CRISPR/Cas9技术是近年来新出现的一种基因修饰技术，得益于其操作简单、高效率和低成本的优势在基因编辑领域被广泛应用^[1-2]。通过改良的CRISPR技术，已经可以实现基因敲除、基因沉默、基因敲入以及各种目的的基因编辑。CRISPR/Cas9系统元件sgRNA和Cas9蛋白，可以通过不同载体作用于目的基因，无论是质粒、慢病毒或者直接转染sgRNA与Cas9蛋白的混合物，都可以很方便的实现基因编辑^[3]。由于sgRNA的切割活性受到众多因素影响^[4-6]，且CRISPR/Cas9系统允许错配的出现，所以获取高效的sgRNA并验证其切割活性是实现靶向编辑的关键。

脂滴结构蛋白Perilipin蛋白高表达于白色脂肪组织中^[7-8]，主要功能是保护脂滴中的脂质免受脂肪酶的作用，帮助脂质在脂滴中聚集^[9]。围脂滴蛋白(Perilipin1，PLIN1)是一种存在于脂滴表面可被磷酸化的蛋白，其表达量和肥胖成显著正相关，并且在高血压等代谢性疾病的发生发展过程中发挥重要作用^[9-10]。前期研究发现，在基础状态下，PLIN1对脂滴发挥屏障作用，可以有效降低甘油三酯的分解，当其含量降低或者发生磷酸化时，就可以加快甘油三酯的分解，且其基因的表达受到PPARγ的调控，是脂质代谢的一个重要环节，但其具体调节机制尚不清楚。本课题基于CRISPR/Cas9技术，设计了3条理论切割效率最高的sgRNA序列，并对其进行体外切割活性验证和细胞转染基因敲除效率验证。得到了可以高效率切割PLIN1基因的sgRNA序列，并初步探究了PLIN1对脂解的影响，旨为后续PLIN1基因敲除动物模型的建立奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

3T3-L1前脂肪细胞系、FBS(胎牛血清)、DMEN/F12细胞培养基、Western blot相关试剂(武汉BOSTER生物工程公司)，大肠杆菌DH5a感受态细胞、琼脂糖、DNA Marker、细胞基因组DNA提取试剂盒、PCR实验相关试剂(北京天根生化科技有限公司)，限制性内切酶、T4 PNK、Quick Ligase(美国NEB公司)，sgRNA体外转录试剂盒、Cas9体外酶切试剂盒(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)，CRISPR基因敲除表达载体(PX459)(美国Addgene公司)，氨苄青霉素(合肥博美生物科技有限公司)，蛋白Maker(北京聚合美生物科技有限公司)，Perilipin 1抗体(英国Abcam公司)。

1.2 方法 1.2.1 sgRNA的设计与合成

根据NCBI中公布的小鼠PLIN1基因序列，应用在线工具(http://crispr.mit.edu)设计可以识别PLIN1基因2号外显子的gRNA序列。根据脱靶位点、基因数和发生错配的可能性大小进行分析，给出所有序列。选择3条特异性较好的gRNA序列(表 1)作为实验序列。

将T7(TAATACGACTCACTATAGGG)启动子添加到设计好的gRNA序列的5'端，保守序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAG)添加到3'端作为体外转录上游引物，由上海生工公司合成。

1.2.2 Cas9/gRNA表达载体的构建及鉴定

选择CRISPR基因敲除质粒PX459(图 1)作为载体，在gRNA scafflod位置加入目的sgRNA序列。氨苄青霉素抗性基因用于质粒转化与扩增过程的筛选，嘌呤霉素抗性基因用于转染过程的筛选。在3对PLIN1 gRNA的5'端添加黏性末端后，将得到的PLIN1 sgRNA上下游引物配置成100 mmol/L，各取1mL，加入10×T4 ligation Buffer 1 mL，T4 PNK 0.5 mL，定容到10 mL。37℃孵育30 min进行激酶处理，95℃孵育5 min，缓慢降温至25℃。用限制性内切酶BbsI在PX459质粒2个BBS酶切位点(第245、267位置)切割质粒，使其线性化。用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收线性化质粒载体。将sgRNA退火产物与回收的线性化载体用T4连接酶进行连接，连接体系于16℃过夜。构建好的质粒载体转化至DH5a菌群中，2 d后挑取单克隆送至北京微旋基因有限公司进行检测。构建好的3个质粒载体分别命名为sgRNA-PLIN1-1、sgRNA-PLIN1-2、sgRNA-PLIN1-3，并以未构建的PX459质粒作为阴性对照载体。

1.2.3 sgRNA序列的体外切割活性验证 1.2.3.1 PCR体外扩增转录模板

利用3条PLIN1 gRNA特异性体外转录上游模板和gRNA通用下游引物SG-R Primer，将人工合成的通用gRNA模板的DNA片段作为模板，通过PCR特异性扩增PLIN1的体外转录模板。扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用DNA纯化试剂盒进行纯化。

1.2.3.2 sgRNA体外转录

将扩增好的DNA转录模板按表 2顺序依次加入，充分混匀，37℃孵育4 h(可适当延长孵育时间)。转录完成后取少量反应液稀释20倍，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小及完整性。使用RNA纯化试剂盒进行纯化，通过微孔板分光光度计测定转录产物的的浓度和纯度。

1.2.3.3 Cas9体外酶切

构建Cas体外酶切体系，将得到的sgRNA与Cas9蛋白以及PLIN1基因片段(PLIN1-F：5'-GCAGAGGTAGACAGCCCAAG-3'；PLIN1-R：5'-TCCTGCCACTGGTCCTACTC-3')混合孵育。设立阴性对照组(未加sgRNA)，sgRNA-PLIN1-1实验组，sgRNA- PLIN1-2实验组，sgRNA- PLIN1-3实验组，37℃孵育30-120 min。孵育完成后使用DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化结果进行琼脂糖凝胶电泳观察切割效率。

1.2.4 CRISPR/Cas9质粒载体细胞内活性鉴定 1.2.4.1 T3-L1细胞的培养

用含10%FBS的DMEM高糖培养基培养3T3-L1前脂肪细胞：放置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，2 d更换培养液1次。传代时用胰酶消化细胞，并转移细胞至10 mL无菌离心管中，800 r/min离心5 min。将细胞沉淀平均分到两个新的含有5 mL完全培养基的培养瓶中继续培养。

1.2.4.2 电转染

在电转染前一天，细胞传代，使细胞在转染前融合度达到80%。收集细胞沉淀至EP管中。加入500 mL 1640培养基，充分吹打均匀。取10 mL细胞悬浮液，显微镜下观察并计数。调整细胞浓度至7×10⁶/mL左右，加入7 mg/mL的质粒，吹打均匀。在0.2 mm电转杯中加入含有质粒的细胞悬液100 mL，按照预定条件设置参数(波型：指数波，电压：160 V，电阻：500F)，进行电穿孔。将电转杯放入细胞恒温培养箱中10 min，使质粒充分进入细胞。取出电击杯，在预热的细胞培养基(不含双抗)中接种细胞悬液，摇晃均匀，放入培养箱中正常培养。待细胞贴壁后，更换培养基继续培养。

1.2.4.3 嘌呤霉素筛选

细胞电转染24 h后，用已确定的嘌呤霉素筛选培养基培养细胞。2 d更换嘌呤霉素培养基一次，继续培养4 d，随时观察细胞生长状态。转移少量筛选后的细胞到一个新的细胞培养瓶中，用完全培养基继续培养7 d。

1.2.4.4 诱导分化

将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至80%左右时，按本课题组前期优化过的经典“鸡尾酒”方法，诱导分化3T3-L1前脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞^[8]。首先用诱导分化培养基Ⅰ培养细胞2 d，再用诱导分化培养基Ⅱ继续培养2 d，随后更换为完全培养基继续培养4 d，每2 d换液1次。

1.2.4.5 实时荧光定量PCR检测细胞中PLIN1 mRNA的表达

当细胞回合至80%左右的时候，PBS冲洗，收集到EP管中。按照试剂说明书的要求，提取总RNA，逆转录为cDNA，然后进行实时荧光定量PCR扩增，以β-actin为内参，用2^-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达量。PLIN1基因cDNA RT-PCR引物，上游：5'-GAGAGGAGACAGACGACGAGGAG-3'，下游：5'-GGTCACTGCG GAGATGGTGTTC-3'，交上海生工公司合成。

1.2.4.6 Western blot检测细胞中PLIN1蛋白的表达量

收集各组细胞沉淀至EP管中，加入200 µL细胞总蛋白裂解液，冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，上层液体即为待测总蛋白样品。采用BCA法测定各组待测样品的总蛋白浓度并调平。PAGE电泳，电泳参数：浓缩胶80 V恒压，分离胶120 V恒压；湿式转膜，参数：220 mA恒定电流，转膜持续2 h。取出NC膜，浸入封闭液中封闭2 h。蛋白一抗4℃过夜孵育。次日取出条带，孵育二抗，37℃摇床2 h。显影仪曝光目的条带，挑选目的条带清晰、背景浅的图片。用ImageJ软件对目的蛋白条带进行分析并测定吸光度值，以β-actin进行校正。

1.2.5 PLIN1基因敲除对3T3-L1细胞脂解的影响

细胞干预完成后，收集6孔板中的细胞至EP管。每个EP管中加入900 μL PBS缓冲液，用枪头吹打细胞沉淀至细胞悬浮。在冰水浴条件下进行超声破碎细胞。制备好的匀浆液直接按照甘油三酯(TG)试剂盒检测说明书测定TG含量，每组以细胞总蛋白浓度对测定值进行校正。制备好的匀浆液70℃金属浴10 min，灭活脂肪水解酶，严格按照甘油测定试剂盒说明测定样本甘油含量。根据预先绘制的标准曲线计算各样本的甘油含量，并以每mg蛋白浓度对测定值进行校正。

2 结果 2.1 CRISPR/Cas9质粒干扰载体构建及鉴定

构建的CRISPR/Cas9质粒载体进行靶位点测序，测序结果与预期目标一致(图 3)，sgRNA序列成功连接到到质粒载体上，表明质粒载体构建成功。

2.2 sgRNA体外切割活性鉴定

通过PCR获得带有T7 Promoter的sgRNA体外转录模板，经琼脂糖凝胶电泳检测分子量在120 bp左右，与预期结果一致。对转录模板进行纯化回收，浓度为44±3.1 ng/mL，A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.89±0.04，证明体外转录模板构建成功。用sgRNA体外转录模板进行体外扩增，3条sgRNA转录体外转录产物均在100-200 bp之间(图 3)，与预期结果一致。对转录产物进行纯化回收，浓度全部大于5 000 ng/mL，A₂₆₀/A₂₈₀比值为2.03±0.06，证明体外转录sgRNA成功。

以扩增好的PLIN1基因为底物，分别用3条sgRNA进行构建体外酶切体系，反应1 h后，底物被切割为2个条带(图 4)。利用灰度值计算切割强度，得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%，sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%，sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%。计算公式为，其中f_cut=切开的条带强度之和/全部条带强度之和。3组sgRNA均可成功切开底物PLIN1基因，其中sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组，差异有统计学意义(图 5)。

2.3 3T3-L1前脂肪的诱导分化

显微镜下观察，3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，内部无明显脂滴，诱导分化可以使细胞趋向圆形，并逐渐出现脂滴，油红O染色后脂滴呈现“戒环样”(图 6)。电转染构建好的sgRNA-PLIN1-1、sgRNA-PLIN1-2、sgRNA-PLIN1-3质粒载体和阴性对照质粒，12 h后贴壁，存活率均为80%左右，无显著差异。嘌呤霉素杀死曲线确定嘌呤霉素4 d杀死细胞的最低浓度是4 mg/mL；嘌呤霉素筛选细胞后，存活率均为30%左右，无显著差异。

2.4 3T3-L1脂肪细胞中PLIN1 mRNA的表达

在诱导分化的第4天，检测sgRNA-PLIN1-1组、sgRNA-PLIN1-2组、sgRNA-PLIN1-3组、阴性对照组的PLIN1的mRNA表达量。如图 7所示，各阳性组中PLIN1mRNA表达量显著降低，差异有统计学意义。sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的mRNA表达量较sgRNA-PLIN1-3组降低，差异有统计学意义。

2.5 3T3-L1脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达

在诱导分化的第4天，检测sgRNA-PLIN1-1组、sgRNA-PLIN1-2组、sgRNA-PLIN1-3组、阴性对照组和空白对照组的PLIN1的蛋白表达量。如图 7所示，sgRNA-PLIN1-1组、sgRNA-PLIN1-2组和sgRNA-PLIN1-3组的PLIN1蛋白几乎不表达，差异无统计学意义。3组sgRNA阳性组与阴性对照组相比蛋白表达均有明显降低，差异有统计学意义。3组sgRNA阳性组与空白对照组相比蛋白表达均有明显降低，差异有统计学意义(图 8)。

2.6 PLIN1基因敲除对脂解的影响

各组细胞诱导分化第8天油红O染色，随机选择50个细胞，用Image pro plus软件测量各个细胞中脂滴直径大小。与对照组相比，阳性敲除组中小脂滴数量增加，中脂滴、大脂滴数量减少，差异有统计学意义(图 9)。测定各组细胞中的甘油三酯以及甘油含量，结果(表 3)显示与对照组相比PLIN1基因敲除组中甘油三酯含量较低，甘油含量较高，差异有统计学意义。

3 讨论

脂质代谢紊乱会引发一系列慢性疾病，如肥胖症、2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等，严重影响了人们的生命健康，降低了人们的生活质量^[11]。研究者普遍认为，脂滴作为能量的贮存器，是一个复杂的、活动旺盛的、动态变化的多功能细胞器，脂滴内含有甘油三酯酶，它与其他细胞器(线粒体)相互作用，在脂质代谢与储存、膜转运等过程中发挥作用^[12]。围脂滴蛋白(Perilipin1，PLIN1)是脂滴表面蛋白的重要一员，完全定位在脂滴表面，在脂肪生成与脂滴成长过程中发挥重要作用^[13]。本实验可以明显观察到PLIN1基因的敲除会抑制小脂滴的聚集，促进甘油三酯的水解。

研究表明切割越靠前的外显子导致移码突变的概率越大，本次实验前部针对PLIN1基因的2号外显子设计sgRNA序列。体外活性切割实验相较于细胞实验具有高效、快速、低成本的优势。在实验中，3条sgRNA序列皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子，但sgRNA-PLIN1-3组的效率明显低于另外两组。且通过观察3条sgRNA切割位置发现，它们在目的基因上相距较近，且PAM序列都有较强的引导性，但切割效率却有差异，说明影响其活性的因素很多。所以设计多条sgRNA并验证其体外切割活性是有意义的。为进一步验证体外活性的准确性，将3条sgRNA通过电转染转入3T3-L1前脂肪细胞中，验证其在细胞内的切割活性。细胞内切割以后会引入双链断裂，发生同源重组。通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，3条sgRNA阳性组的PLIN1 mRNA和蛋白表达量均有显著降低。RT-PCR实验结果显示，gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组相较与sgRNA-PLIN1-3组有更高的活性。这证明体外切割活性好的sgRNA序列在细胞内仍保持较高的活性。两组实验可以相互预测，这与吴曦等^[14]的实验结论一致。mRNA水平的差异并未导致蛋白表达水平有明显差异，但是可以明显观察到蛋白表达量水平的降低，可能原因是sgRNA的靶点基因组，mRNA水平的检测敏感度高于蛋白水平。

4 结论

本研究证明了PLIN1基因可以促进脂解，设计了3条PLIN1基因的sgRNA，并构建其基因敲除载体。通过体内和体外活性实验，证明了体外切割活性和体内切割活性有一致性，验证了3条sgRNA的切割活性，得到了2条切割效率更高的sgRNA，为后续的基因敲除动物模型的构建奠定了基础。