布鲁菌病是全球性人畜共患传染病，可引发家畜(猪、羊和牛)发热、流产及死亡，对农牧经济造成重大的损失并严重威胁人类的健康^[1-2]。Rev.1、S19等减毒菌株是目前可用于控制动物布氏杆菌病的有效疫苗之一，但减毒疫苗存在一定的风险，安全性差^[3]。布鲁菌抗原在激活宿主免疫时，特别是天然免疫的水平较低，不能形成稳定的免疫保护，因此提高蛋白免疫保护水平成为布鲁菌亚单位疫苗的热点^[4]。Denoel等^[5]研究表明胞间质结合蛋白(P39)作为T细胞免疫布鲁菌抗原可诱导Th1导向型的免疫反应，具有较高的免疫原性，因此P39成为很有前景的亚单位候选抗原。

近年来通过糖基化修饰改变蛋白质的生物学活性，提高蛋白免疫保护水平在疫苗领域备受关注，已有部分疫苗应用于临床^[6-8]。有研究表明，通过糖基化修饰后的蛋白可激活宿主TLR4受体系统，提高宿主细胞天然免疫水平，从而提高抗原的免疫保护作用^[9]。

本研究选取可进行糖基化修饰的毕赤酵母表达系统^[10]，对布鲁菌优势抗原蛋白P39进行分泌表达，探究其修饰后对巨噬细胞吞噬的影响。为进一步研究糖基化影响蛋白免疫原性的机理，开发新型糖基化布鲁菌亚单位疫苗提供理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

大肠杆菌Escherichia coli TOP10株购自全式金生物公司(北京，中国)毕赤酵母P. pastoris GS115由山东大学微生物实验室惠赠(山东，中国)、pPICZαA真核表达载体购自Invitrogen公司(长春，中国)、布鲁菌(B.melitensis 16M)DNA由军事医学科学院军事兽医研究所提供。

ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA ligase、EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、Sac Ⅰ、DNA marker均为TaKaRa公司产品(长春，中国)，Zeocin为Invitrogen公司产品(长春，中国)；Protein Find Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、Protein Find Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate购自全式金公司(北京，中国)。PNGaseF糖苷酶购自NEB公司(上海，中国)；PVDF膜、滤纸购自promega公司(上海，中国)，引物合成及基因测序由上海华大基因有限公司完成(上海，中国)。

1.2 方法 1.2.1 毕赤酵母真核表达载体pPICZαA-P39的构建

根据GenBank公布的Brucella melitensis 16M(Ge-nBank Accession ID：WP：087932960)序列，应用DMAMAN及primer 5.0基因分析软件，设计扩增P39基因序列，以布鲁菌基因组为模板进行PCR扩增。上游引物序列gaattc(EcoR Ⅰ)ATGGCACCTGT-TGCCAATGC，下游引物序列gcggccg(Not Ⅰ)TTTT-GCGGCTTCAACCGCC。将胶回收的PCR扩增产物P39基因与pPICZα-A质粒用Eco RⅠ、Not Ⅰ进行双酶切，将酶切后的P39基因片段用T4DNA连接酶连接pPICZα-A载体上，热激法转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。经双酶切鉴定正确后送上海华大基因有限公司测序。

1.2.2 重组蛋白P39的诱导表达

挑取生长在Zeocin抗性YPD平板上的阳性单菌落，接种于5 mL的BMGY液体培养基中，在50 mL三角瓶中培养，28℃、250 r/min摇床培养16-20 h，至OD₆₀₀值约为2.0-4.0，此时酵母菌处于对数生长期。离心收集菌液，6 000 r/min，4℃离心，收集沉淀，重悬于5 mL的BMMY液体培养基，转入50 mL的BMMY液体培养基中，250 mL三角瓶继续震荡培养。每隔24 h加入1%的甲醇进行诱导表达。同时电转化空载体pPICZαA的GS115菌株作为阴性对照。培养96 h后收集样品，10 000 r/min，4℃离心2 min，取上清进行SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。

1.2.3 重组蛋白P39的纯化

将收集好的上清液进行真空冻干，10 mmol/L，pH 7.4的磷酸盐溶液(PBS)透析48 h，0.22 μm无菌过滤器过滤，利用Sephacryl S-100蛋白层析纯化柱纯化，20 mmol/L NaCl洗脱蛋白，每管3 mL，Nanodrop在280 nm处检测吸光值，SDS-PAGE鉴定各层析成分。

1.2.4 蛋白P39免疫印迹实验(Westen blot)鉴定

通过Western blotting检验纯化后的重组目的蛋白。SDS-PAGE后100 V恒压转膜55 min。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗3次，加入1：1 000稀释的抗his标签鼠单克隆抗体，37℃孵育45 min，TBST漂洗3次后，加入1：1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育45 min，TBST漂洗3次后用DAB显色试剂盒进行显色(购自sigma公司)，观察目的条带并记录结果。

1.2.5 发酵条件对蛋白表达量的影响 1.2.5.1 pH值对重组蛋白P39表达量的影响

取阳性重组菌以1%的接种量分别接入pH值分别为3.0、5.0、6.0、8.0的200 mL BMGY培养基中，盐浓度0.05 M，28℃摇床培养，至OD₆₀₀值为0.6-0.8时，1%甲醇诱导72 h。

1.2.5.2 磷酸盐浓度对重组蛋白P39表达量的影响

取阳性重组菌以1%的接种量分别接入磷酸盐浓度分别为0.02 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L和0.2 mol/L的BMGY培养基进行培养，pH 6.0，OD₆₀₀值为0.6-0.8时，1%甲醇诱导72 h。

1.2.5.3 甲醇浓度对重组蛋白P39表达量的影响

取阳性重组菌以1%的接种量BMGY培养基中，28℃摇床培养，盐浓度0.05 mol/L，pH 6.0，OD₆₀₀值为0.6-0.8时，分别以0.5%、1%、2%和3%不同浓度的甲醇诱导72 h。

1.2.5.4 诱导时间对重组蛋白P39表达量的影响

取阳性重组菌以1%的接种量BMGY培养基中，28℃摇床培养，盐浓度0.05 mol/L，pH 6.0，OD₆₀₀值为0.6-0.8时，以1%浓度的甲醇分别诱导24 h、48 h、72 h和96 h。

1.2.5.5 NanoDrop检测蛋白浓度

以100 μg/mL牛血清白蛋白作为对照，对目的蛋白进行蛋白浓度标定。

1.2.6 酵母分泌表达的P39蛋白糖基化鉴定

将纯化后10 μg的真核蛋白加入1 μL糖蛋白变性缓冲液，总体积10 μL。100℃变性10 min，加入2 μL的glycobuffer，10% NP-40和1 μL的PNGaseF糖苷酶，37℃，孵育1 h。500 MHz核磁共振氢谱检测重组P39蛋白糖基化修饰水平。

1.2.7 巨噬细胞RAW264.7吞噬荧光抗原实验

将FITC与真核蛋白及原核蛋白进行混合反应，在4℃避光反应18 h后收集样品。复苏RAW264.7巨噬细胞后将其以10⁵个每孔接种于24孔板中，加入FITC标记的真核蛋白和原核蛋白，PBS作为空白对照组，荧光显微镜观察巨噬细胞吞噬抗原蛋白情况，分别记录4 h、6 h不同时间巨噬细胞吞噬蛋白情况。

2 结果 2.1 构建真核表达载体pPICZαA-P39

DNA核酸电泳显示成功构建pPICZαA-P39真核表达载体，电转化后挑选出的阳性菌株。条带大小与理论的片段大小一致为1 206 bp，如图 1所示。

2.2 真核P39抗原表达纯化与Western blot鉴定

甲醇诱导阳性转化子表达，SDS-PAGE检测P39蛋白的表达，目的条带在45 kD处，如图 2。目的蛋白条带与理论值大小一致，纯化后的蛋白纯度较好，高效液相色谱检测纯化蛋白纯度，纯度可达93.77%，如图 3和图 4所示。经Western blot免疫印迹法检测确定该蛋白为P39蛋白，特异性良好，如图 5所示。

2.3 真核P39抗原发酵条件的优化 2.3.1 pH值对重组蛋白P39表达量的影响

由图 6-A可以看出，蛋白得率随pH的升高先增高后降低，当pH至为6时，蛋白的得率最高，实验表明该重组蛋白在酸性或弱碱性的条件下表达条件较好，所以，最佳的发酵pH 6左右，最高得率为3.86 mg/mL。

2.3.2 盐浓度对重组蛋白P39表达量的影响

由图 6-B可见，随磷酸钾浓度的升高蛋白得率降低，在磷酸钾浓度为0.05 mol/L时，蛋白得率最高，过高的盐浓度可能会抑制蛋白的表达，所以，最佳的磷酸钾浓度为0.05 mol/L，最高得率为3.64 mg/mL。

2.3.3 甲醇浓度对重组蛋白P39表达量的影响

由图 6-C可见，随甲醇诱导浓度的增加蛋白得率先增加后减少，在甲醇浓度1%时，蛋白得率最高，低浓度和高浓度的甲醇对蛋白的表达都有不利影响，最佳的甲醇诱导浓度1%，最高得率为4.96 mg/mL。

2.3.4 诱导时间对重组蛋白P39表达量的影响

由图 6-D可见，随诱导时间的增加，蛋白得率出现先增加后下降的趋势，过长时间的诱导不利于目的蛋白的表达，实验表明，诱导72 h的条件下，长时间的诱导可能导致蛋白降解，所以，72 h蛋白得率最高，最高得率为5.05 mg/mL。

2.4 酵母分泌表达的P39蛋白糖基化鉴定

本研究对酵母表达的P39蛋白和利用PNGaseF糖苷酶酶解的P39蛋白利用核磁共振氢谱进行了糖基化修饰分析，结果(图 7-C)表明，重组蛋白图谱在3.6-3.8 ppm处出现寡糖H信号，说明在纯化后的重组蛋白上存在糖信号，重组后的P39蛋白在毕赤酵母中发生糖基化修饰。同时利用PNGaseF糖苷酶酶解蛋白N-糖链后的重组P39蛋白糖信号未消失，P39蛋白存在潜在的糖基化修饰位点，但酶解后糖信号仍然存在，说明蛋白的糖基化形式不是理论上N-糖修饰类型，毕赤酵母表达系统对蛋白的糖基化修饰主要表现为N-糖修饰和O-糖修饰两种类型，综合上述结果表明该重组P39蛋白的糖基化形式可能是O-糖基化修饰^[11-12]。

2.5 巨噬细胞RAW264.7吞噬荧光蛋白

荧光显微镜观察实验结果显示，两种蛋白在2 h开始出现荧光，荧光强度随时间呈现增强趋势，真核蛋白出现荧光效果早于原核蛋白，在6 h时荧光现象明显，PBS空白对照组未见明显荧光细胞。根据图 8显示，巨噬细胞吞噬真核蛋白的荧光强度明显优于吞噬原核蛋白。说明糖修饰对巨噬细胞的吞噬作用具有一定的影响，可增强蛋白的免疫原性^[13]。

3 讨论

布鲁菌进入宿主细胞之后，可被宿主免疫系统分解，同时释放细胞质结合蛋白，这些蛋白质分子继续发挥免疫刺激与侵染的作用^[14]。P39蛋白是布鲁菌优势抗原，其蛋白可以有效地诱导机体产生特异性免疫应答，而且P39基因在多个不同种型布鲁菌中高度保守，该成分可以在不同的布鲁菌中形成交叉保护作用，用于制备的新型布病疫苗具有较大优势^[15-16]。近年许多研究表明，糖基化对蛋白的结构和活性有很大的影响，消除N-糖基化位点可延长IFN-α/Fc融合蛋白的半衰期^[17]，糖链长短的变化及不同糖型的修饰都会影响蛋白的生物活性^[18-19]，本课题组发现甘露六糖修饰后的布鲁菌AHCY蛋白的免疫性得到大幅度的提升^[20]，说明糖修饰会改变蛋白的生物功能，这为开发安全有效的布鲁氏菌亚单位疫苗提供了可能。

本实验中，为获得大量P39抗原，选择具有分泌优势的毕赤酵母表达系统，并在酵母体内对P39抗原蛋白进行天然的糖基化修饰。结果发现，糖基化后的P39蛋白更容易被巨噬细胞捕获，与原核表达的P39蛋白相比，其结合巨噬细胞的效率更好，也更有可能高效的激活巨噬细胞。重组后的P39蛋白显示出优于原核P39蛋白的免疫原性，这可能是由于糖链的存在及其结构引发的改变，在P39蛋白的理论N-端糖基化位点并为发生修饰作用，说明糖基化的修饰可能存在随机性，或是由于蛋白空间结构折叠后掩盖其理论的糖基化位点，使其潜在的糖基化位点未进行修饰。随着基因工程的发展，已经实现了在分子水平对酵母糖基化系统进行改造，从而更有利于生产人源糖蛋白药物及亚单位疫苗的开发^[21-22]。

4 结论

本研究成功在毕赤酵母中分泌表达P39抗原，优化发酵条件产量可达5.05 g/L，通过核磁共振氢谱结果表明P39抗原发生糖基化修饰，糖基化修饰后的P39抗原被巨噬细胞捕获的程度明显高于原核蛋白，说明糖基化修饰作用会在一定程度上影响蛋白的免疫原性。