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章英才, 苏伟东, 柴雅红
宁夏中宁地区灵武长枣果实多糖的单糖成分GC-MS分析
生物技术通报, 2019, 35(11): 22-29

ZHANG Ying-cai, SU Wei-dong, CHAI Ya-hong
Analyse on Monosaccharide Composition of Polysaccharides in Ziziphus jujuba Mill cv. lingwuchangzao Fruit from Zhongning Areas in Ningxia by GC-MS
Biotechnology Bulletin, 2019, 35(11): 22-29

文章历史

收稿日期:2019-04-11

宁夏中宁地区灵武长枣果实多糖的单糖成分GC-MS分析
章英才, 苏伟东, 柴雅红     
1. 宁夏大学生命科学学院,银川 750021;
2. 宁夏红枣工程技术研究中心,灵武 750400
摘要:研究宁夏中宁地区灵武长枣果实多糖的单糖成分,为不同地区灵武长枣的开发利用提供试验依据。以不同发育时期中宁产灵武长枣果实为试验材料,采用热水浸提法和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等,探讨不同发育时期果实多糖含量变化规律及其单糖组成成分。结果表明,不同发育时期中宁产灵武长枣果实粗多糖得率分别为:膨大前期0.43%、快速膨大期0.527%、着色期0.80%和完熟期0.618%;果实粗多糖经DEAE-52均得到Ju-0、Ju-1、Ju-2、Ju-3 4个多糖级分,其中Ju-2含量为最高,表明果实多糖的主要形式为酸性多糖; 不同发育时期果实各精制多糖总共含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10种单糖,不含果糖,以阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、糖醛酸含量较高,岩藻糖、葡萄糖含量次之,木糖、甘露糖含量较低,但其含量各组分有差异。精制多糖含量随着果实的发育进程总体呈现上升趋势; 不同发育时期中宁产灵武长枣果实各精制多糖中单糖组成及含量各不相同。
关键词中宁    灵武长枣    果实    多糖    单糖组成    GC-MS    
Analyse on Monosaccharide Composition of Polysaccharides in Ziziphus jujuba Mill cv. lingwuchangzao Fruit from Zhongning Areas in Ningxia by GC-MS
ZHANG Ying-cai, SU Wei-dong, CHAI Ya-hong     
1. College of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021;
2. Ningxia jujube engineering technology research center, Lingwu 750400
Abstract: The monosaccharide composition of polysaccharides in Ziziphus jujuba Mill cv.lingwuchangzao fruit from Zhongning areas in Ningxia was studied to provide experimental basis for the development and utilization of different areas Ziziphus jujuba Mill cv.lingwuchangzao. The fruit of Ziziphus jujuba Mill cv.lingwuchangzao from Zhongning areas in different developmental periods was used as experimental material to research the change rules of polysaccharides content and monosaccharide composition by the methods of hot water extraction and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The main research results are followed:the crude polysaccharides obtaining ratio in Ziziphus jujuba Mill cv. lingwuchangzao fruits from Zhongning areas in different developmental periods is respectively 0.43% in the early bulking period, 0.527% in the rapid enlargement period, 0.80% in the coloring period, and 0.618% in the fruit maturation period. The crude polysaccharide in different developmental periods fruit was fractioned respectively to four fractions(Ju-0, Ju-1, Ju-2, Ju-3)by DEAE-52 cellulose ion-exchange columns, and Ju-2 had the highest contents, this indicated that the main components of polysaccharides in fruit was acid fractions. Finally, the refined polysaccharides in the different developmental periods fruit were analysed by the GC-MS, the results showed that polysaccharides were composed of ten monosaccharides:arabinose, rhamnose, ribose, fucose, xylose, mannose, galactose, glucose, glucuronic acid and galacturonic acid, and did not contain fructose, the contents of arabinose, galactose, ribose, rhamnose, glucuronic acid and galacturonic acid were higher, followed by the fucose and glucose, and the contents of xylose and mannose were the lowest, but the monosaccharide composition and contents are different in different polysaccharides component. Conclusion, The refined polysaccharide contents present ascendant trend with the development of the fruits, the monosaccharide composition and contents of the refined polysaccharide of Ziziphus jujuba Mill cv.lingwuchangzao fruits from Zhongning areas in different developmental periods are different respectively in different polysaccharides component.
Key words: Zhongning areas    Ziziphus jujuba Mill cv. Lingwuchangzao    fruit    polysaccharides    monosaccharide composition    GC-MS    

灵武长枣(Ziziphus jujuba Mill cv. Lingwuchang-zao)原产于宁夏灵武市,具有较高的食用和药用价值[1-2],成为宁夏名优红枣鲜果品种。宁夏灵武市为灵武长枣主栽区,由于其优良的品质,栽培种植面积不断扩大,近年来,在中宁等地区也有广泛栽种,但其外观、品质因产地、环境条件不同而呈现一定差异。枣多糖是果实中重要的有效成分,具有多种生物活性[3-4]和生理功能[5],多糖的单糖组成对果实品质具有重要的影响[6-9]。因此,明确不同产地间果实品质在多糖的单糖组成方面的差异显得尤为重要,从而为控制提高其多糖质量标准,调整优化种植结构提供技术支撑。

近年来,灵武长枣鲜果保鲜、生理变化、栽培技术、品种选育等领域已有较深入的研究[1-2],灵武长枣多糖的研究则仅限于果实多糖的分离提取、理化性质分析、多糖含量及变化规律等方面[5],而有关灵武长枣果实多糖中单糖成分分析、不同产地果实主要有效成分比较方面尚缺乏系统研究。

在前人研究基础上,本项目组对原产于灵武市的灵武长枣果实进行了多糖中单糖组成分析[10],由于产地不同,果实多糖的单糖组成可能存在较大的差异,而揭示多糖的单糖组成及其差异对调控果实品质及研究灵武长枣多糖活性等都有重要意义[11]

因此,在明确原产地灵武长枣果实多糖单糖成分的基础上,本研究选择宁夏枣产区之一中宁地区的灵武长枣果实为材料,采用热水浸提法及GC-MS等方法,分别对不同发育时期的宁夏中宁地区生产的灵武长枣果实多糖中单糖成分进行定性分析和定量分析,系统研究该地区不同发育时期果实多糖中单糖的成分,明确不同地区灵武长枣果实多糖中单糖组成的差异,旨在为宁夏不同地区灵武长枣的开发利用及产业发展提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

以宁夏中宁县枣园堡生长的灵武长枣果实为试验材料,选择同期开放的花朵进行标记,试验重复3次。选取果实膨大前期(7月10日)、快速膨大期(8月9日)、着色期(9月8日)、完熟期(9月28日)外观良好健康的果实上午9:00-11:00进行采样,所采样品45℃烘干至恒重,粉碎后过60目筛备用。

RE-52A型旋转蒸发仪、SBS-Z100数控计滴自动部份收集器、YZ1515X恒流泵、FD-4中型冷冻干燥器、日本岛津公司GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪等主要仪器。

六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷为色谱纯,其他试剂均为分析纯。DEAE-52纤维素填料(Whatman公司)、TOYOPEARL HW-55S凝胶树脂(日本TOSOH公司)。标准单糖:葡萄糖(99.5%),阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖(均 > 99%)购自北京拜尔迪公司; 核糖(99.6%),岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸(> 99%),购自国家标准物质网; 鼠李糖、木糖(均 > 98%),购自北京化学试剂公司。

1.2 方法 1.2.1 不同发育时期果实多糖的提取和含量测定

果实多糖的提取方法参见文献[10],采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[12]

1.2.2 不同发育时期果实粗多糖的分级纯化

将粗多糖溶液过滤后,加样至DEAE-52柱,分别用超纯水、0.1、0.2和0.3 mol/L NaCl洗脱,以洗脱管数为横坐标,吸光度值为纵坐标作洗脱曲线,分别合并各主峰收集管液,浓缩、透析、冷冻干燥后得到各多糖级分。将多糖各级分溶解后加样至HW-55S柱,用0.2 mol/L NaCl溶液洗脱,根据洗脱曲线收集主峰管液,经浓缩、透析、冷冻干燥后得到精制多糖。

1.2.3 不同发育时期果实精制多糖中单糖组成分析 1.2.3.1 精制多糖的GC-MS分析

果实精制多糖的水解和衍生、GC-MS检测条件、以及标准单糖标准曲线的制作方法见文献[10]

1.2.3.2 精制多糖中单糖组成的定性与定量

通过将多糖各级分中单糖的出峰时间与各种标准单糖的出峰时间对照,及NIST谱库对照,对多糖各级分组成进行定性分析。采用外标法对多糖各组分中的阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸进行定量分析,根据各单糖的回归方程计算出多糖中单糖的含量。

1.2.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010进行数据计算,利用SPSS 18.0对果实多糖主要成分试验数据进行差异显著性分析。

2 结果 2.1 多糖的提取

不同发育时期果实粗多糖的提取得率分别为:膨大前期0.43%、快速膨大期0.527%、着色期0.80%和完熟期0.618%;粗多糖含量分别为:膨大前期32.43%、快速膨大期44.19%、着色期54.33%和完熟期47.15%,着色期 > 完熟期 > 快速膨大期 > 膨大前期。果实多糖得率和含量随果实的发育进程呈现先上升至着色期,然后略下降的趋势,但总体呈上升趋势。

2.2 不同发育时期果实粗多糖的分级纯化 2.2.1 果实粗多糖的分级

图 1知,不同发育时期果实粗多糖经DEAE-52纤维素柱层析时,多糖样品各得到4个洗脱峰,从左到右分别为超纯水洗脱所收集组分、0.1、0.2和0.3 mol/L NaCl洗脱所收集组分,分别为Ju-0、Ju-1、Ju-2和Ju-3。峰形较对称,各多糖级分为均一级分。

图 1 中宁地区灵武长枣果实粗多糖经DEAE-52洗脱曲线

表 1可知,不同发育时期中宁地区灵武长枣果实4个多糖级分中Ju-2经DEAE-52纤维素色谱柱分离纯化后的得率均为最高,4个级分在快速膨大期的得率总体较高。

表 1 中宁灵武长枣果实粗多糖经DEAE-52纤维素色谱柱后4个多糖组分得率的测定
2.2.2 果实粗多糖的纯化

HW-55S分子排阻柱层析具有分子筛的作用,各时期的4个多糖级分按分子量的大小先后流出,达到纯化的目的。不同发育时期果实多糖各级分经HW-55S的洗脱曲线中峰形单一且较对称,纯化效果较好。

2.3 不同发育时期果实精制多糖的单糖成分分析 2.3.1 单糖标准品标准曲线的制作

配制不同质量浓度梯度的阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各标准单糖溶液(根据1.2.3单糖的定性与定量方法和研究结果可知各样品多糖中不含果糖),对各标准品衍生后分别进行GC-MS分析,得到各标准品衍生物的总离子流图(图 2)。并绘制各单糖标准曲线,得到回归方程(表 2),10种标准单糖均呈现良好的线性关系。

1-11依次为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸。下同 图 2 混合标准单糖的总离子流图
表 2 标准单糖的回归方程
2.3.2 不同发育时期果实精制多糖的单糖成分分析

各发育时期果实精制多糖的各多糖级分水解、衍生后进行GC-MS分析,分别得到各样品总离子流图(图 3),可见果实精制多糖各级分的单糖被成功分离。

图 3 完熟期果实精制多糖各组分总离子流图

中宁地区不同发育时期果实精制多糖各级分的单糖组成及质量如表 3所示。

表 3 中宁地区不同发育时期果实精制多糖的单糖组成(单位:mg)
2.3.2.1 针对不同组分的单糖

Ju-0中,以阿拉伯糖 > 核糖、半乳糖为主,占单糖总量的60%-78%;Ju-1中,快速膨大期以葡萄糖醛酸 > 半乳糖醛酸为主,占单糖总量的75%,而其余时期以阿拉伯糖、半乳糖为主,占单糖总量的48%-52%;Ju-2、Ju-3中,膨大前期以阿拉伯糖 > 半乳糖 > 鼠李糖为主,均占单糖总量的77%,而其余时期均以葡萄糖醛酸 > 半乳糖醛酸为主,占单糖总量的45%-74%。

针对不同发育时期的单糖总量,膨大前期:阿拉伯糖 > 半乳糖 > 鼠李糖; 快速膨大期:葡萄糖醛酸 > 半乳糖醛酸 > 阿拉伯糖 > 鼠李糖 > 半乳糖; 着色期:葡萄糖醛酸 > 阿拉伯糖 > 鼠李糖 > 半乳糖 > 半乳糖醛酸; 完熟期:葡萄糖醛酸 > 阿拉伯糖 > 半乳糖 > 核糖。

2.3.2.2 针对不同发育时期单糖总量变化及各组分单糖含量变化

针对Ju-0,阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖含量为快速膨大期 > 完熟期 > 着色期 > 膨大前期,鼠李糖、甘露糖为快速膨大期 > 着色期 > 完熟期。针对Ju-1,阿拉伯糖、半乳糖含量随果实的生长发育而不断升高,即完熟期 > 着色期 > 快速膨大期 > 膨大前期,鼠李糖、岩藻糖为快速膨大期 > 完熟期 > 着色期 > 膨大前期,糖醛酸含量为快速膨大期 > 完熟期 > 膨大前期。针对Ju-2,鼠李糖随果实的生长发育总体是升高的趋势,即完熟期 > 着色期 > 膨大前期 > 快速膨大期,核糖、岩藻糖、半乳糖为完熟期 > 着色期 > 膨大前期 > 快速膨大期,糖醛酸含量为着色期 > 完熟期 > 快速膨大期 > 膨大前期。针对Ju-3,阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖随果实的生长发育而不断升高,即完熟期 > 着色期 > 快速膨大期 > 膨大前期,核糖含量为完熟期 > 快速膨大期 > 着色期 > 膨大前期,膨大前期的半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸含量远小于其他发育时期。

从各单糖总含量来看,阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖均是随果实生长发育逐渐增高,即完熟期 > 着色期 > 快速膨大期 > 膨大前期; 核糖、岩藻糖均为完熟期 > 快速膨大期 > 着色期 > 膨大前期; 甘露糖为快速膨大期 > 完熟期 > 着色期 > 膨大前期; 葡萄糖、葡萄糖醛酸为着色期 > 快速膨大期 > 完熟期 > 膨大前期; 木糖为快速膨大期 > 着色期 > 完熟期 > 膨大前期; 半乳糖醛酸为快速膨大期 > 完熟期 > 着色期 > 膨大前期。

因此,在膨大前期到完熟期整个果实发育过程中,单糖含量增加的有阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖,且完熟期总含量阿拉伯糖 > 半乳糖 > 鼠李糖,以及核糖、岩藻糖、甘露糖; 而完熟期总含量降低的有葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖醛酸。

2.3.2.3 针对同一时期单糖各组分的含量变化

膨大前期,半乳糖醛酸含量大小为Ju-1 > Ju-2 > Ju-3,葡萄糖醛酸Ju-2 > Ju-1 > Ju-3,其余各糖均为Ju-2最大,Ju-0、Ju-1、Ju-3含量大小接近。快速膨大期:阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖均为Ju-0 > Ju-1 > Ju-2 > Ju-3,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸均为Ju-1 > Ju-3 > Ju-2,鼠李糖和核糖分别为Ju-1 > Ju-0 > Ju-3 > Ju-2和Ju-0 > Ju-1 > Ju-3 > Ju-2。着色期:阿拉伯糖、核糖为Ju-0 > Ju-1 > Ju-2 > Ju-3,鼠李糖和岩藻糖为Ju-3 > Ju-2 > Ju-0 > Ju-1,甘露糖、半乳糖为Ju-1 > Ju-0 > Ju-2 > Ju-3,葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸为Ju-2 > Ju-3,Ju-0、Ju-1中无。完熟期:阿拉伯糖、核糖为Ju-1 > Ju-0 > Ju-2 > Ju-3,鼠李糖为Ju-2 > Ju-3 > Ju-1 > Ju-0,岩藻糖、半乳糖醛酸为Ju-3 > Ju-2 > Ju-1,葡萄糖醛酸为Ju-2 > Ju-3 > Ju-1。

总之,各组分总含量的变化规律为:膨大前期Ju-2 > Ju-1 > Ju-3 > Ju-0;快速膨大期Ju-1 > Ju-0 > Ju-3 > Ju-2;着色期Ju-2 > Ju-3 > Ju-0 > Ju-1;完熟期Ju-2 > Ju-1 > Ju-3 > Ju-0。

3 讨论

宁夏灵武地区是灵武长枣的主产区,灵武、中宁地区产灵武长枣果实粗多糖得率和含量随果实生长发育,总体上均呈现增加的趋势,但变化趋势有所不同。中宁地区果实粗多糖得率和含量先上升,在着色期分别达到最高后完熟期略有下降,而灵武地区果实粗多糖得率和含量持续上升至完熟期达到最高[10]。赵爱玲等[13]用苯酚-硫酸法测定比较了24个品种枣果实白熟期、脆熟期和完熟期的多糖含量,发现其多糖含量呈现递增的趋势,在完熟期达到最高。这与灵武地区不同发育时期多糖含量的增加趋势基本一致,也与杨军等[14]对灵武地区果实多糖含量的研究结果相同。

中宁和灵武地区不仅多糖含量的变化趋势有所不同,而且相同时期不同地区的多糖含量也存在差异,说明产地对灵武长枣多糖的含量产生影响,这可能与其气候、土壤条件差异等有关[15-16]。陈宗礼等[17]分析陕北多个枣品种多糖含量,发现同一品种不同产地的枣多糖含量具有差异,在不同产地的狗头枣和大木枣等均表现出极显著差异,不同产地间狗头枣多糖含量最高与最低值相差39.68%,不同产地间大木枣多糖含量最高比最低值高出10.35%。与此不同的是,赵爱玲等[13]比较了壶瓶枣在不同地区间多糖含量,发现相同品种在不同地域间的含量差异比较小,在1 mg/g-3 mg/g之间,这与本研究结果不同。反映出不同枣品种果实多糖含量在不同地域间存在差异。

经DEAE-52纤维素柱分离纯化,中宁和灵武地区果实多糖样品均分别得到1种中性多糖组分和3种酸性多糖组分,各组分多糖的得率在不同发育时期大小不同,在相同发育时期不同地区各不相同。表明灵武长枣多糖的主要形式为酸性多糖,且各发育时期果实4个多糖级分中均是酸性组分2经DEAE-52色谱柱分离纯化后的得率最高。潘莹[18]采用DEAE-52纤维素柱对冬枣多糖进行分离,得到1个中性和1个酸性组分; 刘琳[19]对临泽小枣的多糖进行DEAE-52纤维素柱分离,得到1个中性、4个酸性共5种多糖级分; 戴艳[20]将骏枣多糖的DEAE-52纯化后,得到1个中性、4个酸性组分,酸性多糖回收率明显高于中性,且酸性组分2和4回收率最高。总的来看,都是酸性多糖大于中性,这与本研究结果一致,但酸性组分数目与本试验所得结果有所差异,这可能与枣品种不同、采用洗脱液浓度或填料不同等有关。

本研究中,采用适用分离多糖的分子量范围为1×103-2×105的HW-55S凝胶色谱柱,其分离纯化效果理想,所得组分均为单一对称峰,证实了各多糖组分为均一多糖。相比目前枣多糖纯化常用的Sephadex等凝胶柱,HW树脂填料为改性的聚甲基丙烯酸酯,具有更好的耐压性能,适合枣多糖纯化使用。

GC-MS综合了GC灵敏度高、分析速度快和MS鉴别能力强的优点,适用于灵武长枣果实多糖的分析。通过将多糖各级分中单糖的出峰时间与各种标准单糖的出峰时间对照,及NIST谱库对照,并根据各单糖的回归方程对多糖各级分组成进行定性和定量分析,结果准确可靠。研究表明,中宁地区果实阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等单糖的含量均是随果实生长发育逐渐增高,但不同地区或不同发育时期之间,糖醛酸含量变化差异较为明显,不同地区灵武长枣果实多糖的单糖组成差异主要在于阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和糖醛酸的动态变化。王东营[21]研究滩枣多糖时,发现滩枣多糖的单糖组成、以及阿拉伯糖含量最高的研究结果与本实验研究结果相似,也与灵武地区果实的研究结果基本接近。但石浩等[22]发现糖枣中木糖醇、葡萄糖、半乳糖所含比例较高,赵智慧等[23]发现金丝小枣主要组成为半乳糖醛酸,这些研究结果与本实验结果有差异。并且,中宁地区和灵武主产区不同发育时期果实多糖中均不含有果糖,但金丝小枣和冬枣果实多糖中却含有果糖,且果糖含量在各发育时期均高于其他单糖[24]。不论是中宁地区还是灵武地区,不同发育时期果实多糖中单糖含量虽各不相同,但单糖组成种类相同,而金丝小枣和冬枣果实多糖中单糖的种类随果实发育呈递增趋势[24]。这些研究结果的差异不仅与枣种类有关,还可能与产地、多糖提取方法、单糖成分分析手段等有关。

总之,中宁和灵武地区虽同处黄河中上游地区,但其地理位置和所处的环境存在一定的差异。生长于两地区的灵武长枣果实多糖含量的变化趋势、多糖级分数目和含量以及多糖中单糖的组成等,在不同发育时期既存在差异也存在相似或相同。导致同一品种不同产地的果实多糖产生差异的因素,可能是因为宁夏不同地区间土壤、水分存在一定的差异,呈现较大的不均衡性; 除此之外,气温、地温也是枣树生长的2个重要环境因子,湿度的调控对枣树的生长也极为重要; 其次光照等因素对枣树的生长和产量影响也很大。这些可能是导致宁夏不同地区灵武长枣品质差异的重要因素,还需要在以后的实验中明确各种因素影响灵武长枣果实多糖中单糖组成的深层次机制,进而调控果实品质。

4 结论

不同发育时期宁夏中宁地区灵武长枣果实各精制多糖总共含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10种单糖,不含果糖,以阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、糖醛酸含量较高,岩藻糖、葡萄糖含量次之,木糖、甘露糖含量较低,但其含量各组分有差异。

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