2. 甘肃省牛羊种质与秸秆饲料化重点实验室，兰州 730030;
3. 西北师范大学新农村发展研究院，兰州 730070;
4. 甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070
2. Key Laboratory for Sheep, Cattle Germplasm and Straw Feed in Gansu Province, Lanzhou 730030;
3. New Rural Development Research Institute, Northwest Normal University, Lanzhou 730070;
4. College of Animal Science & Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070
岷县黑裘皮羊是甘肃省地方裘皮用绵羊品种，以生产黑色二毛裘皮著称，其主产区位于甘肃洮河和岷江上游的17个乡镇，境内植被覆盖率高，可食性牧草资源丰富。因此，岷县黑裘皮羊是在当地独特的生态环境条件下结合长期的人工选择培育而成的[1]。近年来，岷县黑裘皮羊受产业结构调整、禁牧措施实施、杂交育种等因素的影响，分布范围大幅压缩，存栏量不断减少，由上世纪80年代的10万余只锐减到3 000余只[2]，是国家采用抢救性措施保存下来的品种，2006年被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》; 2016年被再次列入《全国畜禽遗传资源保护和利用“十三五”规划》濒危品种。
畜禽遗传资源不仅是现代农业创新的物质基础，而且是维持生物多样性，国家生态安全和农业安全的重要战略物质，因此，保护和利用好畜禽遗传资源意义重大。而微卫星标记是分布于真核生物基因组中、由1-6个核苷酸串联重复组成的具有共显性、数量多、易检测、多态性丰富等特点的分子标记技术，被认为是理想的可用于评估家畜遗传多样性的方法[3]。王斌等[4]通过计算秦巴山区黄牛群体的遗传信息、遗传距离及聚类分析，为研究该品种的遗传适应特点，预测杂交优势，制定育种战略等提供了科学依据; Suh等[5]选取30个位点分析了韩国4个本地牛与荷斯坦和夏洛来牛的系统发生关系、遗传距离及遗传多样性，验证了当地牛遗传资源的独特性。Tefiel等[6]、Kumar等[7]、王可等[8]和邱小宇等[9]对阿尔及利亚、印度山羊品种、济宁青山羊等地方绵羊品种的遗传多样性做了分析，确定了可用于遗传标记的位点，丰富了地方绵羊品种的遗传资源。Fang等[10]和赵思思等[11]分别对中国香猪和河北黑猪品种进行微卫星分析，为该地区猪种质资源的合理保护和品种选育提供了依据。黄勋和等[12]、李红伟等[13]对我国的乌骨鸡和惠阳胡须鸡进行了评价，对该品种的选育潜力进行了评价。此外，还有研究表明微卫星DNA可作为畜禽育种改良的分子标记。王斌等[14-15]利用12对微卫星引物对西镇牛和宣汉牛生长发育性状进行关联分析，结果发现12个位点各基因型与西镇牛生长发育性状具有关联性，而11个位点与宣汉牛生长发育性状具有关联性。决肯·阿尼瓦什等[16]、任坤刚等[17]和梁庆玲等[18]用不同微卫星位点对巴什拜羊、萨福克羊和无角陶赛特羊生长性状进行关联性分析，找到了与各性状相关联的位点，为该性状的改良提供了理论依据。目前，关于岷县黑裘皮羊微卫星遗传多样性与生产性状间关联效应的研究鲜有报道，因此本研究从种质资源保护和性状改良角度出发，分析了10个微卫星位点在岷县黑裘皮羊群体中的遗传多样性，并对所选微卫星位点各基因型与体重、体高、体长、胸宽、胸深和胸围的关联性进行分析，以期为该品种的保护和生产性状改良提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物根据数量遗传学的抽样方法，在岷县黑裘皮羊中心产区，采用典型群随机抽样法，选择12、24和36月龄各48只，共144只外貌特征明显、体况相近的岷县黑裘皮羊，静脉采血10 mL，装入有EDTA抗凝剂的真空采血管中，记录血样编号，24 h内带回实验室，-20℃保存，用于后续试验。并测定其体重、体高、体长、胸宽、胸深和胸围指标。
1.1.2 设备与仪器KOD-201B-KOD-Plus购于东洋纺(上海)生物技术有限公司; DSMO-100-Liz 500购于克劳宁(北京)生物科技有限公司; 蛋白酶K、琼脂糖、Loading Buffer、DL 2000 Marker均购于天根生化科技(北京)有限公司。
DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂); DL9700 TOUCH型PCR仪(北京东林昌盛生物科技有限公司); 5424R冷冻离心机(德国Eppendorf公司); 3730型基因测序仪(美国ABI公司); JY04S-3C型凝胶成像分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司); DY-Ⅲ型高压电泳仪(北京六一仪器厂)。
1.2 方法 1.2.1 微卫星DNA多样性检测 1.2.1.1 微卫星位点的选择根据联合国粮农组织(FAO)(http://www.fao.org)的推荐，选择10对可用于评价绵羊生产性状的微卫星位点，分别进行5 ' 端FAM(蓝色)、HEX(绿色)、ROX(红色)、TAMRA(橙色)荧光修饰，引物由武汉金开瑞生物有限公司合成，引物信息见表 1。
基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》(第三版)，采用常规酚、氯仿抽提法提取。并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，将符合试验要求的DNA于-80℃保存备用。
1.2.1.3 PCR反应体系PCR反应总体系为25 μL:10×KOD Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L MgSO4 0.5 μL，10 μmol/L Forward 1 μL，10 μmol/L Reverse 1 μL，Template DNA 1 μL，KOD-Plus 1 U，补水至25 μL。
PCR扩增程序为:95℃预变性5 min; 95℃变性30 s，65℃-55℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环后，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后，68℃修复延伸7 min，于4℃保存。
1.2.1.4 毛细管电泳检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，利用ABI-3730基因测序仪进行毛细管电泳，并对电泳结果采用Gene Marker进行标准化分析。
1.2.2 数据处理根据毛细管电泳结果，将各个位点的等位基因按照片段大小由小到大依次编号为A-O; 利用Popgene32软件计算等位基因频率(Alleles frequency)、等位基因数(Numbers of alleles，Na)、有效等位基因数(Effective numbers of alleles，Ne)、期望杂合度(Expected heterozygosity，He)、观测杂合度(Observed heterozygosity，Ho)等; PIC软件计算多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)。
采用Microsoft Excel 2016对试验数据进行整理后，选择基因型样本数≥4的个体，利用SPSS 21.0一般线性模型(GLM)程序，采用最小二乘方差分析微卫星位点的基因型对生产性状影响的效应，一般线性模型为:
其中:Yij为个体表型值，μ为群体性状均值，ai为个体基因型效应，bj为个体月龄效应，eijk为随机残差效应。若位点与性状显著关联时，运用LSD进行多重比较，若同一位点只有2种基因型，采用独立性t检验分析。P > 0.05表示无显著差异，P < 0.05表示差异显著，结果用“均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 DNA提取及电泳检测提取的样品DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，所有DNA条带清晰均匀，亮度较大; PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测后，无明显杂带，无引物二聚体产生，可用于后续试验; 利用基因测序仪对每个位点等位基因进行分型，结果显示所有电泳图峰型较完整。图 1所示为3号个体在位点MCM140上177/181 bp基因型，图 2为2号个体在位点OarJMP29上136/136 bp基因型。
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| 基因型为177/181 bp 图 1 3号个体在位点MCM140的检测结果 |
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| 基因型为136/136 bp 图 2 2号个体在位点OarJMP29的检测结果 |
岷县黑裘皮羊10对微卫星引物的遗传多样性信息见表 2。所有位点等位基因数范围为9-15，群体平均等位基因数为11.2个; 有效等位基因数范围为2.931 3-8.243 3，群体平均有效等位基因数为4.450 8;观测杂合度范围为0.250 0-0.714 3，群体平均观测杂合度为0.5218;期望杂合度范围为0.665 8-0.887 9，群体平均期望杂合度为0.765 7;多态信息含量范围为0.615 6-0.867 3，群体平均多态信息含量为0.728 9。说明岷县黑裘皮羊具有丰富的遗传多样性。
由表 3可知，位点OarHH47各基因型在12和24月龄岷县黑裘皮羊生产性状间差异无显著性(P > 0.05)。36月龄时，GG型个体体重显著高于DD和DI型(P < 0.05);DD型个体体高显著低于其它个体(P < 0.05)。
由表 4可知，24月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点OarVH72各基因型间差异无显著性(P > 0.05)。12月龄时，CC型个体体高显著高于CI型(P < 0.05)。36月龄时，BI型个体体重和胸宽均显著高于CC、CI和FI型个体(P < 0.05)。
由表 5可知，12和24月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点OarCB226各基因型间差异无显著性(P > 0.05)。36月龄时，AA和AJ型个体体重显著高于BB型(P < 0.05);AJ型个体胸宽显著高于BB和AA型(P < 0.05)，AB型与AJ和BB型间差异无显著性(P > 0.05);AJ型个体胸深显著高于AA和BB型(P < 0.05)。
由表 6可知，24和36月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点ILSTS28各基因型间差异无显著性(P > 0.05)。12月龄时，CI型个体体高显著高于AD、II和JJ型，且显著高于DJ型(P < 0.05);胸宽性状上，CI型个体数值最大，且显著大于DJ、II和JJ(P < 0.05)，与AD型间无显著差异性，同时，II型与DJ和JJ型间差异也无显著性(P > 0.05)。
由表 7可知，12月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点MCM140各基因型间差异无显著性(P > 0.05)。24月龄时，EH型个体体高显著低于EE、EG型(P < 0.05)，与FF和GG型间无显著差异(P > 0.05);胸围性状上，GG型个体显著高于EG(P < 0.05)，与EE、EH和FF型间无显著差异(P > 0.05)。36月龄时，GG型个体体高显著低于AF和FF型，与EG型间无显著差异(P > 0.05);GG型个体胸围显著低于AF、EG和FF型(P < 0.05)，AF、EG和FF型间无显著差异(P > 0.05)。
位点OarFCB193各基因型与岷县黑裘皮羊生产性状的关联分析结果见表 8。12月龄时，CC型个体体长和胸围均显著高于FF型个体(P < 0.05)，与CF型无显著差异(P > 0.05)。24月龄时，CF型个体体重和胸围显著高于FF型(P < 0.05);体高显著高于FF和FI型(P < 0.05)。36月龄时，FF型个体体重显著高于FH型(P < 0.05);体高、胸宽和胸围性状上，FF和FH型个体显著高于CF型(P < 0.05)。
位点OarFCB304各基因型与岷县黑裘皮羊生产性状的关联分析结果见表 9。12月龄时，FM型个体体重显著低于EE和FF型(P < 0.05);EE型个体胸深显著高于FF和FM型(P < 0.05)。24月龄时，FF型个体胸深显著高于EE型(P < 0.05)，与CC型无显著差异(P > 0.05)。36月龄时，EE型个体体长显著高于CC和FF型，胸宽显著低于CC和FF型(P < 0.05)。
位点OarJMP29各基因型与岷县黑裘皮羊生产性状的关联分析结果见表 10。12月龄时，EE型个体在体高和胸深性状上显著高于AG型(P < 0.05)。24月龄时，EE型个体体重和胸围均显著高于FF型(P < 0.05)。36月龄时，EE型个体体重显著低于GI型，胸围显著高于GI型(P < 0.05)。
由表 11可知，36月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点MAF70各基因型间差异无显著性(P > 0.05)。12月龄时，在体重、体高、体长和胸围性状上，FJ型个体显著高于DI型(P < 0.05)。24月龄时，DK型个体体高显著高于DD型(P < 0.05)。
由表 12可知，36月龄岷县黑裘皮羊生产性状在位点MAF209各基因型间无显著差异(P > 0.05)。12月龄时，CC型个体胸深显著高于DD和DF型(P < 0.05)。24月龄时，体重性状上，DG和DI型个体数值最大，且显著大于AA、CC和DD型(P < 0.05)，DD与AA和CC型间无显著差异(P > 0.05);体长性状上，DG型个体显著高于其它各型(P < 0.05);胸围性状上，DD、DG和DI型个体显著高于AA、CC和DF型(P < 0.05)。
分析群体遗传多样性时，一方面要求所选的样本量能够反应整个群体，另一方面，选择合理的微卫星位点和数目对研究群体平均基因多样性至关重要。有研究表明[19-20]，当样本量在25-50时，样本量与期望杂合度无相关性，与等位基因数呈正相关。本试验研究的样本量是144，符合样本量要求，可以反映整个群体的遗传多样性。其次，根据FAO的建议，所选位点应至少有4个及以上的等位基因，一般选择5-19个为宜，且所选位点要尽可能的均匀分布于不同染色体上。试验中所选的10个微卫星标记，分布于不同染色体，等位基因数在9-15之间，能够提供足够多的遗传信息，对岷县黑裘皮羊遗传多样性的研究可以提供可靠依据。
微卫星遗传多样性不仅可以反映群体的遗传变异历史，而且可以为后期的保种选育提供可靠信息。有效等位基因数值与等位基因数绝对值的接近程度可以反映等位基因在群体中是否分布均匀，所选的10个微卫星位点中，有效等位基因数和等位基因数值均相差较大，表明等位基因在该群体中分布不均匀。杂合度是度量群体遗传变异最合适的参数之一，平均杂合度的高低可以反映群体的遗传一致性程度，平均杂合度越高，遗传变异越大。因观测杂合度受样本量影响较大，期望杂合度常被用来衡量群体的遗传多样性大小，两者的接近程度反映人工和自然选择对群体影响的大小。所选10个标记中，OarCB226位点观测杂合度和期望杂合度接近程度最高，说明该位点是岷县黑裘皮羊最原始的等位基因，其它9个位点可能受到了人工和自然的高强度选择，遗传变异程度较高。多态信息含量(PIC)是衡量DNA片段多态性的指标，Purvis认为PIC大于0.7为最好的遗传标记[21]。所选10个位点中，7个位点PIC大于0.7，表明所选位点遗传变异程度较高，可用于评价该群体的遗传多样性。
3.2 岷县黑裘皮羊微卫星位点与生产性状关联性生产性状一般认为是由微效多基因控制的数量性状，由于某些基因效应微小，很难根据表型值将其区分开来，但随着分子标记技术的发展，可以利用DNA标记分析染色体片段或基因座的遗传规律来研究基因的效应[22]。关联分析是利用基因间的连锁不平衡，对表型值和基因间的相关性进行分析，从而鉴定与表型变异相关的基因位点[23]，在实际应用中，根据王斌等[15]的研究结果，一般选择个体数≥4的基因型进行关联分析。所选10个位点均与生产性状表现出不同程度的关联性，且出现了几个位点与同一性状相关或一个位点与多个性状表型值相关的现象。王玉琴等[24]对太行黑山羊进行微卫星位点研究时发现，位点MAF70的155/155 bp基因型与体重、165/192 bp与体高呈正相关，刘德稳等[25]对鲁山牛腿山羊微卫星多样性与体尺性状的相关性研究发现，MAF70位点159 bp和180 bp对体重具有正效应，等位基因144 bp和159 bp对体高、胸深和胸围具有负效应。本研究中，MAF70位点各基因型对36月龄岷县黑裘皮体尺性状无显著影响，但含有等位基因F(140 bp)和J(150 bp)的基因型与12月龄岷县黑裘皮羊体高、体重、体长和胸围呈显著正相关; 含等位基因K(154 bp)的基因型的24月龄岷县黑裘皮羊体高显著高于其它各型。
此外，本试验也发现了其它与岷县黑裘皮羊生产性状具有关联性的位点。其中，12月龄时，与体重相关的位点有2个:OarFCB304、MAF70;与体高相关的位点有4个:OarVH72、ILSTS28、OarJMP29、MAF70;与体长相关的位点有2个:OarFCB193、MAF70;与胸宽相关的位点有1个:ILSTS28;与胸深相关的位点有3个:OarFCB304、OarJMP29、MAF209;与胸围相关的位点有2个:OarFCB193、MAF70。24月龄时，与体重相关的位点有3个:OarFCB193、OarJMP29、MAF209;与体高相关的位点有3个:MCM140、OarFCB193、MAF70;与体长相关的位点有1个:MAF209;与胸宽相关的位点有0个; 与胸深相关的位点有1个:OarFCB304;与胸围相关的位点有4个:MCM140、OarFCB193、OarJMP29、MAF209。36月龄时，与体重相关的位点有5个:OarHH47、OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarJMP29;与体高相关的位点有3个:OarHH47、MCM140、OarFCB193;与体长相关的位点有1个:OarFCB304;与胸宽相关的位点有4个:OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarFCB304;与胸深相关的位点有1个:OarCB226;与胸围相关的位点有3个:MCM140、OarFCB193、OarJMP29。
4 结论本研究所选10个微卫星位点在该岷县黑裘皮羊群体中均具有丰富的遗传多样性，且与12、24和36月龄的体重、体高、体长、胸宽、胸深和胸围具有不同程度的关联性。研究结果从分子水平上为岷县黑裘皮羊的保种、早期选育和高效育种提供了理论依据。
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