过遗传聚类分析, 将不同地区的样品划分为3类, 通过SSR标记鉴别出了从外观上很难鉴别的槐叶决明和不同产地望江南的差异, 发现槐叶决明、小决明和望江南种间, 以及小决明和望江南种内不同地理来源之间均存在较大遗传差异, 从而为槐叶决明和望江南的种质资源分析鉴定提供依据。

2.5 遗传多样性的研究

遗传多样性分析结果是构建中药材DNA指纹图谱及其DNA身份证的基础。杨雯等^[42]基于IlluminaMiSeq高通量测序平台对虎耳草属植物混合样本进行基因组测序, 利用开发的SSR标记对虎耳草属25种植物进行聚类分析, 发现物种间关系与根据传统形态学特征分类的结果还是存在差异的。齐琳洁等^[43]对不同产地的黄芩基因组序列进行分析, 筛选出扩增产物稳定性好, 多态性及清晰度高的引物用于10个不同产地共50份黄芩材料的遗传多样性分析, 表明黄芩具有较高的遗传多样性。林开勤^[44-45]研究开发获得15个多态性SSR标记, 并成功应用SSR分子标记探明贵州杜仲的遗传多样性与亲缘关系, 为杜仲的合理保护、种质资源收集与遗传改良提供理论依据。励娜等^[46]通过简单重复序列分子标记探讨了28个雷公藤属植物野生居群的遗传多样性和遗传结构。结果表明, 雷公藤属植物具有较高遗传多样性水平, 植物居群间存在较高的遗传分化。

3 小结与展望

分子标记技术被用于药用植物分类与中药材的鉴定研究以来, 受到DNA提取困难、测序费用高昂等问题的困扰, 但随着研究的深入, 高通量测序技术的飞速发展和测序成本的不断降低, 新一代高通量测序技术对中药材全基因组范围进行测序, 产生丰富的转录组数据, 对分子标记的发展产生了有力的推动作用。SSR分子标记已在物种鉴定、遗传多样性分析等方面发挥重要作用, 说明分子标记技术在中药材物种、种质资源, 建立标准数据库和分子身份证体系等方面的应用, 不仅有利于中药材的质量控制, 还在中药材种质资源保护、评价与利用以及中药材新品种选育等领域均能发挥重要的推动作用。SSR除了作为一种分子标记外, 还具有功能上的意义, 如在染色体组织上的影响, 对基因活性、DNA复制、细胞周期和纠错修复系统的调节、基因功能分析等。

如今, 随着对中药材的需求日益增加, 对其中药材鉴定的要求也会日益提高。中药鉴定学作为中药研究、生产制造、临床应用等的前提保障, 其对中医药行业的健康、持续、稳定发展具有重要意义。每一种药材鉴定方法都存在一定的局限性, 要充分了解各种鉴定方法的优势并将其合理应用, 从而对现有的方法进行合理的改进和补充。值得强调的是, 在引入新技术新方法的同时, 不能抛弃传统鉴别方法, 将两者合理的结合使用, 才能使中药鉴定学得到更合理和长远的发展。目前, 分子标记技术可以对药材的真伪、产地来源、年限、成药等进行鉴别, 但药材品质的优劣还要依靠其他科学仪器、方法或者人工鉴别等新方法判断。中药分子鉴别准确、快速, 但因为设备技术等条件的限制, 大多在实验室中完成。若能进一步扩大该技术的应用范围, 如药材流通市场、药企、药房等, 那么中药材的准确鉴定将会更加便捷。针对这一情况, 袁媛等^[47]提出了中药分子鉴别现场运用的策略, 根据具体检测对象的实际情况, 为各个环节上选择最优技术, 搭建最适技术体系, 用于中药快速、现场鉴别。随着系统生物基因组科学、代谢组学及蛋白质组学为基础的学科的不断完善和发展, 充分运用现代计算机科学技术、仿生技术及显微技术等为辅助, 中药鉴定技术发展将朝着更加快速、精准、便捷的方向发展。