2. 宁波市海洋与渔业研究院, 宁波 315103;
3. 象山县海洋与渔业局, 象山 315711)
2. Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute, Ningbo 315103;
3. Xiangshan County Ocean and Fishery Bureau, Xiangshan 315711
大黄鱼(Larimichtys crocea)是我国重要的海水养殖鱼类。近10多年来, 随着人工繁育、网箱养殖等难关的突破, 大黄鱼人工养殖得以迅速发展。2014年我国年产大黄鱼12.79×104t, 为海水养殖鱼类之最[1]。
随着大黄鱼养殖规模的扩大, 养殖环境污染及病害问题相继出现, 成为阻碍大黄鱼产量提高、产业稳定发展的主要障碍[2]。目前引起大黄鱼的细菌病害主要有哈维弧菌(Vibrio harveyi)等弧菌引起的肠炎和溃疡病[3]、柱状屈挠杆菌(Flexibacter sp.)引起的细菌性烂鳃[4]、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)所致的诺卡氏菌病[5]、杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)引起内脏白色结节病等[6]。细菌病发生范围广, 造成损失大, 并可与刺激隐核虫、虹彩病毒等病原并发, 加剧大黄鱼大量死亡[7]; 抗生素的长期使用可引起鱼体正常菌群失调, 导致药物残留、诱发耐药性菌, 对人体健康构成威胁。
微生态制剂作为替代抗生素的绿色添加剂得到广泛的重视[8-9]。酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、硝化细菌和反硝化细菌等已在水产养殖中取得应用[10]。益生菌及产物还具有加速水产动物生长、提高饲料利用率、改善宿主健康状况、维持微生态平衡等作用。目前所用的有益微生物多为人用或兽用来源, 直接从海水养殖环境来源分离菌株较少。为寻找高效安全的大黄鱼用有益微生物, 为大黄鱼细菌病防治提供更加安全有效的制剂, 实验室对大黄鱼及周边环境进行了拮抗菌株分离、筛选, 并对具抑菌活性菌株进行了鉴定, 对有较高抑菌活性菌株进行了最小抑菌浓度、抑菌谱及理化因子对抑菌活性影响及分离菌株的小鼠毒性、大黄鱼毒性等测定。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器生化培养箱SPX-150B-Z购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂; 酶标仪SPECTRAmax i3x购自美谷分子仪器(上海)有限公司; 高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司; Nano-100微量分光光度计、生物样品均质仪Bioprep-24为杭州奥胜仪器有限公司产品。
1.1.2 试剂和菌株营养肉汤、营养琼脂、细菌琼脂粉、TCBS培养基购自北京路(陆)桥技术有限责任公司; 纸片法抑菌活性测定采用双圈定性滤纸, 自行打孔制备6 mm纸片, 灭菌后备用; 革兰氏染色液、芽孢染色液购自杭州滨河微生物试剂有限公司; 16S rRNA扩增通用引物27F/1492R、gyrB引物up-1s/up-2Sr等由华大基因合成; 1 kb DNA Ladder, 100 bp DNA Ladder购自北京全式金生物技术有限公司。
用于抑菌测定的指示菌为本实验室分离保存的哈维弧菌Lc-1601和杀香鱼假单胞菌Lc-1604, 其他抑菌谱测定菌株, 详见表 1。
用于拮抗细菌分离的鱼、海水、土壤、藻类和芦苇等样品采自宁波市海洋与渔业研究院横马基地大黄鱼池及养殖池周边, 部分样品采自宁波大学校内草坪和校内小河土壤。
海水鱼无菌解剖, 取肠道于1.5%NaCl营养琼脂(Nutritient agar, NA)划线分离; 海水样品直接划线分离细菌; 池底土壤用1.5%无菌盐水稀释10倍后1.5%NaCl NA划线; 海水藻类、芦苇无菌剪至0.2-0.3 cm大小, 置于1.5 mL灭菌EP管, 均质仪研磨2-3 min, 同上划线。上述分离物于28℃培养24 h, 用灭菌牙签挑取代表性单菌落, 接种于预涂布杀香鱼假单胞菌Lc-1604及哈维弧菌Lc-1601为指示菌的NA, 28℃培养24 h, 观察并挑取有明显抑菌圈的菌株, 半固体营养琼脂管穿刺培养后暂存, 用于后续分析。
1.2.2 拮抗菌株的鉴定挑取拮抗活性菌落, 制成菌涂片, 分别进行革兰氏染色和芽孢染色, 风干后封片镜检。
取抑菌圈明显的拮抗菌, 用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增[11], 模板采用水煮沸法[12], 扩增条件为:94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 55℃退火45 s, 72℃延伸2 min, 30个循环; 72℃延伸10 min; gyrB引物up-1s/up-2Sr[13]对NBlm-36进行扩增, 反应条件:95℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 63℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 30个循环; 72℃延伸10 min, 电泳确认目的片段大小[14], PCR产物由华大基因测序, 所获序列与NCBI进行同源性比对, 获测试菌株分子鉴定结果。
1.2.3 拮抗活性菌抑菌谱测定挑取抑菌效果明显的NBPa-7、NBlm-36测定抑菌谱。
纸片抑菌法(K-B法):取28℃振荡培养18 h的指示菌200 μL, 加至20 mL 50℃1.5%NA中, 制备含菌平板备用。拮抗菌28℃振荡培养18 h, 12 000 r/min 30 min离心, 取上清液30 μL加至灭菌滤纸片, 将晾干滤纸片贴至含指示菌平板, 28℃倒置培养24 h, 记录抑菌结果。
最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentra-tion, MIC)测定:96孔板培养法各孔加入营养肉汤(NB)100 μL, 首孔加入拮抗菌上清100 μL, 两倍稀释法稀释至1/32, 加入指示菌液20 μL(2.0×109 CFU/mL), 28℃培养24 h, 以抑制指示菌生长的最小稀释度为其MIC[15]。
1.2.4 抗菌活性物质的稳定性测定 1.2.4.1 抗菌活性物质的pH稳定性拮抗菌NBPa-7、NBlm-36上清(1.5)以pH3.8、5.0、6.2、7.4和8.6不同pH缓冲液28℃水浴处理1 h, 用缓冲液调回pH 7.0, 以各pH处理组缓冲液为阴性对照, 以未处理的上清液为对照; 按1.5测定不同pH缓冲液处理拮抗菌上清对指示菌的MIC。测定孔细菌生长按OD600值测定, 抑菌率按下式计算:
抑菌率=(A-A1)/A×100%
式中, A为加无拮抗菌上清(不加对照组)OD600值, A1为加拮抗菌上清的OD600值。
1.2.4.2 抗菌活性物质的耐热性取NBPa-7、NBlm-36上清100 μL, 40、60、80和100℃水浴处理1 h、121℃高压灭菌30 min, 处理后上清按1.5微孔板法测定不同温度处理的拮抗物对指示菌MIC。
1.2.5 拮抗菌NBPa-7、NBlm-36对小鼠的毒性NBPa-7、NBlm-36菌株28℃液体培养18h, 麦氏比浊管测定菌浓度, 生理盐水稀释至2.0×109 CFU/mL; 腹腔注射5周龄ICR小鼠; 同时以灭菌牛奶稀释菌液至2.0×109 CFU/mL, 以0.05 mL、0.025 mL/只剂量口灌5日龄新生鼠, 实验鼠每日测量体温、观察反应。
1.2.6 拮抗菌NBPa-7、NBlm-36对大黄鱼的毒性将28℃培养18 h的NBPa-7、NBlm-36菌液用麦氏比浊管测定浓度, 用生理盐水稀释至2.0×109 CFU/mL。腹腔注射当年大黄鱼(50±5 g)0.15 mL, 使大黄鱼注射剂量为3.0×108 CFU/尾, 对照组注射等体积生理盐水; 每组20尾, 试验鱼养殖于50 L水族箱中, 实验水温为25℃, 试验期间用气汞充气, 按体重1%每日投喂大黄鱼颗粒饲料, 每2 d按水体30%换过滤海水。共养殖2周, 观察记录异常和死亡。
2 结果 2.1 活性菌株的分离与鉴定对从鱼肠道、藻类、芦苇根、土壤等处选取的38个单菌落进行抑菌性测定, 共获10株对大黄鱼致病菌株有抑制活性的菌株(图 1)。16S rDNA序列鉴定, 分别为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、异常球菌(Daenococcus sp.)等(表 2)。
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| 图 1 活性菌株初筛结果 |
对抑菌活力较强的NBPa-7、NBlm-36进行了NCBI的16S rDNA基因序列比对和系统发育树分析。结果(图 3)表明, NBPa-7与登录号粪产碱菌(A. faecalis)GQ856253.1聚为一支, 同源性为99%, 结合NBPa-7菌落和菌体形态(图 2-A, 2-B), 将NBPa-7鉴定为粪产碱菌; NBlm-36 16S rDNA序列比对归为芽孢杆菌(图 3-D), 根据该菌解旋酶(gyrB)基因[16]序列比对结果和系统发育树分析(图 3-B、3-E)[17], 与登录号HF563562.1的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)同源性高达97%, 结合NBlm-36菌落和菌体形态(图 2-C, 2-D), 鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。
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| 图 2 菌落和菌体形态 A、B：NBPa-7 菌落/菌体（×100）；C、D：NBlm-36 菌落 / 菌体（×100） |
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| 图 3 NBPa-7、NBlm-36分子鉴定、系统发育树分析 A、B：16S rDNA、gyrB 电泳图；C：NBPa-7 16S rDNA 基因；D、E：NBlm-36 16S rDNA 基因、gyrB 基因 |
纸片法测试NBPa-7、NBlm-36对7种大黄鱼病原菌的抑菌谱, 结果(表 3)表明NBPa-7对溶藻弧菌有良好抑菌效果, 抑菌直径为2.32 cm; NBlm-36对哈维弧菌有一定效果, 抑菌直径为0.8 cm; NBPa-7、NBlm-36上清液倍比稀释法稀释1至1/32, 检测对指示菌的抑菌活性, 结果见表 4, 表 5。
NBPa-7、NBlm-36上清pH为7, 以pH7时的上清液作为对照, 比较NBPa-7、NBlm-36上清经不同pH处理的抑菌活性, NBlm36在pH3.8-8.6范围内较为稳定; NBPa-7 pH6.2处理抑菌活性比对照增加46.77%, 经酸性和碱性pH处理均可提高抑菌活性(图 4)。
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| 图 4 NBPa-7、NBlm-36上清对不同pH的稳定性 |
比较不同温度处理NBPa-7、NBlm-36后上清液抑菌活性(图 5), 以28℃处理的上清液作为对照组, NBPa-7上清40℃处理后, 抑菌活性有所上升, 比28℃抑菌活性增长20.39%, 60℃、80℃和100℃处理1 h后抑菌率分别下降59.79%、64.85%和65.08%, 121℃全部失活; NBlm-36上清经40℃、60℃、80℃和100℃处理后, 抑菌率下降分别为1.36%、6.92%、47.57%和73.48%, 121℃处理全部失活。
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| 图 5 不同温度对NBPa-7、NBlm-36上清抑菌活性的影响 |
将稀释为2.0×109 CFU/mL的NBPa-7、NBlm-36菌液以0.05 mL, 1.0×108 CFU/ind腹腔注射5周龄ICR成年鼠, 同时以1.0×108 CFU/ind口灌5日龄新生鼠。48 h内, 小鼠体温、行为均未观察到异常, 48 h后解剖注射和口灌小鼠, 成年鼠(图 6-A、6-B)和新生鼠(图 6-C、6-D)内脏器官未发现明显病变, 心、肝细胞分离未出现细菌、血片镜检; 检查新生鼠瑞氏-姬姆萨染色血片, 与对照鼠比, 白细胞数量未出现明显变化(图 7)。
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| 图 6 小鼠解剖和内脏检查 A、B：成年鼠 adult mice；C、D：新生鼠 newborn rat |
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| 图 7 新生鼠血细胞镜检图（×40） A：NBPa-7；B：NBlm-36；C：对照 |
用NBPa-7、NBlm-36菌液以3.0×108 CFU/尾剂量腹腔注射大黄鱼, 大黄鱼注射NBPa-7和NBlm-36菌液后, 15 d内累计死亡率达分别为20%和25%, 盐水注射组死亡率20%, 检验结果表明P > 0.05, 无显著性差异(表 6); 解剖死亡病鱼, 肝、脾、肾无明显病变, 1.5%NaCl营养琼脂未从注射菌体的脏器分离到粪产碱杆菌菌株与解淀粉芽孢杆菌菌株, 表明NBPa-7、NBlm-36不能在血液和内脏中定植。取腹腔注射菌体一周后大黄鱼, 制备血片后用瑞氏-姬姆萨染色, 观察血液中白细胞比例, 大黄鱼白细胞比例比对照有所升高。初步表明两株拮抗菌不会在大黄鱼体内增殖, 引起病变和死亡。
本研究以大黄鱼主要致病菌哈维弧菌及杀香鱼假单胞菌为指示菌, 对大黄鱼养殖区域周边环境进行了细菌分离和拮抗菌株筛选, 共获得10株活性菌, 16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、碱性杆菌(Alcaligenes sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、异常球菌(Daenococcus sp.)。对具较强抑菌活性的NBPa-7和NBlm-36进行了16S rDNA、gyrB基因同源性比对及系统发育分析, 结合菌体形态鉴定, NBPa-7和NBlm-36分别鉴定为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
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| 图 8 注射NBPa-7、NBlm-36大黄鱼内脏和血细胞镜检图 （Wright-Giemsa Staining，×100）；A/C/E：大 黄 鱼 解 剖，A：注 射 NBPa- 7/C- 注射 NBlm-36/E- 注射生理盐水；B/D/F：大黄鱼血片（瑞氏 - 姬姆萨染 色，×100），B：注射 NBPa-7/D- 注射 NBlm-36/F- 注射生理盐水 |
测试了NBPa-7、NBlm-36对7种大黄鱼常见病原菌的抑菌谱。粪产碱菌NBPa-7对溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌均有良好抑菌活性, 抑菌圈分别为23.20 mm和12.00 mm; 40℃可促进NBPa-7上清的抑菌力, 增长20.39%;60、80和100℃处理, 抑菌率下降59.79%、64.85%和65.08%, 121℃全部失活; NBPa-7上清对酸性和碱性pH处理可提高抑菌活性30.00%左右。解淀粉芽孢杆菌NBlm-36上清40-60℃处理, 抑菌率仅下降1.36%-6.92%, 80℃和100℃处理抑菌率下降47.57%和73.48%, 121℃处理全部失活, 表明其具有较好的耐热性; 同时NBlm36对pH3.8-8.6有较好稳定性, 这些特性使得解淀粉芽孢杆菌NBlm-36在水产上有良好的应用潜力。粪产碱菌(A. faecalis)是环境中广泛分布的菌, 文献报道可产生多种活性物质, 还具有分泌一种对线虫具有毒杀作用的丝氨酸蛋白酶(Extracellular serine protease, Esp)[18]。本研究分离的粪产碱菌源于养殖塘边芦苇, 其相关活性物质有待于进一步研究。
芽孢杆菌耐热、耐旱、耐紫外, 在各类恶劣环境中有较强的生存力, 可产生低分子肽、细菌素、类细菌素及活性蛋白等多种抗菌物质[19]和丰富的酶成分, 是益生菌制剂常用的菌株, 用于抑制各类病原菌, 改善肠道功能[20]。解淀粉芽孢杆菌可用于植物真菌病防控、假单胞菌、弧菌等海洋污损细菌的抑菌[21], 对病毒也有一定的抑制作用[22-25], 是重要的生防拮抗菌。本研究表明解淀粉芽孢杆菌NBlm-36对大黄鱼源创伤弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌以及其他来源大肠杆菌、葡萄球菌均有良好抑菌效果, 抑菌谱广泛。NBlm-36胞外产物对温度和pH的广泛耐受性, 使得该菌株或活性物质有良好的应用前景。
为评估分离拮抗菌的安全性, 本研究用ICR小鼠注射和新生鼠口灌的方法测定了NBPa-7和NBlm-36菌株对小鼠及大黄鱼的安全性, 以1.0×108 CFU/ind腹腔注射5周龄小鼠和口灌5日龄乳鼠, 表明对小鼠体未产生致病性, 未对小鼠淋巴细胞等产生异常变化, 实验结束后未在小鼠体内发现拮抗菌株的繁殖, 表明分离菌株对小鼠无致病性, 有良好的安全性。
NBPa-7、NBlm-36以3×108 CFU/尾注射大黄鱼, 2周内未出现发病死亡, 大黄鱼内脏未发生病变, 白细胞未出现明显升高现象。表明NBPa-7与NBlm-36对小鼠和大黄鱼无致病性, 有较好的安全性。
4 结论从海水养殖环境和土壤中分离鉴定到10株对哈维弧菌和杀香鱼假单胞菌有较强拮抗抑制作用的菌株, 对其中有良好拮抗作用的粪产碱菌NBPa-7和解淀粉芽孢杆菌NBlm-36进行了系统研究, 表明2个菌株对溶藻弧菌、创伤弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌等菌株有良好抑制作用, 抑菌活性物质对酸性和碱性pH、40℃-60℃处理有良好耐受性, 注射和口灌小鼠、注射大黄鱼未发现致病作用和体内增殖, 有较高安全性。上述菌株为大黄鱼细菌性疾病防控提供了一个较好的候选菌株。
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