2. 煤与煤层气共采国家重点实验室，晋城 048000;
3. 易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，晋城 048000
2. State Key Laboratory of Coal and CBM Co-mining, Jincheng 048000;
3. Yi'an Lanyan Coal and Coal-bed Methane Simultaneous Extraction Technology Co., Ltd., Jincheng 048000
煤层气是成煤过程中生成的非常规天然气，是一种洁净的化石能源。据国际能源机构（IEA）估计，全世界煤层气资源量达263.8×1012 m3，约占世界天然气总储量的30%以上，而我国的煤层气资源量约有30×1012-36.81×1012 m3，具有巨大的开发潜力。煤层气的开发不仅能够改善能源供给结构，同时还有助于煤矿的安全开采，实现温室气体的减排，具有重大的社会、环境和经济效益。近年来，世界上各大产煤国也相继开展了煤层气的开发与利用。然而，碍于煤层气生产井的寿命短，如何实现煤层气的增产已成为了当今煤层气开发的重要研究内容。
根据成因不同，煤层气可分为生物成因气和热成因气。其中，生物成因气是由微生物降解煤或煤层有机质产生[1]，其存在已在大量煤田中证实[2-4]。目前，国内外关于微生物成气机理的研究还多集中在实验室模拟[5-8]，尽管成绩显著，但至今有关煤的生物降解是如何实现的还不是很清楚，从而阻碍了我们采取策略去刺激煤层微生物产生额外的甲烷。解析产气微生物群落的多样性有助于掌握功能微生物的类型，为实现调控微生物成气及揭示微生物成气机理奠定理论基础。然而，通过常规的分离培养方法，环境中能培养分离出的微生物仅占环境样品总数的1%-10%[9]，无法完整地解析样品中微生物的种类及丰度。基于环境微生物总DNA，宏基因组学、分子指纹图谱技术等免培养技术，为揭开不可培养微生物的神秘面纱提供了技术支撑。然而，一些特殊环境中较完整的微生物DNA的提取实属不易，因此，一种有效的、高质量的微生物基因组提取方法成为决定数据准确全面的关键。
煤地质环境样品组成较复杂，除了含有煤颗粒外，还存在大量理化性质复杂的物质，如腐植酸、煤降解中间产物多环芳烃、酚类等物质[10-11]，这些物质的存在易使环境中的微生物吸附在其表面，不易分开，从而阻止了细胞内总DNA的释放。其次，腐植酸、酚类等物质的存在会对PCR反应产生抑制，容易造成对环境微生物多样性的偏低估计[12]。因此，充分裂解样品中的细胞、除去样品中的PCR抑制物，成为了获得高质量微生物总基因组DNA的关键。由于煤地质环境微生物基因组DNA的提取及对DNA保障的品质均具有一定难度，所以，目前还没有一种较适合煤地质环境中微生物基因组高效提取的方法。近年来，关于煤地质环境中微生物总DNA的提取，多数学者均采用土壤试剂盒法[4, 13-14]，但试剂盒所针对的样品在性质和组成上与煤地质环境样品存在有一定的差异，煤地质环境相对而言含有更加丰富的有机质杂质，高品质DNA的提取就会比其他样品更加困难，用土壤试剂盒对煤地质环境微生物基因组DNA进行提取未必是一种最佳选择。重要的是，土壤试剂盒价格昂贵，科研成本高，使用次数有限，不适用于大批量样品的DNA提取。因此，开发适用于煤地质环境中微生物总DNA大量高效提取的方法对于研究煤层气田微生物分子生态学及生物成气机理都具有重要意义。
本研究在参考前人工作的基础上，通过对传统DNA抽提方法（酚-氯仿法）进行改进，建立了一种经济可行的可用于煤地质环境中微生物基因组DNA高效提取的方法。并通过琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增反应来检测提取基因组DNA的质量，以确定建立基因组DNA提取方法的可行性及可靠性，为研究煤地质环境微生物群落结构及多样性、生物成气机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试材料Rhodococcus sp.R04，由山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室保存。无烟煤块煤，取自山西晋煤集团寺河矿区。煤层水样，取自山西晋煤集团寺河矿区煤层气井。煤层气厌氧富集培养样，取自山西省晋城市煤与煤层气共采国家重点实验室。
1.1.2 主要试剂及培养基配制TPM缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，1.7% PVP，20 mmol/L MgCl2·6H2O）、STE缓冲液（6 g/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA）、Proteinase K、十二烷基磺酸钠（SDS）、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 V/V/V）、氯仿/异戊醇（24:1 V/V）、异丙醇、75%乙醇、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）、RNase A、DNA聚合酶。
LB培养基（1 L）：胰蛋白胨10 g；酵母膏5 g；NaCl 5 g。
1.1.3 主要器材及仪器设备高压蒸汽灭菌锅、小型粉碎机、台式离心机、小型珠磨式研磨器Mini-Bead Beater-1、2 mL戴帽聚丙烯酰胺管、0.1 mm玻璃珠、1.5 mL离心管、PCR仪、DYY-6C型电泳仪、Gel Doc 2000 UV凝胶成像系统。
1.2 方法 1.2.1 基因组总DNA的提取鉴于煤层水样和煤层气厌氧富集培养样获取来源珍贵，基因组DNA的提取优化试验以本实验室保存菌种Rhodococcus sp.R04及煤粉作为试验材料。
1.2.2 Rhodococcus sp.R04基因组总DNA的提取优化试验 1.2.2.1 材料预处理实验室中将无烟煤块煤用小型粉碎机粉碎成粉末，获得煤粉保存待用；Rhodo-coccus sp.R04用5 mL LB培养基于30℃，200 r/min条件下培养12-16 h，于Rhodococcus sp.R04菌液中加入适量煤粉，混匀，收集两者的混合物于无菌的1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min。用TPM缓冲液洗涤混合物1-2次后，用STE缓冲液洗涤混合物一次，12 000 r/min离心1 min，用STE缓冲液悬浮Rhodococcus sp.R04菌体细胞与煤粉的混合物。
1.2.2.2 菌体细胞的破碎将用STE缓冲液悬起的菌体细胞与煤粉的混合物加入带螺旋帽的聚丙烯酰胺管中，采用机械振荡器Mini-Bead Beater-1对收集到的菌体细胞进行破碎。设置5组破碎条件，即2 500 r/min、30 s，2 500 r/min、60 s，2 500 r/min、90 s，4 200 r/min、30 s，4 200 r/min、60 s，进行5组平行试验以优化较佳的菌体破碎条件。细胞破碎后将带螺旋帽管在冰上静置数秒钟，取上清液移至无菌的离心管中；再次用STE缓冲液充满带螺旋帽管，2 500 r/min运行10 s，冰上静置数秒钟，并与第一次的上清液合并。于上清液中加入Proteinase K（终浓度为0.2 mg/mL）和SDS（终浓度为1%），充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育1-2 h，继续对菌体细胞进行裂解消化。
1.2.2.3 总基因组DNA的抽提、纯化及沉淀向裂解后的液体中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，充分混匀后，12 000 r/min离心15 min，取上清液至新的无菌离心管中；加入等体积的氯仿/异戊醇混合液进行抽提，充分混匀后，12 000 r/min离心10 min以除去酚类物质和脂类物质，取上清液至新的无菌离心管中；向收集的上清液中加入2倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀30 min后，12 000 r/min离心10 min，弃上清；用预冷的75%乙醇洗涤沉淀DNA两次，12 000 r/min离心10 min，然后置于37℃金属浴上充分干燥；待DNA沉淀干燥后，向离心管中加入100 μL的TE缓冲液溶解DNA，DNA溶解后加RNase A以消除RNA的污染。
1.2.2.4 基因组总DNA的质量验证取5 μL DNA进行琼脂糖凝胶电泳（胶浓度为0.7%），以检测提取基因组DNA的大小及完整性。
1.2.3 煤地质环境样品基因组DNA的提取 1.2.3.1 改良DNA抽提方法取煤层水样和煤层气厌氧富集培养样各5 mL于冰上静置，待大颗粒物质自然沉降后，取上层悬浮液于1.5 mL灭菌的离心管中，12 000 r/min离心1 min，收集菌体细胞。TPM缓冲液与STE缓冲液洗涤菌体、细胞的破碎、基因组DNA的抽提纯化、DNA质量的验证参考1.2.2.3。其中，机械振荡器Mini-Bead Beater-1对细胞进行破碎时采用1.4.1最终优化的条件。
取大块无烟煤，用小型粉碎机粉碎后，取1 g煤粉样品于灭菌的离心管中，依次加入TPM缓冲液与STE缓冲液进行样品的洗涤后，用STE缓冲液重悬样品，样品中微生物细胞的破碎、基因组DNA的抽提纯化、DNA质量的验证参考1.2.2.3。其中，机械振荡器Mini-Bead Beater-1对微生物细胞进行破碎时采用1.4.1最终优化的条件，提取的样品基因组DNA溶于15 μL的TE缓冲液中。
1.2.3.2 试剂盒法基因组DNA的提取煤层水样（5 mL）采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（D5625-01）进行基因组DNA的提取，提取过程参照试剂盒操作说明书进行。简言之，离心收集煤层水样中的微生物细胞于装有Glass beads的1.5 mL离心管中，加入Buffer SLX Mlus高速涡旋振荡后，加入Buffer DS于70℃水浴中孵育10 min，95℃孵育2 min，6 000 r/min离心3 min，弃沉淀，加入Buffer SP2涡旋混匀，冰浴5 min后离心取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，14 680 r/min离心10 min，加入Elution Buffer溶解DNA，加入HTR Reagent涡旋10 s，室温孵育2 min后离心取上清，加入等体积的XP2 Buffer涡旋混匀后，将混合液转移到套有收集管的Hibind DNA结合柱中，离心弃滤液，依次用XP2 Buffer及SPW Wash Buffer洗涤DNA沉淀后，用预热的Elution Buffer洗脱DNA。最后，取5 μL DNA用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.4 16S rDNA片段的扩增 1.2.4.1 细菌16S rDNA片段的扩增以提取的煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样基因组DNA分别为模板，用通用引物27F、518R（表 1）扩增细菌16S rDNA基因的V1-V3区。反应体系（50 μL）：10×Easy Taq Buffer 5 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL；上下游引物（10 μmol/L）各2 μL；Easy Taq DNA polymerase 1 μL；DNA模板0.5 μL；最后用无菌的双蒸水补至50 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；35个循环：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；72℃终延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
以提取的煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样基因组DNA分别为模板，用通用引物344F、0691R（表 1）扩增古菌16S rDNA基因的V3-V4区。PCR扩增体系及扩增程序同1.2.4.1。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 功能基因mcrA片段的扩增以提取的煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样基因组DNA分别为模板，采用特异性引物mcrA-F、mcrA-R（表 1）进行功能基因片段的扩增。PCR扩增体系同1.4.3.1。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；35个循环：95℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 45 s；72℃终延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果 2.1 不同破碎条件下Rhodococcus sp.R04基因组总DNA的提取以Rhodococcus sp.R04和煤粉为试验材料进行基因组总DNA提取，对细胞破碎条件进行了优化，不同优化条件下基因组总DNA的提取结果，如图 1所示。由图 1可以看出，在5种破碎力度条件下，均能得到Rhodococcus sp. R04的基因组。鉴于破碎强度的不同，提取的基因组DNA都有不同程度的降解及剪切现象。但当破碎强度为2 500 r/min 30 s时，提取基因组DNA的主带分子量更大，接近23 kb，表明提取的基因组DNA片段更完整，明显优于其他破碎条件下DNA的提取质量。煤地质环境样品包含有大量的有机质杂质，易使微生物细胞吸附在其表面，在进行细胞破碎时，微生物很难与吸附介质分开，阻止了细胞内总DNA的释放，使得基因组总DNA的提取具有一定的难度。采用Rhodococcus sp.R04和煤粉的混合物进行基因组DNA提取的优化试验，是由于两者的混合物可以较好地模拟煤地质环境样品，且Rhodococcus sp.R04作为一种革兰氏阳性菌，菌体细胞壁较厚，其在细胞壁破碎难度上与煤地质环境微生物存在有一定共性，且为实验室保有菌种，容易获得。而煤层水样和煤层气厌氧富集培养样来源较珍贵，且样品量少。因此，在进行基因组总DNA提取方案的优化试验中选用Rhodococcus sp.R04及煤粉作为代替样品进行。综上所述，我们采用2 500 r/min 30 s的机械破碎条件对煤层水样及煤层气厌氧富集培养样中的微生物进行细胞破碎。
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| 图 1 不同破碎条件下提取的Rhodococcus sp.R04基因组DNA M：λDNA/Hind Ⅲ；1：2 500 r/min 30 s；2：2 500 r/min 60 s；3：2 500 r/min 90 s；4：4 200 r/min 30 s；5：4 200 r/min 60 s |
采用改良后的DNA抽提方法进行煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样中基因组DNA的提取，菌体细胞的破碎条件均为2 500 r/min，30 s。DNA提取结果如图 2所示，在琼脂糖电泳图谱上，基因组DNA均有微微拖带现象，但所有样品的DNA又有明显的主带，表明提取的基因组DNA既有完整的片段，又存在降解现象。其中完整的DNA约占总DNA含量的50%，分子量大小接近23 kb，并且提取量大。可以看出，在此破碎条件下，煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样均能得到较完整的基因组DNA，可用于诸如DNA文库构建和宏基因组测序等，且DNA提取重复性较好，表明改良后的DNA抽提方法在DNA提取上具有较好的稳定性。
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| 图 2 改良法提取煤地质环境样品基因组DNA M：λDNA/Hind Ⅲ；1-8：煤层水样；9-13：煤层气厌氧富集培养样；14：无烟煤样 |
煤层水样采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit进行基因组DNA的提取，提取结果如图 3所示。提取的2份煤层水样基因组DNA都有不同程度的降解，DNA主带不明显，片段化严重，琼脂糖凝胶电泳图谱表现为严重的拖带现象（图 3），DNA提取量低，约为改良法的1/10-1/5倍。DNA降解严重，这可能是因为在试剂盒提取过程中采用高温（70℃、95℃）条件对菌体细胞进行裂解，从而导致DNA提取效率较低。相较于改良DNA抽提法提取的煤层水样及煤层气厌氧富集培养样基因组DNA，试剂盒法提取的基因组DNA质量明显低于改良法，不能用于诸如DNA文库构建和宏基因组测序等。
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| 图 3 试剂盒法提取煤层水样基因组DNA M：λDNA/Hind Ⅲ；1-2：煤层水样 |
以提取的煤层水样、厌氧富集培养样及无烟煤样的基因组DNA分别为模板进行细菌16S rDNA V1-V3区片段的PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如图 4所示。改良法与试剂盒法提取的煤地质环境基因组DNA均能作为模板扩增出细菌16S rDNA V1-V3区片段，扩增的目的片段均清晰明亮。但很明显，试剂盒法提取的煤层水样基因组DNA（图 3泳道2）为模板扩增的目的条带的亮度比其他条带弱（图 4泳道5），进一步表明了试剂盒法所提取的DNA质量差。
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| 图 4 细菌16S rDNA V1-V3区片段的扩增 M：100 bp DNA Ladder；1：改良法提取煤层水样；2-3：改良法提取煤层气厌氧富集培养样；4-5：试剂盒法提取煤层水样；6：改良法提取无烟煤样 |
以提取的煤层水样、厌氧富集培养样及无烟煤样的基因组DNA分别为模板进行古菌16S rDNA V3-V4区片段的PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如图 5所示。改良法与试剂盒法提取的煤地质环境基因组DNA均能作为模板扩增出古菌16S rDNA V3-V4区片段，且PCR反应特异性好，扩增的目的片段均清晰单一。同2.3.1结果，试剂盒法提取的煤层水样基因组DNA（图 3泳道2）为模板扩增的目的条带的亮度比其他条带弱（图 5泳道5），证明了模板DNA的质量差。
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| 图 5 古菌16S rDNA V3-V4区片段的扩增 M：100 bp DNA Ladder；1-2：改良法提取煤层气厌氧富集培养样；3：改良法提取煤层水样；4-5：试剂盒法提取煤层水样；6：改良法提取无烟煤样 |
以提取的煤层水样、厌氧富集培养样及无烟煤样的基因组DNA分别为模板进行古菌功能基因mcrA片段的PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如图 6所示。改良法与试剂盒法提取的煤地质环境基因组DNA均能作为模板扩增出古菌的mcrA片段，PCR反应特异性好，扩增的目的片段均清晰单一。
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| 图 6 古菌功能基因mcrA片段的扩增 M：100 bp DNA Ladder；1：改良法提取煤层水样；2-3：改良法提取煤层气厌氧富集培养样；4-5：试剂盒法提取煤层水样；6：改良法提取无烟煤样 |
基因组DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，保证基因组DNA的完整性是分子生物研究的基础。本实验在建立基因组DNA提取的改良法中，于菌体细胞破碎步骤之前，加了煤地质环境样品预处理过程。因为煤地质环境组成较复杂，除含有煤颗粒外，还含有各种煤降解中间代谢有机物、无机物及各种离子等，它们的存在会极大地影响DNA提取效率及质量，对后续的酶促反应产生一定影响。应用TPM缓冲液和STE缓冲液对煤地质环境样品进行预处理，可以很好地去除部分杂质，减少部分可溶性PCR抑制剂的污染，特别是减少酚类物质、腐植酸的污染。TPM缓冲液中含有PVP（聚乙烯吡咯烷酮），它是一种合成水溶性高分子化合物，可以从水提物中吸收酚类物质[20]，易和酚类物质形成复杂的氢键，随菌体细胞外杂质共沉淀离心下来，从而减少酚类物质对提取基因组DNA的污染。此外，PVP还可以有效地结合去除部分腐植酸类物质[21]，减少腐植酸类物质对提取DNA的污染。STE缓冲液中含有EDTA，它可以络合金属离子，有效抑制核酸酶的活性，防止DNA在提取过程中造成降解[22]。
在菌体破碎步骤，采用了机械振荡法，及结合化学裂解法和酶裂解法进行细胞破碎，通过对机械破碎条件进行优化，使得菌体细胞既裂解充分，利于基因组DNA的释放，又保证了大量DNA片段的完整性。
改良法提取的煤地质环境微生物基因组DNA片段完整性较好，而试剂盒法提取的煤地质环境微生物基因组DNA降解及剪切现象严重，DNA片段化明显。应用细菌及古菌的特异引物对改良法和试剂盒法提取的基因组DNA同时进行PCR扩增，均能获得目的片段，表明两种方法都能从煤地质环境中有效提取细菌和古菌的基因组DNA，并有效地去除部分抑制剂，不影响PCR扩增。试剂盒法提取基因组DNA虽然方便快捷，但价格昂贵，DNA提取量低，且在高温条件下（70℃、95℃）提取的煤层水样中的微生物基因组DNA片段不完整，剪切现象严重，导致遗传信息的缺失，不适用于诸如DNA文库构建和宏基因组测序等分析的进行。改良法虽然比试剂盒法提取DNA烦琐一些，但对于腐植酸等含量较低的煤层水样、煤层气厌氧富集培养样及无烟煤样均能够获得质量较高的基因组DNA片段，且DNA提取量高，可用于煤地质环境微生物分子生态学及生物成气机理研究。此外，改良法所用试剂普通，价格便宜，适于大批量样品的实验室和科学研究。
4 结论通过改进传统DNA提取方法（酚-氯仿法），并以Rhodococcus sp.R04及煤粉为试验材料进行细胞破碎条件的优化，建立了一种可用于煤地质环境微生物基因组DNA的高效提取方法，即改良法。改良法提取的DNA片段比试剂盒法更加完整，且可以作为模板进行多种特异性PCR扩增，表现出了较高的可靠性。
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