2. 四川农业大学农学院，成都 611130
2. College of Agronomy, Sichuan Agriculture University, Chengdu 611130
植物在非生物胁迫和生物胁迫下会导致细胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）过量的积累，过量的ROS积累会非特异性的损害细胞组分，包括细胞核、核酸、蛋白质以及光合色素等，在生物体内抗氧化酶可以清除活性氧，维持细胞内ROS平衡，在抗氧化物酶中POD起着关键的作用[1]。在植物中广泛存在过氧化物酶，且具有多种功能[2]。过氧化物酶是多基因家族酶类，参与植物多种代谢途径，如植物的抗旱、抗盐、抗寒等多种抗逆功能[3-5]。烟草是中国非常重要的经济作物，烟草的产量与品质受到盐碱、冷害以及干旱等非生物胁迫的影响，因此在分子水平上研究POD对提高烟草非生物胁迫耐逆性具有重要意义。
POD是广泛存在于植物中的氧化还原酶，在植物生长发育和应激反应中发挥着重要的作用，是植物重要的保护酶类，最常见的是第Ⅲ类分泌过氧化物酶（Secretory peroxidase，POD），其功能是催化去除H2O2，参与木质部合成和降解、还原剂氧化和植物形态的形成，并参与环境胁迫相应[6-9]。目前，研究表明，POD家族基因与植物生长发育有关，如植物木质素聚合、栓化作用、细胞壁结构蛋白的交联等[10-11]。在许多植物中POD的作用都有过报道，而最主要的作用是利用H2O2为底物来参加各种还原物质的氧化。ROS是植物在胁迫刺激下产生的，并被POD还原为H2O和O2，因此POD是植物非生物胁迫下清除ROS的关键酶。Sierla等[12]研究表明，在植物胁迫下，POD活性增加，且参与了胁迫途径调控。Kumar等[13]和Neill等[14]研究表明，植物中的ROS可以被POD部分清除。目前，植物中POD基因研究取得了很大进展，在山楂、水稻、小麦等多种植物中成功克隆POD家族基因[15-17]。但植物中POD与ROS具体作用机制仍不明确。
本研究成功克隆到过氧化物酶家族基因NtPOD2，预测NtPOD2编码蛋白结构与功能，同时运用荧光定量测定NtPOD2在烟草各个组织中表达水平，以及在非生物胁迫处理下的表达模式，为进一步研究POD基因在烟草中与ROS作用机制提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料挑选饱满均一的普通烟草（K326）种子，消毒（75%乙醇和20%NaClO），反复用无菌水清洗，播种于MS培养基培养2周，取大小均匀的幼苗进行ABA、H2O2、干旱、低温、低钾及高盐胁迫处理，每项处理设置3次重复，分别在0、3、6、12和24 h共5个时间点整株取样。ABA与H2O2非生物胁迫具体处理方法参照张雪薇等[18]。
1.2 方法 1.2.1 NtPOD2的克隆用Primer 5.0软件设计NtPOD2引物NtPOD2-F和NtPOD2-R（表 1）。以烟草叶片为材料，提取RNA，按照反转录试剂盒步骤进行反转录合成cDNA，将cDNA稀释10倍进行PCR扩增，PCR反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，将其与pMD19-T载体连接，转化，在含有Kn的LB固体培养基进行涂板，过夜培养后，挑取3个单克隆菌落进行测序。
参照王静等[19]方法进行NtPOD2的生物信息学分析。
1.2.3 烟草NtPOD2的表达分析采用Primer 5.0设计荧光定量引物，烟草18SrRNA为内参，引物序列为18S-F和18S-R（表 1）。每个样品重复4次，结果分析参考王静等[19]方法。
1.2.4 构建过表达载体重组克隆载体NtPOD2-pMD19-T与表达载体pBI121酶切反应，NtPOD2-pMD19-T进行37℃双酶切，酶切体系为10×T Buffer、1 µL；XbaⅠ 0.5 µL、SmaⅠ 0.5 µL、载体3 µL和ddH2O 5 µL。酶切过后产物与pBI121载体16℃连接过夜，连接后产物转化DH5α大肠杆菌感受态，在涂有Kn的LB培养基平板式上筛选，挑取单克隆菌株摇菌并送去测序公司进行测序，检测是否构建成功。
2 结果 2.1 NtPOD2的克隆以烟草叶片cDNA为模板进行PCR扩增，获得一条大小为750-1 000 bp条带。经回收和测序，片段大小为897 bp（图 1）。
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| M：DL Marker 2 000 bp；1：NtPOD2 图 1 NtPOD2的克隆 |
通过对NtPOD2-pMD19-T质粒进行双酶切和测序，结果一致，目的片段大小为897 bp（图 2）。
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| M：DL Marker 2 000 bp；1：NtPOD2 图 2 NtPOD2-pBI121重组质粒酶切 |
对NtPOD2蛋白进行生物学分析，理化性质分析结果表明，NtPOD2蛋白分子量为32.55 kD，等电点为5.78，不稳定系数为37.72。疏水性分析结果显示该蛋白属于亲水性蛋白（图 3）。NCBI在线分析NtPOD2蛋白保守功能域（图 4），该蛋白属于ClassⅢ型分泌性过氧化物酶。采用SMART和Scan Prosite分析NtPOD2蛋白理化性质，结果为NtPOD2蛋白含有6个蛋白激酶C磷酸化位点（67-69 SeK；70-72 TaR；77-79 SaR；183-185 TfR；200-202 SqR；235-237 SkK）、1个N-糖基化位点（75-78 NNSA）、5个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点（89-92 SevD；101-104 ScaD；183-186 TfrD；192-195 TniD；209-212 SggD）、1个氨基化位点（126-129 lGRR）、1个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点（128-131 RRdS）。NtPOD2蛋白信号肽预测结果显示，NtPOD2蛋白不存在信号肽，定位在细胞质中的概率最大（0.65）。二级结构分析表明，NtPOD蛋白二级结构的最大元件为α-螺旋，最小元件为β-转角（图 5-A）。三级结构分析结果表明，6个半胱氨酸残基48-53、102-294和181-206分别形成3个保守的二硫键桥（图 5-B）。
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| 图 3 疏水性分析 |
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| 图 4 保守结构域分析 |
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| A：二级结构；B：三级结构 图 5 NtPOD2编码蛋白的结构预测 |
把NtPOD2编码氨基酸序列与绒毛状烟草、美花烟草、番茄、马铃薯以及胡杨POD2通过Dnaman多重序列比对（图 6-A），发现NtPOD2蛋白具有POD家族典型的结构特征，在N端都包含peroxidase活性位点GAslLRLhFHDC。把NtPOD2编码氨基酸序列通过Blast比对，选择不同物种POD2氨基酸序列下载，通过MEGA5构建系统进化树（图 6-B），结果表明，NtPOD2蛋白序列与绒毛状烟草POD2以及美花叶烟草POD2蛋白序列有较高同源性，分别为99%和94.65%。
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| A：NtPOD2蛋白多重序列比对；B：NtPOD2蛋白系统进化树 图 6 NtPOD2同源性分析 |
采用qRT-PCR对烟草K326各个组织进行表达分析，发现NtPOD2在根、茎、叶、花中均有表达，在根中表达量明显高于茎、叶、花（图 7-A）。
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| A：NtPOD2组织表达分析；B：ABA胁迫下NtPOD2相对表达量；C：H2O2胁迫下NtPOD2相对表达量 图 7 NtPOD2的不同组织及信号分子处理下的表达模式 |
烟草K326幼苗上在培养皿上用ABA和H2O2处理，对处理后烟草幼苗NtPOD2表达分析表明，在12 h之前，ABA处理下NtPOD2的表达受到抑制，24 h时受到显著诱导，为对照的3.14倍（图 7-B）；H2O2处理的早期，NtPOD2的表达受到强烈诱导，12 h时上升至最大，为对照的120.67倍（图 7-C）。以上结果表明NtPOD2能够响应逆境胁迫相关的信号分子调控。
2.7 NtPOD2在逆境胁迫下表达分析PEG和低温处理后，该基因分别在12 h和6 h时达到最大值，分别为对照的2.48倍（图 8-A）、8.60倍（图 8-B）。低钾处理下，NtPOD2表达量上升，NaCl处理下该基因下调（图 8-C-D）。结果表明，NtPOD2可能参与了PEG、低温等非生物胁迫。
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| A：PEG胁迫下NtPOD2相对表达量；B：低温胁迫下NtPOD2相对表达量；C：低钾胁迫下NtPOD2相对表达量；D：盐胁迫下NtPOD2相对表达量 图 8 NtPOD2在非生物逆境胁迫下的表达模式 |
生物信息学分析表明，NtPOD2蛋白含有3个二硫键，属于分泌蛋白，含有活性位点（GAslLRLhFHDC），属于典型的ClassⅢ型分泌性过氧化物酶。信号肽预测显示NtPOD2蛋白定位在细胞质中，因此该基因可能在内质网加工成熟，进而通过高尔基体运输到细胞质。该蛋白与其他物种ClassⅢ型分泌性过氧化物酶相比含有相似的保守结构域（6A）以及二硫键桥[20]。该蛋白含有最大元件为α-螺旋，最小元件为β-转角。NtPOD2蛋白以Asp47、Val50、Gly52、Asp54和Ser56为中心的Ca2+结合位点构成远端的氧供体结构域，而Thr175、Asp219、Thr221和Asp226为中心的Ca2+结合位点构成近端的氧供体结构域，位于这两个结构域中间的血红素则由Fe2+与His46和His174形成共价键，构成活性中心。蛋白质空间结构影响其功能，NtPOD2蛋白特定的空间结构为其发挥功能奠定了基础。同源性分析表明，NtPOD2蛋白与其他植物POD蛋白含有较高同源性，其中与美花烟草POD2同源性为99%，可能与美花烟草POD2是POD家族的同一成员。通过对NtPOD2生物学分析，旨在为研究POD基因家族奠定基础。
烟草Ntpx在花中表达量最高，银杏GbPOD1和小桐子JcPOD73茎中表达量最高[21-22]。郭媖等[23]从陆地棉中克隆的GhPOD1和GhPOD2，两者相似性达99%，但表达模式相差很大。作为多基因家族的POD基因，具有功能多样性的特点。本研究表明NtPOD2在组织中都有表达，但根中表达最高，而茎、叶、花表达量相对较少，不同植物中POD基因在不同部位表达模式不同，说明POD家族基因表达存在特异性。NtPOD2在ABA处理下，表达量在3 h先下降，20 h又上升至最大，约为对照的3.14倍（图 5-B），说明NtPOD2受ABA诱导。Gao等[1]研究表明柽柳ThPODs参与非生物胁迫反应（PEG、ABA、NaCl等），并依赖ABA信号转导途径。钟新榕等[24]用不同浓度的ABA处理黄瓜幼苗，POD活性在短时间内可以提高。Anderberg等[25]研究结果表明低温胁迫、盐胁迫以及干旱胁迫下，能较短时间内增加植物体内ABA含量，进而诱导ABA调控相关基因的表达。司丛丛等[26]研究表明，烟草Ntpx在5% PEG6000胁迫下，Ntpx在最初无明显变化，在6 h后表达量上调在ABA和干旱胁迫下，表达量上调。本研究采用10 mmol/L H2O2处理烟草幼苗，NtPOD2的表达受到强烈诱导，12 h时上升至最大，为对照的120.67倍。苏亚春等[27]用100 μmol/L ABA处理甘蔗，结果表明，ScPOD02表达量在3 h显著增加，500 mmol/L H2O2处理下随着时间的延长，ScPOD02表达量基本不变。而这与苏亚春等在ABA、H2O2处理甘蔗后，ScPOD02表达模式不同，这可能是不同的浓度ABA、H2O2造成的。由此说明NtPOD2可能受干旱、ABA、NaCl、H2O2胁迫诱导，并依赖ABA信号转导途径进而参加植物生长发育。
在200 mmol/L NaCl处理下NtPOD2表达量呈现先下降后上升又下降的表达模式，在12 h表达量达到最大，约为对照1.12倍。苏亚春等[27]用250 mmol/L的NaCL处理下ScPOD02表达量先在6 h下降，而在12 h表达量又上升，约为对照的1.91倍。与苏亚春用NaCl处理甘蔗后ScPOD02表达模式一致，在6 h前表达量下降，在12 h时表达量上升为最大，之后又下降。程华等[21]用200 mmol/L NaCl喷洒银杏幼苗后，POD1表达量降低。Bae等[11]用200 mmol/L NaCl处理白杨后PoPOD1基因表达水平下调。低钾胁迫下，NtPOD2受到强烈诱导，NtPOD2表达量上调。王伟等[28]研究表明，大豆在低钾胁迫下，细胞内氧负离子O2-增加，超氧化物歧化酶催化O2-发生歧化反应生成H2O2-含量增加，进而引起过氧化物酶活性上升。在低温胁迫下，NtPOD2在6 h表达量达到最大，在12 h后又降低。Guo等[29]在4℃条件下处理柽柳叶和根，叶中ThPOD1表达量在6 h强烈诱导后又逐渐下降，根ThPOD1 6 h强烈诱导后在24 h达最大值后又下降。外源基因的表达增加宿主细胞的耐受性，植物受到生物胁迫以及非生物胁迫下，可以引起活性氧产生，进而破坏细胞稳态以及防御机制[30-31]。由此说明烟草NtPOD2，在不同胁迫下表达模式发生改变，以上均说明该基因在生物胁迫以及非生物胁迫中发挥着重要作用，由此推测，NtPOD2参与生物胁迫与非生物胁迫，可能引起活性氧的改变，进而参与植物生理调控与防御机制。
4 结论NtPOD2可能通过ABA信号通路来参与生物胁迫以及非生物胁迫。
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