马铃薯S病毒（Potato virus S，PVS）也称为马铃薯潜隐病毒，该病毒主要通过接触和蚜虫带毒传播，感染此病毒可使马铃薯质量和产量严重降低。该病毒分布范围十分广泛，在所有马铃薯种植区都发生。PVS单独侵染马铃薯，产生的症状较轻微，甚至不表现出症状，产量降低10%-20%[1]。在田间PVS常与其他病毒混合侵染，造成严重危害[2]。目前，对PVS病的防治，主要是通过筛选种植抗病品种，利用茎尖脱毒方法进行脱毒苗的繁育，生产脱毒种薯等。PVS的脱毒很困难，因此通过病毒检测技术，对种薯PVS进行快速、灵敏检测对生产高质量种薯是十分必要的。传统的检测方法包括电子显微镜、DAS-ELISA和PCR等[3-5]，但此类方法在生产应用中存在一定的局限性[6]。胶体金免疫层析技术（Goldimmunochromatography assay，GICA）是利用免疫层析原理，将胶体金标记、免疫检测、层析分析、单（多）克隆抗体和新材料等结合在一起的技术，具有操作简便、快速、结果准确、无须专业技术人员与特殊设备等优点[7]，在医学、动植物检疫、食品安全监督等领域得到广泛应用[8-11]。在马铃薯上，魏梅生等已研制出马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒胶体金检测试纸条[12]。但关于PVS快速检测试纸条的研究未见报道，本研究制备具有使用简便、反应灵敏等特点的PVS检测试纸条，以适应基层工作的实际需求。
1 材料与方法 1.1 材料PVS，马铃薯X病毒（Potato X virus，PVX）、马铃薯Y病毒（Potato Y virus，PVY）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），马铃薯M病毒（Potato M virus，PVM），马铃薯A病毒（Potato A virus，PVA）毒原均为本实验室保存。田间供试马铃薯品种为“克新13号”。
PVS羊源多克隆抗体购买于美国Agida公司。兔抗羊抗体购北京百奥莱博科技有限公司，氯金酸购自天津市光复精细化工研究所。柠檬酸三钠、牛血清白蛋白购自哈尔滨欣科瑞有限公司。硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC膜）、玻璃纤维膜、样品垫、吸水纸、支持板、三维大平面点膜喷金仪、裁条机、微电脑自动斩切机均购自上海金标生物科技有限公司。DAS-ELISA检测试剂盒购买于美国Agida公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 胶体金的制备、鉴定采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金。取297 mL ddH2O于圆底烧瓶中，加入3 mL 1% HAuCl4·4H2O混匀。将圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌加热至沸腾，迅速一次性加入3 mL 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，观察颜色变化。由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当完全转变成红色时，继续煮沸5 min后停止加热，补水至原体积。将烧制的胶体金溶液用蛋白核酸分析仪（Gene Spec V，日本日立）进行全波长扫描鉴定，并置于透射电镜（H7650，日本日立）下观察，拍照。
1.2.2 免疫胶体金试纸条制备工艺优化 1.2.2.1 金标垫主要对金标抗体的标记量，反应pH值，封闭时间、离心时间、复溶液使用量等进行优化。取6支干净的1.5 mL离心管，分别加入1 mL胶体金，然后分别加入5 µL 1 mg/mL PVS抗体，再加入1 µL、2 µL、3 µL、4 µL、5 µL、6 µL 0.2 mol/L K2CO3 调节pH，混匀后室温静置反应30 min，观察颜色变化。根据颜色和沉淀量判定免疫胶体金标记抗体的最适pH。另取8支干净的1.5 mL离心管，分别加入1 mL胶体金，然后分别加入1 µL、2 µL、3 µL、4 µL、5 µL、6 µL、7 µL、8 µL 1 mg/mL PVS抗体，再加入2 µL 0.2 mol/L K2CO3 调节pH，混匀后室温静置反应30 min，观察颜色变化。根据颜色和沉淀量判定免疫胶体金标记抗体的最适抗体量。标记了胶体金后的抗体加入10% BSA 100 µL设置不同时间，分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行封闭，选择不同离心时间，分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行离心，留沉淀弃上清，用复溶液复溶沉淀至合适的比例，用喷金仪器设置不同的喷金量，分别为5 µL/cm、6 µL/cm、7 µL/cm、8 µL/cm、9 µL/cm、10 µL/cm喷在玻璃纤维纸上，制作金标垫。
1.2.2.2 检测线和质控线将PVS抗体用超滤管（Millipore，10 kD）浓缩至1.0 mg/mL，将硝酸纤维素膜（NC膜）固定贴合于支持板上，使用三维平面点膜喷金仪，T线划膜量设置为0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL将抗体划线于NC膜上，作为检测线（Testline，T线）。用0.02 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）将羊抗兔抗体稀释至1.0 mg/mL，C线划膜量设置为0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL分别划线于NC膜上，作为质控线（Contro-lline，C线），37℃烘干4 h以上。
1.2.3 试纸条的组装将样品垫，金标垫，吸水纸组装到附有NC膜的支持板上，然后用切条机切割成3.5 mm宽的试纸条。
1.2.4 试纸条的检测方法与结果判读将带有胶体金复合物的一端插入检测样品液中，2 min左右判断结果。若试纸条仅C线出现紫红色线而T线未显色，结果为阴性；若试纸条上C线和T线均出现紫红色，结果为阳性；若试纸条C线和T线都没有显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。
1.2.5 试纸条的质量检测 1.2.5.1 特异性测试分别将PVS、PVX、PVY、PLRV、PVM和PVA阳性材料用2 mL的PBS缓冲液混匀，制成样品检测液，将制备好的试纸条置于样品中检测，每种病毒重复检测3次。
1.2.5.2 灵敏度测试取PVS阳性样品进行倍比稀释获得10、102、103、104和105倍的样品稀释液，分别用试纸条进行灵敏度检测。
1.2.5.3 马铃薯样品检测从田间采集马铃薯叶片54份，按1:10（W/V）加入PBS缓冲液研磨成浆，为检测样品。首先采用试纸条检测，再通过DAS-ELISA，按照试剂盒使用说明书进行检测，若样品孔显现黄色，结果为阳性，若样品孔呈现无色透明，结果为阴性。将两种检测结果进行对比分析。
1.2.5.4 稳定性测试将试纸条放在有干燥剂的铝箔袋中，密封保存在4℃冰箱中；密封保存在室温下；敞开保存在室温下；分别设置不同保存时间，检测试纸条有效性。
2 结果 2.1 胶体金颗粒制备好的胶体金在紫外波长524 nm处有最大吸收峰，其金颗粒分布均匀，形状为球形或椭球形，直径大小20-30 nm（图 1）。
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| A：胶体金的紫外吸光谱；B：透射电子显微镜下胶体金颗粒。Bar=200 nm 图 1 胶体金形态 |
经过试验，制备金标抗体的最佳反应条件为加入0.2 mol/L K2CO3 4 µL调节PH，PVS抗体加入量为4 µL，封闭时间为30 min，离心时间30 min，100 µL复溶液复溶沉淀。胶体金标记抗体喷涂量为6 µL/cm，T线PVS抗体浓度为1.0 mg/mL，C线羊抗兔抗体浓度为1.0 mg/mL，T线与C线划膜量均为0.8 µL/cm。
2.3 试纸条特异性试纸条对PVS阳性样品的检测结果为阳性，对PVX、PVY、PLRV、PVM和PVA的阳性样品的检测结果为阴性，说明本试纸条具有非常好的特异性（图 2）。
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| 从左至右分别为：PVX、PVY、PLRV、PVM、PVA和PVS 图 2 试纸条对6种病毒的特异性检测 |
试纸条对稀释1、10、102、103、104和105倍的带有PVS的样品进行检测，结果（图 3）发现试纸条可检测出稀释至104倍的PVS汁液。
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| 从左至右分别为：PVS样本汁液（1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5） 图 3 试纸条对带有PVS汁液的马铃薯样本灵敏度检测 |
从田间采集马铃薯叶片54份，经试纸条检测，结果5份为阳性，49份为阴性，再用DAS-ELISA方法确认，两者结果相符（图 4）。
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| A：试纸条检测结果；B：酶联免疫检测结果 图 4 54份田间采集马铃薯样品检测结果 |
将试纸条放在有干燥剂的铝箔袋中密封，放在4℃冰箱中保存，有效期可达180 d，能够保持原来检测的灵敏度；试纸条密封后，室温保存，有效期大于60 d，检测灵敏度有所下降；试纸条在室温下敞开保存，15 d就失去了检测能力。说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性（图 5）。
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| A：新制备的试纸条；B：4℃下密封保存180 d；C：室温下密封保存60 d；D：室温下敞开保存15 d 图 5 试纸条稳定性测试结果 |
随着我国马铃薯主粮化战略的推进，马铃薯的质量与产量问题越来越受到关注与重视，我国是马铃薯生产大国，种植面积和总产量均占世界之首，但是，我国马铃薯单产水平较低。造成马铃薯单产低的一部分原因就是由马铃薯病毒病引起的。种植带有病毒病的马铃薯，种薯逐年就会发生严重退化，使得马铃薯质量差，产量低。为了减少马铃薯种薯的带毒率，对马铃薯种薯进行病毒检测是防病毒的关键环节。在我国，危害马铃薯的主要病毒有6种，其中，PVS是主要病毒之一。目前，对PVS的检测，传统的方法就是DAS-ELISA，RT-PCR方法也逐渐开始通用，但这2种方法均需要在实验室进行，试验过程繁琐，需要专业的技术人员操作完成，检测时间较长，并不适宜大田对PVS病的现场检测与普遍应用。很多马铃薯种植企业和大户不具备实验室检测的条件，建立一种使用简便，反应快速的针对PVS的检测方法，是基层开展对马铃薯PVS病检测的迫切需求。
本试验的目的是建立PVS胶体金免疫层析试纸条检测的方法，通过优化试纸条的制备条件，研制出马铃薯S病毒胶体金免疫层析检测试纸条。经过田间取样测试，本试纸条与DAS-ELISA对PVS的检测结果完全吻合，说明本试纸条准确性较高。已有研究表明检测PVX和PVY的试纸条检测样品的反应时间在10 min之内，低温保存时间大于90 d，室温保存时间大于30 d[12]。本试纸条检测反应快捷，2 min左右就能判断结果，节约了检测时间。低温保存时间超过180 d，室温保存时间可达60 d，试纸条的稳定性显著提高。虽然试纸条在检测灵敏度上，不如RT-PCR方法，但是可以达到对病毒种类的定性筛选，对于田间病害的调查和试验条件差的企业具有良好应用价值。
4 结论该检测方法具有使用简单方便、检测快捷、适用性广、特异性和灵敏度高、稳定性强的特点。作为一种快速筛查的手段，可用于广大基层单位开展马铃薯S病毒的检测，为脱毒种薯的定级、病毒的防控提供技术支持。能够帮助解决种薯质量差、产量低等问题，具有广阔的市场前景。
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