转化生长因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)普遍存在于真核生物细胞中，是TGF-β超家族(Transforming growth factor superfamily)的重要成员之一。在哺乳动物中，TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种不同的亚型[1]，在鸟类中存在TGF-β4[2]，在两栖类中存在TGF-β5[3]。大量研究显示，TGF-β信号通路在细胞增殖、分化、迁移、黏附、胶原产生、细胞外基质合成和细胞凋亡等许多生命活动中均发挥重要作用[4-7]。截止到2018年5月，在美国国立生物信息中心(NCBI)中已登录的TGF-β家族基因序列条目共有464条，其中鸟类220条，哺乳动物69条，棘皮动物43条，贝类21条，节肢动物19条，硬骨鱼3条，两栖类3条及其他物种86条。
相较于鸟类和哺乳动物而言，海洋生物TGF-β的研究仍相对较少，目前主要是关于鱼类、贝类、棘皮类TGF-β基因的cDNA全长克隆、序列分析及生物功能的初步研究。例如，Ottaviani等[8]研究证实TGF-β1过表达可以诱导紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)血细胞的形状变化和趋化迁移。之后，Kletsas等[9]在上述研究的基础上通过免疫细胞化学方法证实TGF-β1信号可沿磷酸肌醇(Inositol phosphate)信号传导途径传导，在紫贻贝体内进行免疫调节。Maehr等[10]使用聚肌胞：聚胞苷酸[Polyinosinic-polycytidylic acid injection，Poly(I：C)]和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)等刺激虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的头肾(Head kidney，HK)巨噬细胞系，诱导其发生免疫应答反应。与对照组相比，各免疫刺激剂处理组虹鳟巨噬细胞系中TGF-β1b基因的表达水平显著升高(P < 0.05)，提示，虹鳟TGF-β1b可能参与其主要的免疫过程。在棘皮动物中，TGF-β已被证实与海胆胚胎的对称性生长，以及幼体骨骼的生物矿化(Biomineralization)密切相关[11-13]。
海水酸化(Seawater acidification or ocean acidifi-cation，OA)是由于海洋吸收了大气中过量的CO2而导致的海水pH下降的现象[14-16]。大量研究证实，海水酸化对海洋生物和海洋生态系统有着深刻而复杂的影响[17]。海胆是海洋浅海生物的代表物种，也是研究海水酸化对海洋生物影响的模式生物之一[18]。研究发现，海水酸化不仅可以影响海胆骨骼的早期钙化生长，还对不同海胆的受精、卵裂、对称体制发育和浮游幼体存活等产生不同程度的影响[19-21]。胡婉彬[22]的研究显示，与自然海水组相比，不同海水酸化条件下，马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)四腕浮游幼体中TGF-β基因的表达趋势随海水pH值的降低而显著升高，且TGF-β信号通路始终位于显著富集的差异表达信号通路的前10位，提示TGF-β基因可能在海胆浮游幼体响应酸化海水胁迫中发挥重要作用。此外，有研究发现，当生物体受到外界刺激或胁迫时，可通过调节体内TGF-β基因的相对表达量对外界环境刺激或胁迫作出响应[23]。那么，TGF-β基因是否参与成体海胆响应海水酸化胁迫的过程；不同海水酸化胁迫条件下，TGF-β基因在成体海胆中的表达模式是否发生变化，变化趋势是否与浮游幼体相同；TGF-β基因在成体海胆响应海水酸化中发挥何种功能，目前尚未见报道。
光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)，又称大连紫海胆，主要分布于中国辽东半岛和山东半岛的黄、渤海海域，因其性腺营养丰富、品质上乘，是我国北方近岸海域最主要的经济种类和重要的出口海产品种类之一[24]。为明确光棘球海胆(M. nudus)TGF-β基因的序列及结构信息，初步探明该基因的表达模式和生物功能。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术首次获得了光棘球海胆TGF-β基因(MnTGF-β)的cDNA全长序列，分析了该基因及其编码产物的结构特征，初步研究其在光棘球海胆中的组织表达规律及其在海水酸化胁迫下的表达变化情况，以期为丰富棘皮动物TGF-β家族成员序列信息以及生物功能研究提供一定的基础数据。
1 材料与方法 1.1 材料实验所需的光棘球海胆(M. nudus)，平均壳径29.33 ± 2.80 mm，采集于大连黑石礁海域(121°33’47”E，38°51’55”N)。实验前，暂养在大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室的循环水槽(约1 000 L)中，暂养条件为：pH 8.06 ± 0.01；盐度30.16 ± 0.14；海水温度12.56 ± 0.13℃；充分溶氧；暂养期间投喂海带(Laminaria japonica)，换水周期为2 d。
选择健康、活力好的光棘球海胆3只，分别提取其性腺、体腔液、肠、围口膜和管足5种组织，做好标记后立即用液氮冷冻，存放于-80℃中，用于MnTGF-β基因的克隆和组织表达规律检测。
1.2 方法 1.2.1 海水酸化处理海水酸化处理使用“实验室模拟海水酸化系统”(ZL. 201320267332.7)，CO2海水酸化胁迫按照文献[20]中的方法进行。根据IPCC(2013)报告的预测2100年海洋pH值[25]，设定一个自然海水组(control)和3个海水酸化实验组(OA1，△pH = -0.3；OA2，△pH = -0.4；OA3，△pH = -0.5)。为减小实验误差，每组设置3个平行(n=3)，共12组，每组中放入5只光棘球海胆。海水酸化处理过程中，使用pH计(HI9124，HANNA，意大利)和水质仪(A329，Thermo，美国)实时监测各组海水的pH、盐度和温度(表 1)。为避免海水pH的剧烈波动，酸化胁迫期间不投喂食物。
分别在海水酸化胁迫的第1 d、4 d和7 d，从各实验组中取出1只海胆，取其性腺、肠和管足3种组织，做好标记后立即用液氮冷冻，存放于-80℃中用于探究各组织中的MnTGF-β基因在不同酸化条件下的表达变化情况。
1.2.2 MnTGF-β基因cDNA全长的克隆利用Trizol法提取光棘球海胆体腔液中的总RNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计(NanoPhotometer公司，德国)检测RNA的完整性和浓度后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(宝生物公司，大连)试剂盒将总RNA反转录为第一条链cDNA(反应体积及条件参照说明书进行)。根据紫球海胆(S. purpuratus)TGF-β2的基因序列(GenBank登录号：XP_793246.2)设计扩增光棘球海胆TGF-β基因核心片段的引物(表 2)。使用LATaq试剂盒(宝生物公司，大连)进行PCR扩增，其PCR反应体系为：10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+ Plus)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 31 μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)1 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，通过胶回收试剂盒(生工，上海)回收目的片段，并连接到pEASY-T1质粒，后转化到Trans1-T1感受态细胞中(全式金，北京)，涂LB(含Amp)平板后37℃恒温培养箱中培养过夜。翌日挑取单菌落接种于1 mL LB液体培养基(Amp终浓度为100 μg/mL)中振荡培养，通过菌落PCR使用M13通用引物(表 2)初步鉴定阳性克隆，后送至上海生物生工公司进行测序。将测序结果于NCBI中进行比对，获得MnTGF-β基因的保守区序列，再以该序列作为模板进行RACE片段扩增，设计5’/3’RACE特异性外侧和内侧引物(表 2)。5’/3’RACE反转录按照SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司，美国)说明书进行，获得RACE的cDNA模板。以RACE cDNA为模板进行5’/3’PCR产物扩增，其反应体系、反应条件、产物纯化、克隆及序列测定方法同上述核心片段的克隆。所用引物(除通用引物)均使用Primer Premier 5.0软件设计。
使用BLAST(BLASTX，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行MnTGF-β的核苷酸和氨基酸序列相似性分析；使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定MnTGF-β开放阅读框(Open reading frame，ORF)及其编码的氨基酸序列；使用ExPasy(http://www.expasy.org/)的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析推导MnTGF-β蛋白的基本理化性质；使用SMART网络工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行MnTGF-β蛋白的结构域预测；使用PSIPRED v3.3(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和PHD(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_phd.html)预测MnTGF-β蛋白二级结构；采用同源建模法，利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)预测MnTGF-β蛋白的三级结构，然后使用Swiss-Pdb Viewer4.1软件进行可视化图形分析；使用MEGA 7.0和Genedoc 2.6软件进行TGF-β多重序列比对，在此基础上，使用MEGA7.0软件构建基于邻接法(Neighbor-Joining，NJ)的系统进化树。
1.2.4 qRT-PCR验证基因表达分析采用Trizol法提取各组织的总RNA，检测其RNA的完整性和浓度后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with a gDNA Eraser试剂盒(宝生物公司，大连)去除总RNA中的残余的基因组DNA，并反转录合成cDNA(反应体积及条件参照说明书进行)。为了减小实验误差，分别将3个平行样的RNA反转成cDNA，所有cDNA稀释10倍存于-20℃备用。
使用Applied Biosystems 7500(Life technologies，美国)进行qRT-PCR以分析MnTGF-β基因的表达情况。选取18s基因为内参基因[26]，在qRT-PCR分析中使用的引物列于表 2中。为避免实验误差，每组设置3个平行(n=3)。在总体积20 μL的体系中包括2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Green Master mix，0.4 μL ROX Reference Ⅱ，6 μL ddH2O和0.8 μL上、下游引物(10 μmol/L)。反应程序为：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt方法进行分析[27]，其公式为：
实验所得数据用平均值±标准差(x±s)表示，使用Excel2010以及Origin8.5软件进行整理及图表绘制，采用SPSS21.0软件对实验数据进行统计学分析，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)对实验结果进行显著性分析，差异显著性水平设置为P < 0.05，差异极显著水平设置为P < 0.01。
2 结果 2.1 MnTGF-β基因全长cDNA序列及分析利用RACE技术首次获得光棘球海胆的TGF-β基因的cDNA序列(GenBank登录号：MH178665)全长2 299 bp，开放阅读框长度为1 290 bp，编码430个氨基酸；5’非编码区(5’untranslated regions，5’UTR)长度为745 bp，3’非编码区(3’untranslated regions，3’UTR)长度为261 bp，并含有一个典型的不稳定因素结构ATTTA；起始密码子(ATG)位于序列的第746 bp处，终止密码子(TAG)位于序列的第2 036 bp处；经生物信息分析发现，MnTGF-β蛋白的理论分子量为48.31 kD，理论等电点为5.84，一个典型的TGF-β超家族结构域位于MnTGF-β蛋白的Ser318-Ser430区域(图 1)。二级结构预测结果显示，MnTGF-β蛋白共包含16.28%的α-螺旋(helix)、26.74%的延伸链(strand)和56.98%的无规则卷曲(coil)(图 2)；以已知三维结构的人的TGF-β1(Swiss-model模板号：5vqf.2.A)为模板，进行同源建模预测得到MnTGF-β的氨基酸序列与人TGF-β1氨基酸序列的一致性为33.62%，两者均具有“半胱氨酸结(Cysteine knot)”结构(图 3)。
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| 图 1 MnTGF-β基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 方框中的字母为起始密码子(ATG)；星号(*)表示终止密码子；虚线部分为信号肽；下划线部分为MnTGF-β的前肽；阴影表示成熟肽起始位点(RRRR)；粗体部分部分为MnTGF-β结构域；3’UTR中的不稳定因素(ATTTA)以斜体显示 |
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| 图 2 MnTGF-β蛋白的TGF-β超家族结构域和二级结构 黑线(C)、黄色箭头(E)和粉红色圆筒(H)分别代表无规则卷曲、延伸链和α螺旋 |
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| 图 3 光棘球海胆MnTGF-β蛋白的三维结构预测 A：人TGF-β1蛋白的三维结构(Swiss-model模板号：5vqf.2.A)；B：光棘球海胆MnTGF-β蛋白的三维结构；绿色框中的是TGF-β成熟肽中的半胱氨酸(Cys)残基；红色框中是整合素结合位点 |
多重序列比对结果(图 4)显示，MnTGF-β蛋白与紫球海胆(S. purpuratus)TGF-β2蛋白序列(NCBI登录号：XP_793246.2)的同源性最高，达到97.69%；与仿刺参(Apostichopus japonicas)TGF-β2(NCBI登录号：PIK61515.1)、大海马(Hippocampus kuda)TGF-β1(NCBI登录号：ADK92394.1)、斑马鱼(Danio rerio)TGF-β1(NCBI登录号：NP_8782-93.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)TGF-β1(NCBI登录号：NP_001081330.1)、小鼠(Mus musculus)TGF-β1(NCBI登录号：NP_035707.1)的同源性为21.20%和人(Homo sapiens)TGF-β1(NCBI登录号：AAP36538.1)的同源性为30%。
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| 图 4 光棘球海胆与其他7种生物TGF-β蛋白序列的多重比对 方框：RGD整合素结合位点和RRRR切割位点；红色标注：MnTGF-β成熟肽中保守的9个半胱氨酸残基 |
由图 5可以看出，利用MEGA7.0软件的邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建的系统进化树中显示，11种生物的TGF-β的3个亚型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)(表 3)各自聚为一支。其中，光棘球海胆(M. nudus)的MnTGF-β氨基酸序列与紫球海胆(S. purpuratus)的TGF-β2和仿刺参(A. japonicas)的TGF-β2聚为一支，其与紫球海胆TGF-β2的氨基酸序列亲缘关系最近。
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| 图 5 11种生物TGF-β蛋白的系统进化分析 用三角形标记MnTGF-β；树节点上的数字表示1 000次重复之后的百分比 |
如图 6所示，MnTGF-β基因在光棘球海胆性腺(Gonad)、体腔液(Coelomic fluid)、肠(Intestines)、围口膜(Peritomial membrane)和管足(Tube foot)5种组织中均有表达，且呈现一定的组织特异性。MnTGF-β基因在检测组织中的相对表达量从高到低依次为：管足>围口膜>肠>体腔液>性腺。统计学分析结果显示，MnTGF-β基因在光棘球海胆管足组织中的相对表达量最高且极显著高于在性腺、体腔液、肠和围口膜4种组织中(P < 0.01)，而MnTGF-β基因在光棘球海胆性腺、体腔液和肠中的相对表达量并无显著差异。值得注意的是，MnTGF-β基因在光棘球海胆性腺组织中的相对表达量最低，分别为管足的1.14%和围口膜的1.53%。
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| 图 6 MnTGF-β基因在光棘球海胆不同组织中的相对表达情况 误差线上的不同字母表示组间差异显著(P < 0.05) |
性腺不仅是海胆的繁殖器官更是最重要的经济产品，肠是海胆的主要消化器官，管足是海胆的运动及触觉器官，为进一步明确MnTGF-β基因在成体海胆应答海水酸化胁迫中的表达规律及生物学功能，本研究以光棘球海胆的性腺、肠和管足组织为对象，探究不同海水酸化条件下成体光棘球海胆MnTGF-β基因的表达变化情况。
如图 7所示，酸化胁迫1 d后，OA1组光棘球海胆性腺组织中MnTGF-β基因的相对表达量相较于自然海水组(control)略有升高，但不具有显著性差异；OA2组光棘球海胆性腺组织中MnTGF-β基因的相对表达量与自然海水组相比则呈极显著降低趋势(P < 0.01)；OA3组性腺组织的MnTGF-β基因的相对表达量虽略高于OA2组，但是与自然海水组相比仍然呈现显著性差异(P < 0.05)；酸化胁迫4 d后，相较于自然海水组而言，OA1、OA2和OA3组光棘球海胆性腺组织中MnTGF-β基因的相对表达量均呈现极显著下调趋势(P < 0.01)；酸化胁迫7 d后，OA1组光棘球海胆性腺组织中MnTGF-β基因相较于自然海水组呈现极显著上调趋势(P < 0.01)，而OA2组和OA3组光棘球海胆性腺组织中MnTGF-β基因的相对表达量与自然海水组相比均无显著性差异。
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| 图 7 不同酸化条件下MnTGF-β在光棘球海胆性腺组织中的相对表达情况 Control：自然海水组；OA1：△pH = -0.3；OA2：△pH = -0.4；OA3：△pH = -0.5；*P < 0.05表示与自然海水组相比差异显著；**P < 0.01表示与自然海水组相比差异极显著，下同 |
由图 8可以看出，与自然海水组相比，酸化胁迫1 d和4 d时，OA1、OA2和OA3组光棘球海胆肠组织中MnTGF-β基因的相对表达量均极显著下调(P < 0.01)。而酸化胁迫7 d时，OA1组光棘球海胆肠组织中MnTGF-β基因的相对表达量与自然海水组相比呈现显著上调趋势(P < 0.05)，OA2和OA3组光棘球海胆肠组织中MnTGF-β基因与自然海水组相比依然呈现极显著下调趋势(P < 0.01)。
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| 图 8 不同酸化条件下MnTGF-β在光棘球海胆肠组织中的相对表达情况 |
图 9结果显示，酸化胁迫1 d后，OA1、OA2和OA3组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量与自然海水组相比呈上调趋势，且OA1和OA3组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量极显著高于自然海水组(P < 0.01)；酸化胁迫4 d后，光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量呈现随海水pH降低而逐渐降低的趋势，其中，OA1组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量极显著高于自然海水组(P < 0.01)；OA3组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量显著低于自然海水组(P < 0.05)；酸化胁迫7 d后，OA1和OA2组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量均极显著高于自然海水组(P < 0.01)，而OA3组光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量与自然海水组相比，则不具有显著性差异。
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| 图 9 不同酸化条件下MnTGF-β在光棘球海胆管足组织中的相对表达情况 |
本实验利用同源克隆和RACE技术首次获得光棘球海胆的TGF-β基因全长cDNA序列，经生物信息分析得知，该序列编码430个氨基酸，与紫球海胆(S. purpuratus)SpTGF-β2的同源性较高，达到97.69%，但相比SpTGF-β2氨基酸序列少了2个氨基酸，这一结果提示，MnTGF-β和SpTGF-β2在蛋白质二级结构上可能会有所不同。值得注意的是，MnTGF-β氨基酸序列与同为棘皮动物的仿刺参(A. japonicus)AjTGF-β2的同源性仅为24.88%，分析其原因可能是在分子进化过程中，光棘球海胆的MnTGF-β和仿刺参的AjTGF-β2分别起源于TGF-β家族的不同亚基。二级结构分析显示，与紫海胆SpTGF-β2的二级结构相比，两者均具有超过50%的无规则卷曲(coil)，其中，MnTGF-β蛋白的二级结构的中α-螺旋(helix)含量较少而延伸链(strand)的含量较高，这可能是由于MnTGF-β相较于SpTGF-β2的氨基酸序列少了2个氨基酸造成的。同源建模预测MnTGF-β蛋白三维结构发现，与人的TGF-β1蛋白相比，MnTGF-β蛋白的C末端也具有半胱氨酸组成的典型的“半胱氨酸结(Cysteine knot)”结构。在光棘球海胆的“半胱氨酸结”结构中，8个半胱氨酸以成对的方式形成分子中心区的4对链内二硫键，结合第9个半胱氨酸形成链间二硫键一起形成TGF-β二聚体，提示，光棘球海胆的MnTGF-β可能与大海马的TGF-β1起源于同一祖先[28]。多重序列比对结果显示，8种生物的TGF-β超家族结构域具有高度的保守性，均具有特征性标志成熟肽起始的KEX-Furin样蛋白酶识别位点(RKRR)[29-30]和整合素结合位点(RGD)[31]。值得注意的是，光棘球海胆中的KEX-Furin样蛋白酶识别位点由RRRR取代了RKRR(粗体为差异氨基酸)。系统进化分析显示，光棘球海胆与紫球海胆(S. purpuratus)聚为最近的一支，说明海胆的TGF-β在进化过程中高度保守，这一关系也符合光棘球海胆的进化和分类地位。
本实验采用实时荧光定量PCR技术，选取光棘球海胆性腺、体腔液、肠、围口膜和管足等5个组织，测定了MnTGF-β基因在各组织中的相对表达量。实验结果表明，MnTGF-β基因在光棘球海胆管足组织中的相对表达量最高；其次为围口膜、肠和体腔液，而在性腺组织中的相对表达量最低，这说明光棘球海胆MnTGF-β基因的相对表达具有鲜明的组织特异性(P < 0.01)。
有研究显示，海水酸化不仅对海洋生物的早期发育有显著影响，而且对海洋生物成体的生理生化过程也具有深刻而复杂的影响。本研究结果显示，与自然海水组相比，在不同海水酸化胁迫下，光棘球海胆性腺、肠和管足这3种重要器官中MnTGF-β基因的相对表达变化规律各不相同，说明海胆的TGF-β基因在应答海水酸化胁迫时具有一定的组织特异性。Dupont等[32]报道，海水酸化胁迫绿海胆(Strongylocentrotus droebachiensis)4个月后，通过计算产卵数量发现，与对照组相比，酸化处理组的绿海胆的繁殖力降低了4.5倍，提示海水酸化对绿海胆性腺的发育和成熟具有负面效应。Kurihara等[33]对马粪海胆(H. pulcherrimus)酸化胁迫9个月后发现，海水酸化可延迟马粪海胆的性腺发育。本研究发现，与自然海水组相比，海水酸化胁迫4 d时，各海水酸化胁迫组光棘球海胆性腺中MnTGF-β基因的相对表达均受到显著抑制，而海水酸化胁迫7 d时，各海水酸化胁迫组光棘球海胆性腺中MnTGF-β基因的相对表达量略有回升，其中，OA1组光棘球海胆性腺中MnTGF-β基因的相对表达量极显著高于自然海水组(P < 0.01)。分析这一结果产生的原因是：本研究取样正值光棘球海胆繁殖前期，其性腺发育相关基因正处于活跃状态，与性腺发育密切相关的MnTGF-β基因对不同海水酸化条件的响应结果提示，急性海水酸化胁迫可能会抑制光棘球海胆的性腺发育。但是，随着酸化胁迫时间的增长，光棘球海胆可能通过显著地上调表达MnTGF-β基因来补偿海水酸化对性腺发育的延滞作用，使得光棘球海胆的性腺得以正常发育，然而更为深入的机制仍需进一步的研究和探索。Heuer等[34]研究表明，酸化环境会诱发海湾蟾蜍鱼(Opsanus beta)发生酸中毒，由于对酸中毒的补偿作用，引起了肠道阴离子交换的增加，对肠组织造成更大的损伤。Hu等[35]研究发现大西洋鳕鱼(Gadus morhua)在二氧化碳较高水平的环境下，其肠组织上皮中的大多数阴离子转运蛋白表达上调，表明海水酸化可增加大西洋鳕鱼肠组织阴离子的分泌速率进而对其肠组织造成损伤。本研究发现，与自然海水组相比，当海水pH降低0.3个单位时，光棘球海胆肠组织MnTGF-β基因的相对表达量随着酸化时间延长呈现极显著降低而后显著升高的趋势，且在酸化胁迫的第7天显著高于自然海水组(P < 0.05)；当海水pH降低0.4和0.5个单位时，光棘球海胆肠组织MnTGF-β基因的相对表达量均极显著低于自然海水组(P < 0.01)。Monteleone等[36]在人类肠炎病(Inflammatory bowel diseases，IBD)的研究中指出，TGF-β是一种具有能够提高黏膜修复能力的上皮细胞因子，在机体损伤后能促进上皮黏膜的修复。推断本研究结果中，不同酸化条件下光棘球海胆MnTGF-β基因在其肠道中的不同表达趋势，可能是由于海水酸化破坏了光棘球海胆的肠道黏膜，MnTGF-β基因可能参与光棘球海胆肠道黏膜修复等过程。当海水酸化程度较轻时(△pH≥-0.3)，光棘球海胆可通过上调肠组织中MnTGF-β基因的相对表达进行适应和修复；而当海水酸化程度不断加深时(△pH≤-0.4)、肠组织中MnTGF-β基因的相对表达受到严重抑制。而对于海水酸化造成的肠组织损伤，光棘球海胆可能通过其他途径进行修复，但其具体的机制仍需进一步深入研究。管足不仅是海胆的感觉、运动和依附器官，也是海胆感知外界环境变化或刺激并作出快速反应的重要防御器官[37]。目前，尚未有研究报道海胆管足中TGF-β基因在应对环境胁迫过程中的作用。本研究结果显示，海水酸化胁迫下，光棘球海胆管足中MnTGF-β基因的相对表达量随着酸化时间的延长呈现先降低后升高的趋势。而当海水pH降低0.3和0.4个单位时，在光棘球海胆管足中的MnTGF-β基因则在酸化胁迫的第7天出现极显著的上调表达(P < 0.01)。推测，在酸化胁迫下，管足通过提高其TGF-β基因的相对表达量以响应外界环境的变化或刺激，进而发挥防御作用。
4 结论本实验首次获得光棘球海胆的TGF-β基因全长cDNA序列，并对其序列特征进行了较为全面的生物信息学分析。结果发现，光棘球海胆MnTGF-β与紫球海胆SpTGF-β2的亲缘关系最近，与仿刺参AjTGF-β2可能起源于TGF-β家族的不同亚基。基因表达谱检测发现，光棘球海胆MnTGF-β基因的相对表达具有鲜明的组织特异性。不同海水酸化胁迫条件下，光棘球海胆不同组织中MnTGF-β基因的表达变化规律各不相同，呈现一定的组织特异性，说明光棘球海胆MnTGF-β基因在光棘球海胆响应海水酸化中发挥重要作用，但其具体机制仍需进一步的研究和探索。
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