氮素是限制植物产量最主要的元素。虽然豆科植物既可以利用根瘤固定的氮，也可以利用根系吸收的氮，但是当土壤中氮素含量较高时，根瘤的数量、发育和固氮活性会受到抑制，造成共生固氮效率的下降，即“氮阻遏”效应^[1-2]。目前，关于高氮对豆科植物结瘤固氮的抑制作用已有大量文献报道，但其中的分子机制仍有待进一步明确。阐明高氮抑制豆科植物结瘤固氮的机制对挖掘豆科植物的固氮能力，减少氮肥的投入以及增加豆科植物的产量等具有重要意义。

1 豆科植物与根瘤菌的共生固氮

根瘤的形成包括宿主植物与根瘤菌间信号识别、侵染线形成、根瘤原基形成以及根瘤成熟等一系列复杂的过程。宿主植物首先分泌类黄酮化合物，根瘤菌释放结瘤因子（Nod factor，NF），植物根系接收NF信号后，产生一系列早期结瘤信号反应，包括Ca²⁺流入、Ca²⁺振荡等。与此同时，根的皮层细胞开始分裂，根瘤菌通过侵染线进入根皮层形成根瘤原基，进而形成根瘤^[3]。

固氮作用主要发生在成熟根瘤的类菌体内，由固氮酶将氮气转化为NH₄⁺。根瘤菌的固氮作用是一个耗能的过程，所需碳源由蔗糖提供，蔗糖在叶片中合成并通过韧皮部运输到根瘤中，根瘤中的蔗糖分解代谢为己糖后，进一步通过糖酵解代谢产生磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。随后，PEP可羧基化为草酰乙酸，草酰乙酸可被苹果酸脱氢酶还原为苹果酸。根瘤菌利用碳源固氮的反应式为：N₂+8H⁺+8e^-+16ATP↔2NH₃+H₂+16ADP+16Pi^[4-5]。

2 高氮抑制结瘤的机制研究进展

豆科植物与根瘤菌形成共生体——根瘤，这种互利模式有利于豆科植物在氮素营养不足的土壤中生存。但是，根瘤的固氮作用需要消耗植物自身的碳源，为了维持碳氮平衡，豆科植物在长期进化过程中发展出了一套负反馈调节机制，使已经形成的根瘤能够抑制新的根瘤的形成，被称为结瘤自主调控机制（Autoregulation of nodulation，AON）^[6-8]。AON被认为由根起源和茎起源的两类长距离信号分子组成，该途径涉及根-茎之间的长距离信号交流，并与早期NF信号紧密相连。豆科植物的根响应NF信号并产生信号分子转移到茎中；同时，茎中也产生信号分子并转移到根中，限制进一步结瘤^[9]。百脉根的har1、大豆的nark、苜蓿的sunn等突变体都呈现超结瘤表型，但根的生长受到抑制^[10]。这是一种茎特异性的信号调节模式。这类基因都编码一类富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶（LRR receptor-like kinase）。

过去的研究表明，AON途径参与了高氮对结瘤数量的抑制。nark/har/sunn突变体在高硝酸盐下仍表现出超结瘤表型^[10-11]。AON中的CLE信号肽基因不仅对根瘤菌侵染有响应，而且对硝酸盐也有响应^{[8, 12-13]}。在百脉根（Lotus japonicus）中，klv^[14]和tml^[9]突变体也表现出高浓度硝酸盐下根瘤数量的显著增加。基于以上研究结果，推测硝酸盐调控结瘤的分子机制涉及一个类似于AON的系统^{[9, 15-16]}。然而，AON途径突变体在高氮条件下，虽然结瘤数量增加，但根瘤发育及固氮活性仍受到显著抑制^[16-17]。说明仅AON途径不足以完全解释高氮抑制结瘤的机制，可能还存在其他机制的参与。

结瘤调控因子NIN（Nodule inception）的同源蛋白NLP（NIN-Like Protein）包括3个保守结构域：负责硝酸盐响应的N末端结构域、RWP-RK的DNA结合结构域和参与蛋白质-蛋白质相互作用的PB1结构域^[18]。在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中发现一个nlp1突变体，其根瘤数量和发育对硝酸盐不敏感。NLP1通过核-质穿梭响应并传递硝酸盐信号，NLP1响应硝酸盐进入细胞核，通过PB1结构域与NIN形成复合体，抑制NIN对下游CRE1和NF-YA1等基因的激活，最终抑制根瘤的形成及氮素的固定。当环境中存在充足硝酸盐时，NIN的表达受到抑制，同时NLP1（和其他NLPs）进入细胞核，与NIN形成复合体，和NIN竞争结合位点，抑制NIN对下游基因的激活，最终无法形成根瘤^[19]。在百脉根（L. japonicus）中，也发现了与苜蓿（M. truncatula）类似的机制。NRSYM1基因编码NLP转录因子，以硝酸盐依赖性方式直接与CLE-RS2启动子上的NBS/NRE结合^[20-21]。NRSYM1与NIN可能存在拮抗机制，用于调控其共同靶基因的表达。在高氮条件下NRSYM1定位于细胞核^[20]，推测NRSYM1可能被硝酸盐依赖的核定位机制激活并直接调节CLE-RS2的产生，从而通过AON途径负调控结瘤数目^[22-24]。以上研究揭示了NLP基因家族在硝酸盐抑制共生结瘤过程中的重要作用，为提高豆科植物应对“氮阻遏”奠定了理论基础。

植物激素对于结瘤也具有重要的调节作用。乙烯是结瘤的负调控因子。蒺藜苜蓿（M. truncatula）中乙烯信号转导蛋白突变体表现出超结瘤表型^[25]。在苜蓿中高氮可增强根中乙烯的产生；此外，高氮对根瘤形成的抑制作用可以通过乙烯生物合成的抑制剂氨基乙氧基乙烯基甘氨酸AVG部分地抑制^[25]。此外，在百脉根中，参与细胞分裂素降解的细胞分裂素氧化酶脱氢酶3的突变会增强硝酸盐对结瘤和固氮的抑制作用，这表明高氮抑制结瘤固氮过程可能与细胞分裂素活性有关^[26]。

3 高氮抑制根瘤固氮活性的假说争议及研究进展

成熟根瘤的固氮活性受到环境中氮素的可逆抑制^[27]，与氮素抑制根瘤数量及发育的研究相比，固氮活性受氮素调节的机制仍知之甚少。关于高氮抑制根瘤固氮的原因，人们提出了许多假说，其中亚硝酸盐毒性和碳饥饿两种假说较为人知，但仍存在争议。

3.1 高氮对根瘤固氮的亚硝酸盐毒性假说

根瘤中的硝酸盐代谢在高氮抑制固氮酶活过程中发挥重要作用。硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐可能对细胞产生毒性。此外，亚硝酸盐进一步代谢产生一氧化氮（NO）^[28]。豆血红蛋白（Leghemoglobin，Lb）对NO的亲和力高于对氧气O₂的亲和力^[29]。因此，Lb-NO的形成可能抑制O₂向根瘤菌的供应^[30]。在用硝酸盐处理的大豆根瘤中发现了Lb-NO的形成^[31]。外源添加硝酸盐增加了百脉根根瘤中NO的产生，并且NO参与高氮对根瘤固氮活性的抑制^[32]。豌豆（Pisum sativum）硝酸还原酶缺陷型突变体减弱了高氮对根瘤固氮活性的抑制作用^[33]。因此，亚硝酸盐毒性假说认为，氮素经过氮同化及代谢产生亚硝酸盐是导致根瘤固氮活性受抑制的主要原因^[34]。

然而，利用硝酸还原酶缺乏的根瘤菌突变体开展研究却得到了与上述假说相矛盾的结果。在接种上述突变体根瘤菌的根瘤中检测不到亚硝酸盐，或只能检测到很低水平的亚硝酸盐，不足以对固氮活性产生抑制作用^[35]。然而根瘤的固氮酶活仍显著降低，说明根瘤中亚硝酸盐的积累与固氮酶活性的下降之间可能并没有直接的因果关系。Sprent等^[36]也提供了与亚硝酸盐毒性假说相矛盾的证据。大豆根瘤皮层或木质部中的硝酸盐在短期（≤3 d）内不能被输送到根瘤侵染区。因此，侵染区由于缺乏硝酸还原酶的底物，不能产生亚硝酸盐。所以亚硝酸盐毒性假说仍存在争议。

3.2 高氮对根瘤固氮的碳饥饿假说

碳饥饿假说认为，高氮导致根瘤中碳分配减少，碳供应不足导致根瘤固氮活性下降^{[27, 37-38]}。研究发现高氮对水培大豆根瘤生长和固氮酶活的抑制作用，与根瘤中光合同化物的减少相一致。铵态氮、尿素、谷氨酰胺和硝酸盐处理的大豆，¹³C在根瘤中的分布相对较低，根瘤中光合碳供应的减少可能抑制了根瘤生长和固氮酶活。因此大豆可能通过改变根瘤和根之间光合同化物的分配来调控根瘤生长和固氮酶活。最近的转录组和代谢组分析显示，硝酸盐处理促进大豆根系中的碳氮代谢，而根瘤中的碳氮代谢被抑制。推测硝酸盐促进了根系的碳利用，从而减少了碳向根瘤的运输。碳供应的减少除了可能影响能量和碳骨架代谢外，也可能减少氧气向根瘤的扩散^[39]。将豆科植物暴露在硝酸盐中，根瘤中碳水化合物的分配减少，而其他植物器官中碳水化合物的分配增加。根瘤中碳的减少导致根瘤缺乏固氮所必需的还原剂、ATP和碳骨架，这可能是根瘤碳饥饿抑制固氮酶活的主要原因。

高氮对根瘤固氮的碳饥饿假说主要依赖以上研究的生理实验证据。然而，以上证据难以证明，碳分配减少与固氮活性降低之间的因果关系。首先，很难（或不可能）确定豆科植物暴露于硝酸盐后碳水化合物在根瘤中的减少是固氮酶活下降的原因。研究人员试图通过观察硝酸盐抑制固氮酶活时，代谢物的变化来解释这一问题。淀粉浓度下降是根瘤碳饥饿的一个指标^[40]。Vessey等^[41]证明大豆固氮酶活下降的同时，根瘤中淀粉（而非可溶性糖）浓度也开始下降（暴露在硝酸盐中24 h内）。在菜豆（Phaseolus vulgaris）和豌豆（Pisum sativum）中类似的试验获得了相反的结论。根瘤固氮酶活的下降并不影响淀粉浓度的变化。豌豆与大豆植株暴露于硝酸盐后，根瘤中的苹果酸和琥珀酸等有机酸浓度增加。这些结果表明，暴露在硝酸盐中并不会使根瘤中的碳骨架失去固定氮的辅助作用，也不会使有机酸失去活性。因此，如果根瘤中的碳饥饿是硝酸盐抑制固氮酶活的一个原因，那么它必须通过另一种机制，而不是碳饥饿假说中提出的机制。

4 合理施氮，节本增产

豆科植物有3种氮来源，即土壤氮素、施加氮肥和根瘤固定大气中的氮，三者之间既相辅相成，又相互制约，共同为豆科植物提供生长发育所需要的氮素营养。以豆科作物大豆为例，在大豆生育早期，氮素主要来自土壤，接着肥料氮也开始起重要作用，从生育中期以后，共生固定的氮在总摄取量中所占的比例越来越大；相反，土壤氮和肥料氮所占比例呈下降趋势。研究表明，大豆植株所吸收的土壤氮和肥料氮较多地进入了营养器官，而根瘤共生固定的氮较多的分配在结实器官中^[42]，也就是说，根瘤所固定的氮更多的集中在大豆籽粒之中，大豆在营养生长与生殖生长并进时期，提高根瘤固氮的能力，有利于对大豆籽粒的形成，最后达到高产。

虽然共生固氮是固氮效率最高的一种生物固氮形式，但共生固氮仅能满足豆科植物50%左右的氮素需求，特别是在豆科植物生长过程中的苗期和成熟期，在苗期，共生固氮系统尚未完全建立，而成熟期共生固氮系统又开始逐渐衰亡，因此这两个时期尚需补充额外氮源^[43]。在大豆生长生育前期，根系结瘤较少，生物固氮能力较弱，而土壤氮素及肥料氮素则成为大豆植株各营养器官最主要的氮素来源，因此大豆苗期可适量施氮肥，控制前期生长过于旺盛。随着生育时期的推进，大豆根系结瘤逐渐增多，根瘤固氮能力也逐渐提高，此时，无需额外施加氮肥。在大豆生长发育后期，尤其是生殖器官形成阶段追施氮肥，可促进后期干物质的快速积累及向荚果中的转化，明显增加大豆产量^[44]。相反，施加过高浓度的氮肥或在大豆生长发育不必要的阶段施入氮肥，不仅降低根瘤联合固氮效果，而且也会降低大豆产量^[45]。若在大豆整体生长过程中出现氮素供应不足，未能满足大豆氮素需求，就会产生氮素由叶片向籽粒转移的状况，从而降低光合作用能力，降低大豆产量^[46]。因此，在农业生产中合理调整施氮时期及施氮量，才能达到节本增产的效果。

5 展望

高氮抑制豆科植物结瘤的多样性导致高氮抑制结瘤机制的复杂性，不论是豆科植物AON途径还是植物激素途径都不足以完全阐明高氮抑制结瘤的机制。高氮抑制固氮活性的具体机制尚不明确，人们提出的亚硝酸盐毒性和碳饥饿两种假说仍存在争议。氮肥的过量施用会抑制豆科植物的结瘤固氮，使豆科植物不能发挥出全部的固氮能力。因此，更详细系统地理解高氮抑制豆科植物结瘤固氮的分子机制，可以更好地调控共生固氮，从而有效利用空气中的氮素，减少或避免氮肥的抑制，增加豆科植物的氮同化和氮摄取，增加豆科作物产量的同时，改善土壤结构与环境，这对农业生产有着极其重要的理论和指导意义。