随着人们生活水平日益提高, 当下食品消费不仅满足人们的营养和能量供给, 多样化的食品选择还能有效提升生活幸福感。高附加值食品如有机食品、认可度高的品牌、有产地保护标签的食品意味着能卖出更高的价格[1]。同类食品价格悬殊较大, 这也让造假者有机可乘, 挂羊头卖狗肉, 以次充好, 冒充原产地食品的报道屡见不鲜, 马肉冒充牛肉、叶绿素铜掺假大豆油冒充橄榄油, 再到近期麦卢卡蜂蜜, 掺假和贴牌"原产地"的食品充斥着市场, 同时食品造假也存着过敏源的隐患, 让消费者利益受到损害。这些食品造假属于以经济利益为驱动的食品欺诈, 是目前影响及破坏食品安全秩序的重要因素之一[2]。
目前针对这类食品造假的甄别, 已开发了很多方法, 如DNA鉴定、蛋白鉴定、元素鉴定、同位素质谱及拉曼光谱等, 而这些鉴别方法主要针对已知造假方式的某些靶标化合物进行检测, 或者只对原料的物种进行鉴定, 难以有效鉴别当今原料的稀释、替代等多种造假方式, 如造假者可以就食品中的特征标志物进行合成额外添加以应对单一化合物鉴别从而达到牟取暴力的目的, 或者在原料中掺入相似原料以达到造假目的, 诸如此类, 造假方式的多样化, 为食品造假鉴定带来了巨大的挑战。相比较其他农残兽残等有害物的靶向筛查, 食品造假检测需要对未知的造假模式进行监督和预防, 近年来, 随着高分辨质谱技术的成熟和普及, 在食品中也相应开发了非靶向代谢组学的鉴定手段, 本文就近几年基于高分辨质谱(High resolution mass spectrometry, HRMS)的非靶向代谢组学(Non-targeted metabolomics, NTM)在食品造假鉴定中的研究进展进行了综述, 旨在对食品检测中代谢组学的最新研究进展进行总结和归纳。
1 食品造假鉴定的范畴食品造假自古以来就存在, 并且在全球范围里广泛存在, 随着各国食品安全立法对食品造假行为的逐步打击, 食品造假事件有所减少, 但随着科学技术和化学工业的更新变化, 食品造假的形式和内容趋于越来越复杂, 造假手段的隐蔽性、可变性的不可预知性均给食品造假鉴定带来了很大的困难。造假者在施行造假行为时, 其造假方式他人很难了解或者掌握, 如我国2008年三聚氰胺奶粉事故是由于发现很多婴幼儿消费者患上肾结石, 随后才发现奶制品中含有三聚氰胺[3]。而造假者对现有法律法规尚未涉及或者无法涉及的漏洞或者盲点进行造假, 这种有针对性的造假手段给食品安全监管也带来很大的困难。
目前食品造假主要包括两个类型[4-5]:一是掺假或替换, 即食品中掺入一些造假成分, 以次充好和以假乱真, 以劣质原料、产品成分代替高品质原料或产品成分, 如在牛奶中掺入三聚氰胺、羊肉中添加鸭肉成分、陈茶叶充新茶叶、变质腐败的牛奶混入鲜奶、蜂蜜中加水等, 是最常见的造假方式; 二是信息的虚报或欺骗, 厂商隐瞒食品原料或产品中的某种质量缺陷, 或者为提高产品质量, 添加未知的或未申报过的成分, 包括虚报食品、食品成分、食品包装, 或对某产品进行欺骗或误导性的描述, 这类造假类型在保健食品中尤为严重[6]。据以往统计, 水产品食品造假案例最多, 占比20.6%;其次是肉制品(13.4%)、水果和蔬菜(10.4%)[5]。
2 高分辨质谱在代谢组学中的应用高分辨质谱属于代谢组学中的一种较为新型的技术手段, 代谢组学是由英国伦敦大学帝国学院的Nicholson[7]教授于1999年首先提出来的概念, 是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新兴发展起来的一门学科, 相比较基因组学、转录组学和蛋白质组学分别从基因、基因调控和蛋白质层面探寻生命活动, 代谢组学可以直接检测某一时刻生物体内的代谢产物, 能实时直接反映该生物体所处状态, 对代谢产物进行定性定量分析, 分析研究的对象是相对分子量在1 kD以内的小分子代谢产物。代谢组学研究又可以分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学, 靶向代谢组学主要是测定某个或几个或一类已知目标化合物, 非靶向代谢组学主要包括测定限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分, 后者主要原则是尽可能多地定性和相对定量生物体内代谢物, 最大程度反映总的代谢物信息。目前常应用于代谢组学化学计量分析仪器主要有色谱质谱联用和核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)两种, 其中核磁共振样品前处理简单, 不会破坏样品结构和性质, 可进行实时检测, 但灵敏度较差, 且多种内源性代谢物谱峰容易重叠, 影响了对代谢物的定性定量分析, 目前还是以色谱质谱联用技术为代谢组学主要技术手段。
受前处理方法和仪器设备的限制, 我国现有的食品检测标准基本上都是基于靶向代谢组学技术的应用, 针对已知的目标物质进行定量检测的方法, 已经在食品中农兽药残留检测、食品中非法添加检测等领域中取得很好的效果。但靶向代谢组学在食品造假鉴定时, 由于不法分子会对目标物质进行有针对性的添加, 常规的靶向代谢组学检测方法不足以有效抑制食品造假。近年来, 随着样品前处理技术的优化以及高分辨质谱结合数据处理模型的优化, 基于高分辨质谱的非靶向代谢组学已经开始在食品造假检测中被普遍认可和广泛应用。相比较传统低分辨质谱, 高分辨质谱能达到小数点后4位(m/z), 分辨率能达10 000以上, 通过精确分子量结合软件, 可以推导出化合物元素组成, 高分辨质谱在对于未知化合物定性上有着绝对的优势。
高分辨质谱主要有飞行时间质谱(Time-of-flight MS, TOF-MS)、傅立叶变换离子回旋共振质谱(Fo-urier transform ion cyclotron resonance MS, FTICR-MS)、磁质谱(Sector-MS), 以及近年出现的静电场轨道阱质谱(Orbitrap-MS)。其中Sector-MS运行速度慢, FTICR-MS虽然具有高分辨率、高准确度和高灵敏度的特点, 但是体积庞大、价格昂贵且操作复杂, 目前这两种高分辨质谱在食品检测领域中并不常用。TOF-MS具有极快的扫描速度和较高的灵敏度, 分辨率可达到15 000以上, 质量准确度可达5 ppm级, 能够获得样品的全扫描质谱图和精确质量数, 可以通过精确质量数对化合物进行定性分析, 目前广泛应用于食品中未知物的筛查[8]。TOF-MS包括气相色谱飞行时间质谱(Gas chromatograph time-of-flight MS, GC-TOF-MS)、液相色谱飞行时间质谱(Liquid chromatography time-of-flight MS, GC-TOF-MS)、液相色谱四极杆飞行时间质谱(Liquid chromatography quadrupole-time-of-flight MS, LC-qTOF-MS)、全二维气相色谱-飞行时间质谱(Two dimensional gas chromatograph time-of-flight MS, GC×GC-TOF-MS)。Orbitrap-MS是于2000年开发的新型质谱, 采用了静电场轨道阱作为离子的旋转振荡, 使离子围绕中心电极的轨道旋转从而捕获离子的装置, 是一种结合静电场离子阱和快速傅里叶变换技术的新型质谱[9], 由于其简化了FTICR-MS的运转过程, 较大的降低使用成本, 迅速得到了商品化的应用。Orbitrap-MS分辨率可达100 000, 质量准确度能达到2-5 ppm, 相比较TOF-MS, Orbitrap-MS对食品复杂基质样品更能节省样品前处理和方法优化的时间, 而TOF-MS主要体现在扫描速度的优势上。
3 非靶向高分辨质谱的食品造假鉴定流程针对已知的造假靶标化合物, 不法分子掺入量往往较大较易识别, 而对于原料品种、原料或者产地的造假, 由于食品基质复杂多样, 各种代谢物浓度范围相差较大对后续分析带来不便; 另一方面HRMS一次产生大量代谢物数据, 目前利用UPLC-qTOF-MS运行一次可以实现几千种化合物的分离。非靶向代谢组学意味着代谢组学的"大数据时代"来临, 而海量代谢物的定性定量都给非靶向代谢组学在食品造假的鉴定带来前所未有的挑战。
目前对于食品造假的HRMS研究, 不仅包括以往常规的样品制备、样品前处理优化, 还更侧重于后期的数据分析。针对HRMS产生的大数据, 各大质谱公司已经开发了相应的数据处理软件, 如Waters公司的MarkerLynx、Agilent公司的MassHunter、Thermo Scientific公司的Sieve, 这些软件能自动对峰图进行峰降噪、峰过滤、峰识别和峰匹配, 筛选出来的生物标志物还可以通过XCMS[10]、ChemSpider (http://www.chemspider.com)、PubChem[11]、SciFinder (https://scifinder.cas.org)和METLIN[12]等软件进行在线匹配预测化合物。最后对筛选出来的生物标志物的标准品进行验证并验证生物标志物在造假鉴定中的有效性, 图 1概括了基于HRMS的非靶向代谢组学在食品造假鉴定中的工作流程。
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| 图 1 基于HRMS的非靶向代谢组学在食品造假鉴定中的工作流程 |
目前对非靶向高分辨质谱产生的大数据进行生物标志物筛查主要有基于非监督方法(Unsupervised method)和有监督方法(Supervised method)两种模式。其中非监督方法的模式主要有主成分分析(Principal components analysis, PCA)、非线性映射(Nonlinear mapping, NLM)和聚类分析(Cluster analysis, CA)。而PCA是应用最广泛的非监督模式, 非监督方法的模式主要用于完全未知样品的原始数据处理, 可以对原始数据的样本特性进行有效降维和聚类, 最终将具有相似特征的目标化合物筛选出来。Vaclavik等[13]利用PCA方法对掺假15%苹果汁或者葡萄汁的橙汁的数据进行聚类而将掺假果汁识别出来, PCA方法还能对有机农产品进行监管, Tengstrand等[14]利用UPLC-qTOF-MS的非靶向代谢组学利用PCA方法进行聚类, 可以对未知污染物进行有效监督, 从而达到对有机农产品质量的监管。而有监督方法的模式主要有线性判别分析(Lin-ear discriminant analysis, LDA)、偏最小二乘法-判别分析(Partial least squares discriminant, PLS-DA)和正交信号校正技术偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal signal correction-Partial least squares discriminant, OPLS-DA)等。有监督方法主要是对已知样品类型进行数据处理, 根据样品进行分型建立数据模型, 并从中对未知样品进行辨识、归类和预测, 以此来判定未知样品类型, 可以有效地应用在可疑样品和已知实物样品间的筛查中。在食品造假数据处理中, 有监督方法往往和无监督方法配合使用, 如Hrbek等[15]利用PCA和LDA方法对有机乳制品进行确认; Cajka等[16]利用PCA和OPLS-DA方法对鸡肉掺假进行鉴定; Hurtado-Fernández[17]用PCA和PLS-DA方法对牛油果的成熟度进行聚类分析。以上数据分析模型可以根据具体研究样品量和数据量来进行选择。
4 高分辨质谱在食品造假鉴定中的应用 4.1 高分辨质谱在食品物种(品种)鉴别中的应用食品的品质和相关特征主要取决于其食品原料农产品的遗传背景和环境因素, 不同品种有着不同的特征、品质和口味, 利用气相色谱、液相色谱, 特别是超高效液相色谱(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)和高分辨质谱联用技术能有效地鉴别不同品种的代谢差异。Jandrić等[18-20]利用UPLC-qTOF-MS可以有效区分橙子、西柚、柑橘、凤梨等不同水果果汁, 还能对不同花源的蜂蜜进行区分; Moco等[21]利用LC-TOF-MS发现不同品种之间有8种柚皮素或柚皮素查尔酮衍生物具有含量差异; MacKenzie等[22]利用GC-TOF-MS检测不同酵母菌株发酵的代谢差异物; Dobson等[23]利用GC-TOF-MS发现可以通过糖、氨基酸和一些微量脂类的差异而区分不同品种的马铃薯; Hrbek等[24]利用UPLC-TOF-MS和实时直接分析离子源耦合Orbitrap-MS (Direct analysis in real time ion source coupled Orbitrap-MS, DART-Orbitrap-MS)发现转基因和非转基因大豆之间磷脂酰胆碱和糖含量的代谢差异。
4.2 高分辨质谱在食品产地鉴定中的应用除了食品原料的遗传背景, 原料生长的自然生态环境、种植方式等条件也对最终的食品特征、品质和口味有着很大的影响。传统的原产地分析方法主要是测定其有机物、无机元素、稳定同位素质谱等, 再通过一系列的计量方法建立特征性成分与产地的联系, 而以上均需要大量的样本, 涉及检测项目越多其产地鉴定越准, 实际操作鉴定方法繁琐, 而利用高分辨质谱, 可以简化鉴定流程, 并且可以轻松实现小样本的鉴定。Mattarucchi和Cajka等[25-26]利用UPLC-qTOF-MS和GC-TOF-MS对Trappist啤酒真伪进行验证; Jin等[27]利用LC-qTOF-MS对姜黄进行代谢物分析, 可以根据姜黄素类化合物的含量高低对不同产地的姜黄进行聚类; Arbulu等[28]利用LC-qTOF-MS对Graciano葡萄酒进行鉴定发现, 一些糖、氨基酸、高碳醇、生物胺、有机酸和酚类物质可以作为其特征代谢物。
4.3 高分辨质谱在食品品质鉴定中的应用除了对食品原料品种和产地进行检测, 高分辨质谱还在食品的品质鉴定中发挥了重要作用, 可以在食品的加工工艺质控和有机食品认证等环节进行有效监管和检测, 可以有效地监管食品造假行为。Capanoglu等[29]利用LC-TOF-MS发现加工后番茄与鲜番茄之间的营养差别; Ruiz-Aracama等利用UPLC-QTOF-MS在有机养殖和普通养殖的鸡肉中发现N, N'-二阿魏酸丁二胺和异黄酮的含量差异[30]; Hrbek等[31]对不同产地的大蒜进行高分辨质谱分析, 发现蒜氨酸、磷脂酰胆碱(16:0/18:2)、精氨酸、脱氢丙氨酸、磷脂酰乙醇胺(16:0/22:6)、L-γ-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸和甘磷酸胆碱可作为大蒜的靶标化合物。
5 总结与展望高分辨质谱应用于食品监管领域有着分辨率高, 扫描速度快等优势。高分辨质谱可以进行精确质量测定, 同时获得精确质量信息和碰撞破裂后的精确碎片离子质量信息, 在对食品中可疑未知化合物定性有着无可比拟的优势。而目前高分辨质谱面临的主要问题是, 一方面相较于低分辨质谱来说高分辨质谱价格昂贵, 不能在各个食品监管实验室普及; 另一方面, 高分辨质谱其定量灵敏度不及传统三重四级杆质谱。因此, 在利用高分辨质谱进行食品掺假物的定性分析, 最后还将依赖于传统三重四级杆质谱来进行方法开发, 以便于行业内应用推广。
随着高分辨质谱的广泛应用, 基于高分辨质谱的非靶向代谢组学将作为现有食品监管检测方法的一个有效补充方法, 以此方法开发相应的检测流程, 并且有可能以此建立相应检测标准。同时各国政府对食品安全和标识监管的不断完善, 加上各国对食品造假行为的加大打击, 相信未来食品造假事件会有所减少。而随着人们生活水平的提高, 对食品的需求将越来越多元化, 食品的营养需求会越来越细分, 基于HRMS非靶向代谢组学不仅仅是应用在食品造假鉴定检测中, 还会应用在食品营养分析、个人营养需求定制等方向。相信在不久的将来, 基于高分辨质谱的非靶向代谢组学在食品中运用将越来越广泛。
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