2. 四川省草原科学研究院，成都 611731;
3. 西藏自治区农牧科学院 省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨 850009
2. Sichuan Grassland Science Academy, Chengdu 611731;
3. State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850009
microRNA（miRNA）是一类长约20-25个核苷酸的非编码小RNA，以互补配对的方式与靶基因转录出的mRNA结合，引导RNA诱导沉默复合物（RICS）清除mRNA[1]或抑制mRNA的翻译[2]，从而影响编码蛋白基因的表达。miRNA最先在秀丽线虫中被发现[3]，广泛存在于哺乳动物、果蝇和植物等生物中。miRNA基因尽管不编码蛋白，但在生物整个生命活动中发挥着重要作用，参与细胞的分裂增殖、分化、生物发育及代谢等多个生物学过程[4]，并在疾病发生发展过程中扮演重要角色。
miR-378最初在人白血病细胞中发现[5]，miR-378家族有许多成员，牛的miR-378（bta-miR-378）家族有3种高度同源的类型：bta-miR-378b（MIMAT0025535）和bta-miR-378c（MIMAT0025551）、bta-miR-370d（MIMAT0036972）。研究表明，miR-378参与各种癌症的多种生物学过程，在前列腺癌、结肠癌、肝癌的研究中miR-378可以抑制癌细胞的增殖和迁移[6-8]，而对肺癌、宫颈癌的迁移和侵袭有促进作用[9-12]。Chan等[13]研究发现，与正常卵巢上皮细胞相比，miR-378在卵巢癌细胞和肿瘤中表达量显著增加，通过调控与血管生成、细胞凋亡和细胞周期调节相关基因的表达，从而促进卵巢癌细胞的侵袭与迁移，可以作为卵巢癌中抗血管生成疗法反应的生物标志物。miR-378在牛的卵泡发育过程中诱导颗粒细胞凋亡，可能参与调控卵泡闭锁[14]，且miR-378可以影响绵羊成肌细胞的增殖[15]。说明miR-378在哺乳动物生长发育过程中的调控功能具有多样性和重要性。然而，miR-378在牦牛生长发育过程中的调控作用及功能尚不清楚。牦牛与普通牛种相比，牦牛生长速度慢、发情期晚、普遍繁殖性能低下，成为高原畜牧业发展及生态保护的主要瓶颈之一。
因此，本实验旨在克隆牦牛miR-378的前体序列，与其它物种的前体序列进行同源性比对和进化分析，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-378在不同组织中的表达特性，基于牦牛和牛属近源物种，结合bta-miR-378-3p靶基因的生物信息学预测和分析，探索miR-378在牦牛卵巢发育过程中的调控功能，旨为miR-378对牦牛繁殖性能的调控研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂与仪器普通PCR仪、CFX-96荧光定量PCR仪（Bio-Rad）、核酸/蛋白质浓度测定仪（NANODROP2000）。
pMD18-T载体，PrimeScriptTM RT逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购自TaKaRa公司；Trizol、DNA提取试剂盒、感受态细胞DH5α和胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；氯仿、异丙醇、75%乙醇（预冷）均购自天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇购自成都海兴化工试剂厂。
1.1.2 样品采集选用西藏自治区昌都市类乌齐县3头4.5岁健康的类乌齐牦牛，屠宰后采集耳组织样品其装入冻存管，并分别卵巢、肝脏、乳腺、大脑、臀脂、臀大肌等组织，DEPC冲洗，锡箔纸包装迅速置于液氮保存，带回实验备用。
1.2 方法 1.2.1 牦牛miR-378前体序列克隆按照DNA提取试剂盒说明书提取类乌齐牦牛耳样的DNA，参照GenBank中牛pre-miRNA-378序列（NC_037334），利用Primer Premier 5.0软件设计PCR克隆引物（上游引物：5' - AGGCTCCGAGAACCAG -3'；下游引物：5' -TTACAGGAAGGACCAGACA -3'），用类乌齐牦牛耳样的DNA作为模板进行PCR扩增，预期扩增片段总长度为378 bp。PCR反应总体系为：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，最后加水至25 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃ 5 min；然后取15 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收DNA片段。将产物与pMD-19T载体连接并转化至DH5α感受态细胞中，Amp+平板挑取阳性菌落，提取质粒后送英潍捷基（上海）生物技术有限公司测序。
1.2.2 miR-378序列保守性分析利用blast将克隆得到的类乌齐牦牛miRNA-378前体序列与人（Homo sapiens，hsa）、小鼠（Mus musculus，mmu）、山羊（Capra hircus，chi）、猪（Sus scrofa，sus）、大猩猩（Gorilla gorilla，ggo）、牛（Bos taurus，bta）的前体序列进行比对，分析其保守性。
1.2.3 牦牛miR-378组织表达谱 1.2.3.1 引物设计与合成根据miRbase数据库公布miRNA序列，采用茎环引物法设计miR-378-3p特异性茎环引物用于反转录和荧光定量表达引物，U6为内参基因（参照张阳阳[16]），引物由英潍捷基（上海）生物技术有限公司合成，具体引物见表 1。
按照PrimeScriptTM RT逆转录试剂盒说明书，由total RNA逆转录成cDNA后进行Real-time PCR反应，反应体系共10.0 μL，包含5 µL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、上下引物各0.4 μL（10 μmol/L）、1.0 μL cDNA模板、3.2 μL R Nase-Free ddH2O。反应条件：95℃变性30 s；95℃，5 s，60℃，30 s扩增，39个循环；每个样品设3个重复。Real-time PCR结果中miR-378-3p的相对表达量采用2-△△Ct公式计算，并用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，显著性用One-Way ANOVA方差分析，进行Duncan检验。数据以x±s表示，P < 0.05为差异显著。
1.2.4 bta-miR-378-3p靶基因预测及生物学功能预测选择TargetScan 7.1（http://www.targetscan.org/vert_71/）、PicTar（https://pictar.Mdc-berlin.de/）2个在线软件预测bta-miR-378-3p靶基因，将两者结果与miRwalk 2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html）上已验证的miR-378-3p靶基因结合作为深入分析的基因集合。将获得靶基因集合导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行Gene Ontology聚类分析及KEGG信号通路富集分析，以所有蛋白编码基因作为背景基因，GO条目与KEGG信号通路均通过Fsiher Exact Test计算P值，以P < 0.01为限制性阈值，分别得到相对于背景具有统计意义的高频率注释或信号转导通路。
2 结果 2.1 牦牛pre-miR-378克隆及保守性分析以类乌齐牦牛耳样的DNA为模板经PCR扩增成功克隆了类乌齐牦牛pre-miRNA-378序列，扩增片段总长度为378 bp（图 1），其中135-200 bp为pre-miRNA-378序列，长为66 bp。
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| 图 1 牦牛miR-378前体PCR产物电泳结果 |
将其序列与人、小鼠、牛等6个物种的pre-miRNA-378及种子序列进行同源性比对，结果如表 2所示，各物种间序列相似性很高，且各个物种之间miR-378-3p种子序列（CUGGACU）完全一致，说明miRNA-378序列有很高的保守性。
通过Real-time PCR方法检测miR-378-3p在牦牛卵巢、乳腺、臀大肌、大脑、臀脂和肝脏中的相对表达量，结果（图 2）显示miR-378-3p在各组织中均存在表达，且在臀大肌中表达水平最高，显著高于其他组织（P < 0.01），在臀脂中的表达高于卵巢、大脑、乳腺和肝脏，在卵巢中表达水平最低。
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| 图 2 牦牛miR-378-3p在不同组织中的相对表达量 *表示极显著（P < 0.01） |
选择TargetScan和PicTar 2种计算方法预测bta-miR-378-3p的靶基因，合并已经证实为miR-378-3p的18个来自miRwalk数据库的靶基因，获得共计316个靶基因作为后续GO和KEGG pathway分析的靶基因集合。其中272个基因具有GO分子注释信息，结果（表 3-表 6）显示bta-miR-378-3p的靶基因富集于细胞分化、细胞发育、大分子代谢及神经元分化等多个生物学过程中，具有与特异DNA序列结合及转录调控活动的分子作用。
在GO注释分类的基础上，利用已有生物通路数据对基因集合中的272个基因进行生物通路富集分析。结果（图 3）显示，bta-miR-378-3p预测靶基因主要参与孕酮介导的卵母细胞成熟、促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信号通路（图 4）、长期抑郁症、癌症途径、Rap1信号通路等信号转导通路。
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| 图 3 孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路 红星代表bta-miR-378-3p预测靶基因集合中的基因 |
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| 图 4 GnRH信号通路 |
图 3是孕酮介导卵母细胞成熟的信号通路，在第一次减数分裂前期自然停滞的卵母细胞在孕酮诱导下停滞被破坏，卵母细胞恢复两个减数分裂周期并发育成熟为可受精的卵子，此过程中胰岛素、IGF1（胰岛素样生长因子1）、MAPK（丝裂原激活蛋白激酶）、孕酮是主要的诱因。
图 4为下丘脑分泌的GnRH（促性腺激素释放激素）调节垂体产生和释放促性腺激素的通路图，此过程伴随MAPK的激活。
3 讨论目前，miRbase（http://www.mirbase.org/）数据库收录的miRNA条目已达38 589条，数以万计的miRNA在人体各类细胞中发挥作用，同一miRNA靶向不同的基因促进或抑制细胞增殖分化，因此，仅仅靠实验手段来研究miRNA已变得相当困难。靶基因数量和种类较多，生物信息学软件的应用在miRNA的研究中必不可缺，TargetScan和PicTar作为第二代预测算法，Target Scan首次引入假阳性率来评价靶基因预测结果，要求miRNA种子序列（第2到第8位核苷酸）和mRNA 3'UTR完全互补，该软件的输入要求是2个以上物种UTR比对后的序列作为输入，由于其要求种子序列完全互补，随着物种数目的增多，其预测靶基因的数量相对减少，但和实验证实的靶基因集合吻合率相应增高。所不同的是PicTar把种子序列分为“完全匹配的种子序列”和“不完全匹配的种子序列”分别进行筛选，PicTar亦结合以前实验数据对两类种子序列对应的miRNA和靶基因二聚体结合能进行了限制，有效降低假阳性率[17]。且TargetScan数据库中包含牛基因，综合miRwalk数据库（2014）中已验证靶标作为靶基因集合进行后续分析，减少假阳性率，靶基因预测软件基于miRNA种子序列与靶基因的3'-UTR进行配对，bta-miR-378-3p种子序列在各物种高度保守，从而保证了后续功能分析的全面和可靠性。
目前研究已证实miR-378在脂肪分化[18]、肌细胞增殖分化[15]、卵巢发育[14]、癌症发生[13]等生物过程中都有重要的调控作用。本实验成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，与其它物种的前体序列进行同源性比对显示序列保守性较高，且牦牛与牛的pre-miR-378序列完全一致，牛是牦牛的近源物种，表明牛该miRNA的研究可为探究牦牛miR-378的调控方式提供参考。
为了进一步研究该基因对类乌齐牦牛的调控功能，本实验利用qPCR方法检测了miR-378-3p在类乌齐牦牛的6个组织中的表达情况，结果显示，miR-378-3p在臀大肌和臀脂中表达水平较高，在臀大肌中表达水平极显著高于其他组织，推测其在类乌齐牦牛肌肉和脂肪中存在重要调控作用。miR-378-3p靶基因GO分析结果显示其与细胞分化、发育、大分子代谢等多个生物学过程相关，已有研究证实在牛骨骼肌发育中，miR-378具有抑制牛肌细胞增殖而促进其分化的作用[19]，达到促进肌管形成的效果[4]，牦牛体格健壮，肌肉组织极其发达可能与miR-378促进肌细胞分化机制有密切联系。过表达miR-378a-3p可以抑制MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）的表达从而促进牛脂肪形成[20-21]，推测miR-378与牦牛肌纤维和脂肪形成有密切关系，从而对牦牛肉质性状和脂肪沉积产生影响。
雌二醇是一种类固醇激素，不仅在卵巢卵泡发育中起重要作用，而且与许多生殖功能紊乱有关，Xu等[22]研究发现猪卵泡颗粒细胞中miR-378靶向结合芳香化酶3’UTR，降低芳香化酶蛋白表达和雌二醇释放。在颗粒细胞中miRNA-378-3p通过靶向PGR（孕酮受体）降低其蛋白质水平和mRNA水平[23]。综合以上研究，表明miR-378对黄体发育、孕激素（孕酮等）和雌激素分泌（雌二醇等）有抑制作用。
本实验中KEGG信号通路分析bta-miR-378-3p靶基因主要参与孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路、促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信号通路、长期抑郁症、癌症途径、Ras相关蛋白1（Ras-proximate-1，Rap1）信号通路。其中孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路、GnRH信号通路在卵巢发育和卵母细胞成熟中发挥重要功能，IGF1、MAPK1、PGR是主要的靶基因。
然而miR-378-3p在本实验牦牛卵巢样品中相对表达量最低，可能由于miRNA表达在实验样品中呈现出时序特异性，牛黄体不同发育期miR-378有明显表达差异[24]：在黄体形成时miR-378的表达量增加到正常水平的5倍，而在黄体退化阶段，表达量迅速下降，猪大卵泡颗粒细胞的miR-378表达量显著低于小卵泡颗粒细胞，表明miR-378在哺乳动物卵巢发育过程中具有一定的调控作用，在母猪正常发情时卵巢miR-378表达量显著低于不发情时期[25]，已有研究证实，miRNA参与调节牦牛卵巢发育过程[26]，且miR-378在各物种间高度保守，实验样品中3头类乌齐牦牛正处于发情期，卵泡发育正常，故卵巢miR-378呈现低表达。根据bta-miR-378-3p功能预测结果继续分析，为进一步探索牦牛miR-378在卵巢组织的表达规律奠定理论基础。
IGFs（胰岛素样生长因子）可启动卵裂，增加致密化和胚泡形成率，是胚胎发育和代谢的重要调节因子之一。IGF1通过调控热休克蛋白709（HSP70）抑制牦牛卵丘细胞凋亡[27]，李莉华等[28]研究miR-378对肝癌细胞生长增殖的影响机制证实miR-378通过降低靶基因IGF1R（胰岛素样生长因子1类受体）的表达发挥抑制作用。miR-378通过下调MAPK1抑制前列腺癌细胞生长[2]。根据下丘脑-垂体-卵巢轴系统：下丘脑通过分泌GnRH调节垂体促性腺激素的释放，从而控制卵巢发育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌，同时，孕酮和雌二醇对下丘脑和垂体具有反馈调节作用。综合以上研究结果推测miR-378-3p可能通过降低靶基因IGF1、MAPK1、PGR的表达负调控牦牛的下丘脑-垂体-卵巢轴系统，抑制卵巢发育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌等生物过程，负面影响母牦牛发情、求偶和接受交配、妊娠，进而降低了母牦牛的繁殖性能。
本实验为了探索miR-378在牦牛生长发育中的调控作用，实时荧光定量PCR检测miR-378-3p在各组织之间表达规律，结合生物信息学软件基于bta-miR-378-3p进行靶基因预测和功能分析。总之，本实验成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，与其它物种的前体序列比对显示序列保守性较高，miR-378-3p在牦牛各组织中均存在表达，且在臀大肌中表达水平最高，在臀脂中的表达高于大脑、乳腺和肝脏，推测miR-378-3p对牦牛肌肉、脂肪形成具有一定调控作用，挖掘出IGF1、MAPK1、PGR等关键靶基因以及孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路、GnRH信号通路等重要信号通路。本实验所得结果为研究miR-378在牦牛中的作用提供重要的基础数据，进一步阐明其作用及分子机制仍需继续进行深入研究。
4 结论本实验成功克隆了pre-miR-378，其与牛、小鼠和山羊pre-miR-378相似性较高，人和大猩猩次之，猪最低。生物信息学分析表明，miR-378-3p可能通过抑制孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路、GnRH信号通路中靶基因IGF1、MAPK1、PGR等的表达调控卵泡的发育、排卵及卵母细胞成熟过程，进而影响母牦牛的繁殖性能，荧光定量PCR检测miR-378在牦牛臀大肌和臀脂中表达水平最高，说明miR-378还参与牦牛肌纤维和脂肪形成。
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