地黄是我国常用中药材之一，它是玄参科地黄属多年生草本植物，地黄根作为药材，具有显著的药用效果，是多种中成药的成分之一，具有很高的经济价值^[1]。但是，市场上流通的地黄来源杂乱，品质不一，且不同品种间药用成分差异较大^[2]。所以，应采取有效的方法鉴定优良种质的地黄品种。

DNA分子标记技术是基因定位克隆，遗传图谱构建等研究工作的重要工具，目前已广泛应用于作物分子辅助育种及种质资源多样性分析等领域^[3-4]，特别是单核苷酸多态性研究备受关注。单核苷酸SNP是单个核苷酸变异而产生的DNA水平上的多态性。SNP是大多数基因组中最丰富和稳定的遗传变异形式，多态性高，数量多，已成为植物分子辅助育种的主要分子标记之一^[5]。

基于转录组测序能够大规模的挖掘SNP位点。在植物中的应用也十分广泛，候莉娟等^[6]在实验室已有转录组数据的基础上，挖掘了大量羊草的SNP对羊草种质进行分型；周军永等^[7]以李府贡枣不同处理枣果实的转录组序列为基础，分析了转录组数据中SNP位点的分布，为枣的遗传结构和遗传分化奠定了基础。Wu等^[8]基于银杏转录组测序收集并验证SNP位点，并分析群体遗传多样性，为银杏的遗传和基因组研究提供了有用资源。

目前，利用SNP分子标记技术探讨地黄种属亲缘关系及品种鉴定的研究很少，本研究利用RNA-seq技术，对85-5地黄新鲜块根进行转录组测序，根据测序数据与NCBI中SRA数据库中的3个地黄数据比对，利用Samtools（http://samtools.sourceforge.net/）和VarScan v.2.2.7（http://varscan.sourceforge.net/）软件寻找候选SNP。针对候选SNP位点设计引物，选择能够扩增出单一目的条带的引物，对地黄28个品种间扩增，旨为地黄遗传多样性分析和品种鉴定奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

实验用地黄种质收集于河南4个市县、山东2个区县和上海华东师范大学，包括裂叶地黄（Rehmannia piasezkii）和地黄（Rehmannia glutinosa）这2个种，共28份种质。均经过ITS测序与NCBI比对，确定为裂叶地黄或地黄种质^[9]（表 1）。

实验用Taq Master Mix由北京康为世纪生物科技有限公司合成，具有稳定性好、灵敏度高、快速简便、特异性强等优点。

SNP引物Primer软件设计后于英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 挖掘SNP位点

根据实验室前期得到的地黄转录组数据，将其与在NCBI数据库上下载的3个转录组数据库，下载的转录组数据测序数据分别是由河南农业大学上传的SRR444423.sra数据量为485 M；河南农业大学上传SRR832972.sra数据量2.1 G；药用植物研究所上传的SRR832973.sra数据量2.1 G。然后通过格式转换之后，以这3个组装好的转录本为模板序列，将原始序列与其进行比对，利用Samtools（http://samtools.sourceforge.net/）和VarScan v.2.2.7（http://varscan.sourceforge.net/）软件寻找候选SNP。

1.2.2 设计SNP引物

根据挖掘到的候选SNP位点，利用Primer软件设计引物。在SNP位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，理想引物的长度为18-24 bp，Tm值为50-60℃，能保证上下游引物的Tm值一般不超过2℃；引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。

1.2.3 筛选SNP引物

通过PCR来验证SNP引物。设计的SNP引物，需要确保能扩增出单一、明亮的条带。PCR扩增反应体系为20 μL，包含6 μL的dd H₂O，1 μL的模板DNA，1 μL上游引物，1 μL下游引物，10 μL Mix。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30s，适宜退火温度退火30s，72℃延伸30 s，34个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，胶回收后测序。

1.2.4 SNP位点用于28种地黄分型

分别以28种地黄基因组DNA为模板，选用初筛的引物来对其进行PCR扩增，回收目的片段，Sanger法正反向测序目的序列，检测SNP位点多态性。根据SNP位点绘制指纹图谱。

2 结果 2.1 地黄SNP位点的挖掘

在地黄转录组中共有102 075条Unigene中，检测到35 339个SNP位点，在转录组数据中的发生频率为0.51/kb。检测出的SNP位点中发生转换共22 718个（64.28%），颠换共12 621个（35.72%），这6种单核苷酸变异里C/T和A/G的频率最高，分别达到31.95%和32.33%，其他4种单核苷酸变异中A/T、A/C、T/G、C/G的频率分别为9.22%、9.36%、8.80%和8.34%。本次研究极大丰富了地黄的SNP位点信息（表 2）。

2.2 SNP引物的设计与筛选

根据SNP挖掘结果，用Primer 5设计了39对引物，包含了54个候选SNP位点。对设计的39对SNP引物，以地黄85-5基因组为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，从中挑选出了28对符合预期产物长度、扩增效果清晰单一的SNP引物对（图 1），用以进行后续分型实验。

2.3 地黄SNP标记的开发

为开发多态性地黄SNP引物，我们用2.2实验筛选出的28对特异性引物对28种地黄种质进行分型实验（图 2）。经过PCR扩增目的片段，切胶纯化回收后用Sanger法直接测序。在28对引物扩增的PCR产物中，能够直接测序成功并且SNP位点在不同地黄种质间不同的仅有7对（表 3）。经过DNAMAN序列比对软件比对后，可以直观的看出不同地黄种质间的SNP位点变化，位点SNP1的比对图如图 2所示。经测序后统计7对引物所包含的8个SNP位点在28种地黄种质间的检测结果，如表 4所示。

2.4 基于SNP位点指纹图谱绘制

通过对28份地黄的8个SNP位点的分析，发现可以将地黄17个种质区分开。利用这8个SNP位点绘制17份地黄种质的指纹图谱，如图 3所示，不同引物对的分型结果用不同的颜色区分；同一引物对的分型结果用数据条长短区分，数据条长度相同的种质，基因型一致，数据条长度不同的种质，表明在基因分型时被分到不同的组。如DH2和DH3两份地黄种质仅在SNP3位点存在差异，其余的SNP位点均无差异，这表明两份种质的差异较小；而DH6和DH17则是除了在SNP7变异位点处相同，其余的6个SNP位点均存在差异，表明它们差异较大。

3 讨论

目前，应用于地黄的分子标记主要有RAPD、ISSR^[10]、ITS^[9]、SSR^[11-12]和SCoT^[1]等。但这些分子标记各有不足^[13]，如技术难度高，实验重复性差，对PCR体系要求高等，限制了这些技术的发展与应用。SNP分子标记是一种特异性强的遗传标记，随着高通量测序技术的广泛应用，以及SNP标记的检测成本的逐渐下降，基于转录组测序来挖掘SNP位点，会使得SNP分子标记技术越来越高效。对于多倍体或没有参考基因组的物种来说，利用新一代高通量转录组测序技术可大量鉴定SNP^[6]。近年也被成功地应用于植物的基因分型、品种鉴定、新品种选育等研究中，Jiang^[14]利用开发的14个SNP标记对30个柑橘品种进行基因分型，区分了品种间的亲缘关系；李志远等^[15]在甘蓝中筛选出50个核心SNP标记用于构建59个甘蓝品种的指纹图谱，能有效鉴定品种的特异性和真实性；Distefano等^[16]开发出了21个柑橘SNP标记，并对18个柑橘品种进行遗传多样性分析；吴澎等^[17]在小麦中可利用SNP标记技术和基因工程技术相结合，将多个优质感官性状基因聚合到一个小麦新品种上；Ferguson等^[18]利用53个木薯品种对候选SNP位点的验证，筛选出1 190个稳定且具有多态性的SNP标记，用于对木薯的多样性评估和地理起源分析。

目前，常用于SNP分析的有等位基因特异性PCR法^[19]、高分辨率溶解曲线分析^[20]、DNA芯片法^[21]和直接测序分型法等。由于AS-PCR法对PCR体系要求严格，HRMA法需要使用专门的设备，DNA芯片法需要大量合成特异性探针，都不是最优的SNP分型法。基于Sanger测序法的SNP分型，它的测序准确度高，不仅能够发现和检测不同个体间存在的所有碱基变异，同时还可以明确各个的位置及变异类型，是实验室常用的SNP分型方法。

但是，到目前为止，还未见使用SNP分子标记对地黄种质进行研究。SNP分子标记因其在基因组中数量最多、分布最广及具有双等位基因等特性，正好可以打破地黄品种的遗传基础狭窄，品种间遗传分化不明显^[22]这种局限性，SNP标记将在新品种的特异性、真实性鉴定方面有更多应用。为此，本研究利用首次使用SNP分子标记分析28种地黄的遗传多样性，丰富地黄分子标记技术，为区分地黄种质提供有力的分子标记技术。

本研究通过转录组挖掘SNP位点，丰富了地黄基因组SNP变异信息，在Unihene中共发现3 339个SNP位点，其中转换类型发生频率显著高于颠换类型，转换发生频率约为颠换的两倍，这与其他植物转录组SNP变异类型的比例相似^[23-24]。转换类型中A/G（32.33%）和C/T（31.95%）的发生频率最高，颠换类型中A/T最高为9.22%。地黄转录组中SNP位点非常丰富，可为地黄遗传多样性分析、亲缘关系鉴定与品种区分等方面提供丰富的基础数据信息。根据SNP候选位点设计的39对引物中，以地黄85-5基因组为模板进行PCR扩增，筛选出28对扩增条带单一、产物长度符合预期的引物，引物特异性筛选率为72%，成功率较高。但是筛选出的候选SNP位点验证成功率并不是很高，仅有7对引物所包含的8个SNP位点在28种地黄种质中有差异。这可能是由于在转录组挖掘SNP位点时，对原始测序数据分析时造成的SNP位点的假阳性的原因^[25-26]。使用28对引物在28种地黄中进行分型实验，结果仅有7对引物所包含的8个SNP位点表现出多态性，根据8个SNP位点构建纹图谱，可以直观的区分17种地黄种质。根据指纹图谱可以看出8个SNP位点可以将裂叶地黄从其余27种地黄种质中区分出来，表明筛选出SNP位点可以用于地黄的种间区分。其余的鉴别出来的16种地黄种质都属于地黄种，表明8个SNP位点也可用于地黄的种间区分。

在地黄其他分子标记的研究中，张进忠等^[27]筛选出的17条RAPD引物在10个地黄品种都可以扩增出各自的多态性条带，检测10个地黄品种的种质遗传多样性；周延清^[10]筛选出17条RAPD引物和10条ISSR引物用于对10个地黄品种的种质遗传多样性分析，并且筛选出能够鉴别10个地黄样品的RAPD引物两个与ISSR引物一个；郭冠瑛^[2]利用地黄转录组信息，设计了320对EST-SSR引物，213对引物在地黄85-5的基因组扩增出了产物，只有80对引物在36份地黄种质中具有多态性。杨珂等^[1]利用5个SCoT引物构建30份地黄种质的指纹图谱，结果能区分开7个地黄常见栽培品种。我们基于8个SNP位点绘制指纹图谱，可以将28个地黄种质区分出17种，区分力度稍弱，这有待于继续大量开发SNP位点，为地黄品种鉴定提供更有效的技术。

本研究以鉴定地黄品种，丰富地黄分子标记为目的，采用PCR产物直接测序的方法进行地黄的SNP分型，结果表明有7对引物，包含8个SNP位点能在17份地黄材料中表现出多态性，并根据8个SNP位点的差异构建了指纹图谱，对地黄品种的遗传多样性做了补充，为鉴定地黄品种开发了有效的分子标记，为大量开发地黄SNP标记来全面评估地黄遗传多样性奠定基础，使用SNP分子标记技术来准确鉴定地黄品种对种质管理和育种也有重要意义。

4 结论

通过地黄转录组挖掘SNP位点，在28份地黄种质中筛序多态性SNP位点，利用8的SNP位点能够鉴定17种不同的地黄种质。