2. 云南师范大学马铃薯科学研究院，昆明 650500
2. Joint Academy of Potato Science, Yunnan Normal University, Kunming 650500
植物泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）广泛存在于真核细胞中，在植物的生长发育、形态形成及抗逆反应等过程中扮演着重要角色[1-2]。泛素-蛋白酶体系统主要由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素蛋白连接酶、蛋白酶体和去泛素化酶组成。通过3种酶先后与靶蛋白结合形成1条多泛素链，将底物蛋白泛素化后，使靶蛋白被26S蛋白酶识别并降解，从而实现对多种代谢过程的调节。其中，E2泛素结合酶是泛素-蛋白酶体系统中的重要组成部分，对蛋白泛素化修饰起关键作用[3]。由致病疫霉菌（Phytophthora infestans（Mont.）de Bary）引起的马铃薯晚疫病严重威胁着全球马铃薯生产安全，严重时导致马铃薯大幅度减产[4]。
Ni等[5]研究发现E3泛素连接酶基因StRFP1受P. infestans、SA、MeJA等诱导表达，在马铃薯抗晚疫病反应中起正向调控作用。稳定超量表达StRFP1增强马铃薯的抗病性，而抑制StRFP1表达促使马铃薯更感病。同样，抑制E3泛素连接酶基因StPUB17表达导致马铃薯抗病性减弱和对盐胁迫更敏感[6]。He等[7]研究证实了马铃薯StPUB17定位于细胞核中，正向调控马铃薯的抗病免疫反应。此外，E3泛素连接酶基因CMPG1也在调控植物免疫方面同样发挥重要作用。CMPG1的沉默大大减弱了抗病基因Cf-9、Cf-4、Pto及P. infestans病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）基因INF1等介导抗病信号传导[8]。另外，E3泛素连接酶基因也可以作为负调控因子参与植物抗病信号传导。如E3泛素连接酶基因POB1负调控植物基础免疫和细胞死亡反应。沉默POB1能够抑制P. infestans的扩展，增强植物对晚疫病的抗性；而瞬时超量表达POB1则促进P. infestans的侵染，且能够抑制Cf4/Avr4介导的细胞死亡[9]。以上研究表明，E3泛素连接酶对植物抗病免疫系统起着重要作用。
有关E2泛素结合酶在植物抗病免疫反应中功能的报道则很少，且相关研究多集中在E2泛素结合酶基因受病原菌诱导表达方面，缺少实质的基因功能研究。如Li等[10]利用cDNA-AFLP法在马铃薯中筛选出一个EST序列受β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）诱导表达，经与NCBI数据库比对发现该EST对应基因为泛素结合酶基因E2-17（GenBank：XM_015307154.1，StUBC17）。刘炎霖等[11]从水茄（Solanum torvum）中克隆得到一个756 bp的泛素结合酶基因（StUBCc），RT-PCR表明StUBCc受黄萎病菌诱导表达。刘鑫等[12]通过生物信息学、RNA-seq和qRT-PCR的方法，分析了水稻泛素结合酶基因家族的特征及其表达模式，发现有超过50%水稻泛素结合酶基因受稻瘟病菌诱导表达。
为了研究E2泛素结合酶是否对马铃薯抗病反应发挥作用，本研究在BABA诱导基础上，从马铃薯栽培种“合作88”（“C88”）中克隆得到E2泛素结合酶基因StUBC17的全长序列并对其进行生物信息学分析。利用病毒诱导的基因沉默技术（Virus-induced gene silencing，VIGS）在本氏烟（Nicotiana benthamiana）上构建了NbUBC（StUBC17同源基因）基因沉默植株，并对其进行晚疫病抗性鉴定。此外，利用农杆菌介导基因瞬时表达技术，在NbUBC沉默植株上共表达马铃薯抗病基因和相应无毒基因及晚疫病菌PAMP基因INF1，为深入研究StUBC17调控马铃薯抗病性的作用机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料马铃薯栽培种“合作88”（“C88”）为云南师范大学马铃薯科学研究院保存。“C88”无菌试管苗在含有4%蔗糖的MS培养基中繁殖，待试管苗生长30 d时将其移栽于温室塑料钵（20 cm×20 cm）中生长，浇水、施肥等按日常管理。将生长两个月健康无机械损伤的叶片用于P. infestans接种。
本氏烟为云南师范大学马铃薯科学研究院保存，种植于恒温生长室内。幼苗移栽后于22℃ 16 h光照/8 h黑暗条件下生长28-35 d，然后进行VIGS沉默和农杆菌注射瞬时共表达试验。
P. infestans生理小种88069（1.3.4.7）和HB09-14-2（1.2.3.4.5.6.7. 9.10.11）由华中农业大学马铃薯实验室馈赠。合作88对P. infestans生理小种88069表现抗病过敏反应，对生理小种HB09-14-2表现感病。菌株繁殖和保存采用黑麦培养基[13]。
1.2 方法 1.2.1 DNA和RNA的提取采用植物基因组DNA提取试剂盒（货号DP305，天根天根生化科技有限公司）提取接种P. infestans后的烟草叶片的DNA，具体步骤见试剂盒说明书。采用Trizol-RNA提取试剂盒（货号DP432，天根天根生化科技有限公司）提取马铃薯叶片总RNA，具体步骤见说明书。提取的RNA于-70℃保存备用。
1.2.2 StUBC17的克隆及序列分析将前人公布的差异表达片段TDF8-11-2（GenBank：EL732271）序列在NCBI网站和茄科基因组数据库（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）上进行BlAST比对，发现TDF8-11-2与马铃薯泛素结合酶E2-17基因（StUBC17）序列相似率高达87%。初步判断该序列表达标签对应基因为StUBC17。根据StUBC17全长序列设计引物（表 1），以“C88”的cDNA为模板，采用Pfu高保真PCR聚合酶（货号：P501，南京诺唯赞生物科技有限公司）进行PCR扩增。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，回收，并与pEASY-T1克隆载体（货号：CT101，北京全式金生物技术有限公司）连接，测序。
采用在线软件HMMER分析蛋白结构域，用Protparam分析蛋白等电点和分子量，用DANMAN软件对StUBC17和其他同源蛋白的氨基酸序列进行比对。
1.2.3 StUBC17在P. infestans诱导下的表达分析马铃薯C88试管苗继代培养1个月后移栽至温室，待其生长50 d左右用于P. infestans生理小种（88069和HB09-14-2）接种。提取经P. infestans处理和无菌水处理（对照）4个不同时间点（0、24、36和72 h）的叶片的总RNA并反转录合成cDNA。每个处理时间点取2片叶片，3次生物学重复。以cDNA为模板，StEF1（GenBank：AB061263）为内参基因，qRT-PCR分析StUBC17受P. infestans诱导表达特性。相关引物见表 1，反应体系参照KAPA SYBR®快速定量PCR试剂盒（货号：KK4601，Kappa Bioscience AS）说明：2×qRT-PCR mix 5 μL、H2O 2.4 μL、左右引物（10 μmol/L）各0.2 μL、50×Rox 0.2 μL和模板2 μL。于ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统上进行反应，反应程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.2.4 VIGS载体构建及基因沉默效率分析用于构建VIGS体系的pTRV2（GenBank：AF406991.1）、含烟草脆裂病毒RNA1片段的pTRV1（GenBank：AF406990.1）及携带八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoenedesaturae，PDS）的病毒载体由华中农业大学马铃薯实验室惠赠。将StUBC17序列经BlAST比对获得本氏烟中的同源基因NbUBC（GenBank：KR296788.1），再以NbUBC序列设计VIGS载体引物（表 1）。
采用LA酶（货号：RR02MA，宝日医生物技术有限公司）从本氏烟cDNA中PCR扩增NbUBC的3'端片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切扩增片段和TRV2载体，回收后分别连接、转化大肠杆菌DH5α。得到的转化子用TRV载体通用引物（表 1）进行PCR检测，筛选成功插入目的片段的阳性克隆并测序。利用电转化法将测序正确的质粒转化到农杆菌GV3101菌株中。阴性对照为重组载体携带外源GFP片段，即TRV-GFP；阳性对照为重组载体携带的PDS片段，即TRV-PDS。
选取3-4叶龄的本氏烟，阴性对照（TRV-GFP）、阳性对照（TRV-PDS）和目标基因（TRV-NbUBC）沉默植株各4株，待阳性对照（TRV-PDS）植株新长出的叶片出现漂白现象时（约25 d），取对照植株（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）顶叶以下第3-第4片叶片，3次生物学重复。分别提取叶片总RNA进行qRT-PCR检测，以NbEF1（GenBank：AY206004）为内参基因。用Excel软件对NbUBC表达量进行t检验（两尾检验），分析差异显著性（**P < 0.01）。
1.2.5 农杆菌介导的基因瞬时表达分析采用Wang等[14]方法，将含有马铃薯抗病基因（R3a、R3b和Rx）、无毒基因（AVR3a、AVR3b和CP）及INF1的农杆菌在LB平板培养基上活化，28℃培养2 d。挑取单克隆接入1 mL LB液体培养基（含50 µg/L Kan和25 µg/L Rif），28℃，200 r/min，培养过夜。取500 µL菌液加入5 mL含相应抗生素YEB培养液中，另加0.5 µL的200 µmol/L乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），28℃，200 r/min，培养过夜。4 000 r/min离心10 min，收集农杆菌沉淀，并加入MMA buffer（10 µmol/L MES，10 µmol/L MgCl2和200 µmol/L AS，pH 5.6），调整农杆菌悬浮液的OD600值约为0.4。
将含马铃薯抗病基因-无毒基因组合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及INF1的农杆菌悬液分别注射3株对照植株（TRV-GFP）和3株基因沉默植株（TRV-NbUBC）顶叶以下第3至第5片叶片，每株注射3片叶片，3次生物学重复。GFP为阴性对照，5 d后观察HR反应。含马铃薯抗病基因-无毒基因组合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌PAMP基因INF1的质粒由华中农业大学马铃薯实验室馈赠。
1.2.6 晚疫病菌接种、病斑面积及菌丝生物量统计参照Vleeshouwers等[13]方法对马铃薯C88和本氏烟进行离体叶片接种。将P. infestans的孢子囊浓度调至约5×104个/mL，4℃下放置2-3 h后用于接种。每片叶片主脉两侧各接种10 µL孢子悬浮液，塑料薄膜密封接种盘，相对湿度95%，温度20℃。
每次接种本氏烟，阴性对照（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）各4株，每株分别取顶叶以下第3、第4片叶片用于P. infestans接种，3次生物学重复。接种5 d后，用游标卡尺测量病斑的长和宽，病斑面积= 1/4×π×长×宽。用Microsoft Excel软件对病斑面积进行t检验（两尾检验），分析差异显著性（**P < 0.01）。
参照llorente等[15]方法对P. infestans生物量进行统计。提取P. infestans（88069）接种阴性对照（TRV-GFP）和沉默植株（TRV-NbUBC）2个不同时间点（0和120 h）的叶片总DNA，每个时间点混合取样（4片叶片），3次生物学重复。以接种后0和120 h的叶片DNA为模板，P. infestans特异基因PiO8和本氏烟内参基因NbEF-1a用于qRT-PCR检测，引物见表 1。用Microsoft Excel软件对P. infestans生物量进行t检验（两尾检验），分析差异显著性（**P < 0.01）。
1.2.7 台盼蓝染色为了更清晰观察接种P. infestans叶片的发病表型，用台盼蓝对发病细胞进行染色。参照Wang等[14]的方法，将接种6 d后的本氏烟叶片浸泡在台盼蓝染液（以100 mL为例：25 mL水饱和酚、25 mL甘油、25 mL乳酸、25 mL水和25 mg台盼蓝）中，浸泡36 h后，用95%乙醇煮沸2 min进行脱色，然后放在50%甘油中保存，自然光照下拍照。
2 结果 2.1 StUBC17的克隆和序列分析基因序列分析表明，克隆得到的StUBC17与NCBI数据库公布的E2-17泛素结合酶（GenBank：XM_015307154.1）基因的序列完全相同。StUBC17编码序列全长为447 bp，编码多肽含有148个氨基酸。StUBC17蛋白预测分子量为16.52 kD，理论等电点为7.72。蛋白功能域分析表明，第5-142位氨基酸区间为泛素结合功能域（图 1-A）。
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| 图 1 马铃薯StUBC17蛋白结构域（A）及与其同源蛋白氨基酸序列比对（B）分析 |
将StUBC17蛋白序列在NCBI数据库中进行BlAST比对（图 1-B），发现StUBC17在番茄（SLUBC17，XM_019214130.2）、辣椒（CaUBC17，XM_016720-450.1）、烟草（NtUBC17，XM_016606733.1）和本氏烟（NbUBC，KR296788.1）中均有同源蛋白，相似性分别为100%、100%、99.32%和99.32%。通过DNAMAN软件对StUBC17及其同源蛋白进行氨基酸序列比对，结果表明，不同泛素结合酶间的泛素结合功能域高度保守。
2.2 StUBC17的表达特性分析对不同接种时间点StUBC17的qRT-PCR分析结果（图 2）表明，在88069和HB09-14-2接种24 h时，StUBC17均上调表达。而在接种后48和72 h，与对照相比，接种88069的C88叶片中StUBC17表达水平无显著变化；接种HB09-14-2的“C88”叶片中StUBC17表达水平虽有所下调，但仍高于对照。
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| 图 2 荧光定量PCR分析马铃薯StUBC17的表达模式 |
检测对照和基因沉默植株中NbUBC的表达量，结果（图 3-A）显示，该基因的mRNA水平均出现不同程度的下降。
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| 图 3 沉默植株的NbUBC的相对表达量及抗性鉴定 **：表示差异达到极显著水平 |
接种P. infestans（88069）5 d后，发现对照植株叶片发病较轻且叶片病斑面积明显较NbUBC沉默植株小（图 3-B，D）。另外，通过qRT-PCR检测发现，NbUBC沉默植株上的P. infestans生物量明显高于对照植株（图 3-C）。结果表明，沉默NbUBC降低了本氏烟对P. infestans的抵抗能力。
2.5 沉默NbUBC不影响R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1介导的HR反应基因沉默25 d后，分别在对照植株（TRV-GFP）和基因沉默植株（TRV-NbUBC）顶叶以下第3至第5片叶片中瞬时表达R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1。表达5 d后，除阴性对照（瞬时表达GFP）外，叶片注射点均呈现HR反应（图 4）。说明沉默NbUBC没有影响R3a-AVR3a、R3b-AVR3b、Rx-CP及INF1诱发的HR反应。
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| 图 4 沉默NbUBC不影响基因对基因的识别 |
BABA能够在马铃薯上诱导产生抗病性[16]，表明BABA具有在植物诱导抗病方面具有重要利用价值。在前人研究的基础上，本研究克隆了一个BABA早期诱导表达E2泛素连接酶基因StUBC17，并对其受P. infestans诱导表达特性和对晚疫病抗性反应中的功能进行了初探。
绝大多数植物防御反应都涉及到泛素-蛋白酶体系统[17]。E2泛素结合酶是泛素-蛋白酶体系统中的重要组成部分，对泛素化修饰的特异性和精确时空性起关键作用[3]。研究表明，E2泛素结合酶广泛参与植物对逆境胁迫的响应途径。如水稻48个E2泛素结合酶基因中，3个基因受干旱和盐胁迫诱导上调表达，7个基因受干旱和盐胁迫诱导下调表达，12个基因受植物激素6-BA和ABA诱导表达[18]。玉米75个E2泛素结合酶基因中，35个基因受盐胁迫诱导表达，22个基因受PEG600诱导表达[19]。在拟南芥中超量表达大豆泛素结合酶GmUBC2基因，可以增强拟南芥耐寒和耐盐性[20]。决登伟等[21]发现玉米泛素结合酶基因ZmUBC-76在盐胁迫和干旱胁迫处理下，表达量下调。与这些报道类似，本研究证明马铃薯泛素结合酶StUBC17可以被生物胁迫因子P. infestans诱导表达。
由于VIGS技术[22]在马铃薯上尚不成熟，而马铃薯和本氏烟同为茄科作物，基因组高度保守，且VIGS技术在本氏烟中较成熟。为了快速、高通量鉴定目标基因对马铃薯抗晚疫病是否有贡献，研究者大多先在本氏烟上利用VIGS技术对目标基因进行功能分析[23-24]。本研究利用VIGS技术初步鉴定NbUBC（StUBC17同源基因）对植物防御P. infestans有一定作用。沉默NbUBC后，沉默植株的抗病性明显减弱。另外，在NbUBC沉默植株上瞬时表达马铃薯抗病基因-无毒基因组合（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌PAMP基因INF1，结果发现抗病基因-无毒基因组合及INF1激发的HR反应并没有被干扰。说明E2泛素结合酶基因NbUBC并不影响R3a、R3b、Rx及INF1介导的HR反应。至于NbUBC是否影响其他抗病基因介导的HR反应有待进一步研究。
4 结论从马铃薯中克隆获得泛素结合酶基因StUBC17，其受P. infestans诱导表达。该基因编码蛋白及其同源蛋白间的泛素结合酶功能域高度保守。在本氏烟上沉默StUBC17同源基因导致植株抗病性下降，且沉默该基因并不影响马铃薯抗病蛋白-无毒蛋白（R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP）及晚疫病菌INF1介导的HR反应。
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