近年来，DNA纳米技术迅猛发展。核酸的碱基序列不仅能够携带生物遗传信息，而且能够被编辑、设计成各种一维、二维、三维的功能核酸纳米器件进行开关调控[1]、逻辑门操作[2]、电路计算[3]与纳米机器运转[4]，在生物成像、体内调控、传感与检测领域发挥着重要作用。1957年，科学家Felsenfeld和Davies等[5]发现了多聚嘌呤链通过胡思特键(Hoogsteen bond)嵌入到双链脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)的大沟中形成三螺旋核酸。近10年来，基于三螺旋核酸的生物传感技术日新月异地进步，作为DNA纳米技术工具箱的重要组成部分，三螺旋核酸传感平台在分子成像[6]、配体的携带与释放[7-9]、细胞内表达调控[10]与分析化学[11-16]领域的应用不断突破，取得了令人瞩目的研究进展。
三螺旋核酸(Triplex nucleic acids，TNAs)是在经典的沃森-克里克(Waston-Crick)氢键形成的双链核酸基础上，第三条寡核苷酸链以非经典的胡斯特(Hoogsteen)氢键嵌入到双链大沟中形成的超分子核酸组装体。在众多生物传感方法中，基于TNAs的生物传感平台凭借其快速、灵敏、简单及可逆等特点而备受关注。本文首先综述了三螺旋生物传感器的核酸类别和性质；然后归纳总结了常见的TNAs生物传感器；论述了TNAs生物传感器在分子成像、配体的携带与释放、细胞内表达调控与分析化学领域的应用；最后，对TNAs生物传感器未来的发展方向进行了展望。
1 TNAs生物传感器的分类、性质与表征三螺旋核酸是TNAs生物传感器的结构基础。按照碱基种类的差异，可将三螺旋核酸分为嘧啶-嘌呤*嘧啶型三螺旋和嘧啶-嘌呤*嘌呤型三螺旋；按照形成方式的不同，可将三螺旋核酸分为分子内三螺旋与分子间三螺旋；按照核酸类型的差别，可将三螺旋核酸分为DNA三螺旋、RNA三螺旋、DNA/RNA三螺旋和PNA三螺旋；按照第三链与双链形成三螺旋核酸的方向不同，可将三螺旋核酸分为平行结构和反平行结构两种类别。
目前，三螺旋核酸的表征方法主要包括：紫外-及可见分光光度法[17]、荧光分析法[18]、原子力显微镜观察法[6]、圆二色谱法[19]及电泳法[20]。鉴于合成生物学的发展，荧光基团标记的荧光探针具有易合成、高灵敏等优势，荧光分析法逐渐成为表征TNAs生物传感器的主流方法。
TNAs的形成是制作TNAs生物传感器的结构基础。目前TNAs的稳定形成受如下因素影响：(1)pH：酸性条件促进胞嘧啶(cytosine，C)质子化、促进胞嘧啶-鸟嘌呤(guanine，G)*胞嘧啶-(C-G*C)碱基对的稳定形成及促进TNAs的稳定形成；中性条件促进胸腺嘧啶-腺嘌呤(Adenine，A)*胸腺嘧啶-(T-A*T)碱基对的稳定形成、从而促进TNAs的稳定形成[18]；(2)Mg2+：双链核酸是TNAs形成的必要条件，Mg2+通过稳定双链核酸的形成、促进TNAs的形成[21]；(3)Ag+：Ag+通过与C-G*C碱基对络合形成稳定的C-G*C Ag+结构，稳定三螺旋DNA的形成[22]；(4)化合物：氯化甲氧檗[13]与二醚二酞酰亚胺化合物[23]发挥类黏合剂样作用，稳定三螺旋DNA的形成；稠环芳烃的菲与芘，可以作为连接子，连接第三链与双链，促进单链分子内三螺旋DNA与及异质二聚体间三螺旋DNA的形成[19]。
2 三螺旋生物传感器 2.1 三螺旋DNA生物传感器三螺旋DNA生物传感器是以DNA链构成的核酸三螺旋为结构单元的生物传感器，占目前已报道的TNAs生物传感器的大多数，类型多样且用途广泛。根据DNA三螺旋的形态差异，将三螺旋DNA生物传感器分为如下类型。
2.1.1 三链DNA三螺旋生物传感器三链DNA三螺旋生物传感器是当第三条DNA链以Hoogsteen键嵌入双链DNA的大沟中形成三链DNA组装体、实现信号输出的生物传感器(图 1-A)。2010年，意大利罗马大学的Francesco Ricci教授团队利用这种传感策略，将标记有电化学信号分子(甲基蓝)的第三链标记在金电极上作为识别元件识别特异的双链DNA靶标，当且仅当双链DNA靶标存在时，靶标DNA与固定化的第三链形成三螺旋结构，阻碍甲基蓝靠近金电极并转移电子，实现电化学信号的输出，实现了双链DNA在复杂血清样本中特异、灵敏(10 nmol/L)的电化学检测，构建了一种无试剂化、可重复利用的三链DNA生物传感器[24]。但由于利用C-G*C与T-A*T的序列特异性有效识别靶标DNA，使目标DNA的检测缺乏广谱性和通用性。
|
| 图 1 三螺旋DNA生物传感器的4种类型 A：三链DNA三螺旋；B：三螺旋茎环结构；C：夹钳状三螺旋DNA；D：单链DNA三螺旋 |
茎环型DNA三螺旋生物传感器是从茎环结构的设计获得灵感，将茎环结构的环状(Loop)区域改造成具有生物识别作用的单链核酸(适配体-aptamer，单链DNA等)，将茎部(Stem)区域由双链DNA改造成三链DNA的结构元件(图 1-B)，通过生物识别作用、改变三螺旋的茎环结构、实现信号表征的生物传感器。2011年，湖南大学谭蔚泓教授[25]团队设计了一种基于三螺旋茎环结构的生物传感器，通过aptamer的特征识别机制使三螺旋分子开关发生结构转换，使第三链两端标记的芘分子靠近、发射高强度荧光，实现了三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)、α-凝血酶(α-thrombin，Tmb)与L-精氨酰胺(L- Argininamide，L-Arm)的通用型检测。2014年，湖南大学王柯敏教授[26]团队将三螺旋茎环结构搭载电化学传感平台，实现了ATP(LOD=60 nmol/L)与Tmb(LOD=4.5 nmol/L)的通用型、超灵敏检测。2015年，伊朗Khalil Abnous教授[27]团队设计了一种基于三螺旋茎环结构的传感平台，结合金纳米粒子的聚沉显色，实现了四环素的可视化、超灵敏(检测限，Limit of detection，LOD=266 pM)检测。通过在茎环型DNA三螺旋生物传感器的loop区域引入aptamer区域，不仅大大拓宽了三螺旋生物传感器的检测范围，使目标物不再局限于核酸类物质，而且已经发展成为了一种通用型检测目标物的传感策略。
2.1.3 夹钳型DNA三螺旋生物传感器夹钳型DNA三螺旋生物传感器是以一条具有对称序列的单链DNA为探针，以另外一条DNA为靶标，通过探针DNA链与靶标DNA链先形成双链、再通过Hoogsteen键形成DNA三螺旋的生物传感器(图 1-C)。在形态方面，夹钳型DNA三螺旋与茎环型DNA三螺旋相比，loop区域只起到连接作用和非生物识别作用，发挥识别功能的是探针DNA链一端的对称序列。在识别特性方面，由于Waston-Crick键与Hoogsteen共同发挥夹钳状的特征识别作用，使夹钳型DNA三螺旋传感元件具有更强的灵敏度与更优的特异性[11]。2014年，罗马大学Francesco Ricci教授团队将夹钳型DNA三螺旋传感元件与电化学检测平台结合，实现了有效的DNA单碱基错配区分[28]。
2.1.4 单链DNA三螺旋生物传感器单链DNA三螺旋生物传感器是由一条DNA链先形成Waston-Crick键、再形成Hoogsteen键的分子内三螺旋DNA生物传感器(图 1-D)。2014年，Francesco Ricci教授团队利用双荧光基团标记的分子内三螺旋DNA，实现了跨5.5个pH单位(pH5.5-11.0)的传感检测[18]。目前的单链DNA三螺旋生物传感器主要通过核酸三螺旋的特征序列进行靶标的特异性识别。与夹钳状DNA三螺旋生物传感器相比，由单链DNA构成的三螺旋生物传感器提高了DNA超分子组装体的结合效率、避免了分子间形成非三螺旋核酸的可能性，进而提高了传感器的检测性能。
2.2 三螺旋RNA传感器三螺旋RNA生物传感器是以RNA链构成的核酸三螺旋为结构单元的生物传感器。2016年，哈佛-麻省理工健康科技联合中心的Natalie Artzi教授团队利用U-A*U、C-G*U、A-U*A、U-G*U和U-G*C等三螺旋碱基对，设计了一种基于三链RNA的双色荧光三螺旋传感器，该三螺旋RNA能够识别癌细胞内micro RNA(miRNA)，发挥抑制癌细胞miRNA-221与替换癌细胞miRNA-205的双重功能[10]，拓宽了三螺旋核酸的应用领域，使研究者对三螺旋核酸的研究不再局限于DNA三螺旋。
2.3 三螺旋DNA/RNA生物传感器三螺旋DNA/RNA生物传感器是以RNA链为第三链嵌入到双链DNA大沟中、形成三螺旋结构单元的生物传感器。1996年，Ekambar Kandimalla教授和Agrawal教授[29]合作研究了DNA/RNA三螺旋结构，发现以T-A*U碱基对替代T-A*T碱基对形成的三螺旋结构，在相同pH条件下，Tm值比对应的T-A*T三螺旋结构低10℃左右，表明DNA/RNA三螺旋结构不稳定。因此，基于DNA/RNA的三螺旋生物传感器鲜有报道。
2.4 三螺旋PNA/DNA生物传感器肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。三螺旋PNA/DNA生物传感器是以PNA与DNA杂交形成的核酸三螺旋为基本结构单元的生物传感器。由于PNA与DNA的结合具有更强的亲和性，因此PNA/DNA三螺旋具有更高的特异性、灵敏度及稳定性；其信号的特征识别机制主要包括三螺旋核酸的序列特异性识别、引入与目标物特异性亲和的loop区域两种方式实现。目前根据杂交链的类型不同，三螺旋PNA/DNA生物传感器可分为以下类型。
2.4.1 PNA-DNA-PNA三螺旋生物传感器PNA-DNA-PNA三螺旋生物传感器是以一条多聚嘧啶PNA链与一条多聚嘌呤DNA链通过Waston-Crick氢键生成双链；另一条多聚嘧啶PNA链通过Hoogsteen键嵌入双链大沟、形成三螺旋结构的生物传感器，其特征是PNA链与DNA链按2: 1结合(图 2-A)[30]。2006年，加利福尼亚大学Michael Bowers教授[31]团队率先发现了经过荧光基团标记的PNA与DNA序列特异性结合、形成的PNA-DNA-PNA三螺旋在加入特定的阳离子共轭聚电解质(Cationic conjugated polyelectrolyte，CCP)后，通过荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，TRET)可以增强PNA2/DNA三螺旋的荧光，建立了一种基于PNA/DNA三螺旋的光学传感器。2009年，新加坡国立大学Liu教授[32]团队利用PNA/DNA/PNA三螺旋无法被S1核酸酶降解的特性，加入嵌入型的噻唑橙(Thiazole orange，TO)染料后显微弱荧光，再加入特定的CCP后，通过TRET增强荧光发射；而相应的含有单碱基错配的DNA/PNA三螺旋能够被S1核酸酶降解、无法产生荧光。因此，所建立的基于PNA-DNA-PNA三螺旋的荧光传感器可以实现无标记、高选择性的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism)的检测(LOD=5 μmol/L)。
|
| 图 2 三螺旋PNA/DNA生物传感器的两种类型 A：PNA-DNA-PNA三螺旋；B：DNA-PNA-DNA三螺旋 |
DNA-PNA-DNA三螺旋生物传感器是单链PNA通过Hoogsteen键嵌入到双链DNA大沟中形成三螺旋结构、输出反应信号的生物传感器(图 2-B)。2006年，Michael Bowers教授团队研究发现：经过荧光基团标记的PNA与双链DNA的序列特异性结合、形成的DNA-PNA-DNA三螺旋在加入特定CCP后，通过TRET可以增强DNA2/PNA三螺旋的荧光，建立了一种基于PNA/DNA三螺旋的光学传感器[31]。2007年，德国Oliver Asitz教授团队将分子信标进行结构改造，loop区域为靶标DNA链互补区域(实现靶标的特征识别)，stem区域则利用富含A的PNA链与富含T的双链DNA形成DNA2/PNA三螺旋。当检测体系中加入靶标DNA链，三螺旋分子信标发生结构转换、茎环结构被打开、开启荧光信号、实现传感。值得一提的是，该传感器具有3个显著特点：其一，识别靶标DNA的灵敏度与特异性能够被DNA2/PNA组成的三螺旋stem所调节；其二，PNA链标记的荧光基团在形成三螺旋结构后，形成的超淬灭荧光发卡结构能够显著降低荧光背景，实现检测的高信噪比；其三，借助高特异性与高信噪比的特性，该DNA-PNA-DNA三螺旋荧光传感器可以实现单碱基区分[33]。2013年，伊朗Mohammad Saeid Hejazi教授团队将PNA链固定在金电极上，通过PNA链特异性捕获特征双链DNA形成三螺旋结构导致的电信号变化，实现了对靶标DNA双链的检测[34]。
2.5 可视化TNAs生物传感器可视化TNAs生物传感器是以TNAs作为生物识别元件对输入信号进行识别响应，以光学响应信号为基础，通过裸眼比较反应液中颜色的深浅的变化，实现对目标物的肉眼识别检测的传感方法。当金纳米粒子(Gold nanoparticles，AuNPs)之间的距离改变时，其局域表面等离子共振吸收峰会产生相应的变化，引起溶液颜色的改变[35]。2006年，韩国Insung S. Choi教授团队分别在AuNPs上共价偶联两条核酸链，通过调节溶液体系的pH值，使反应体系在酸性条件(pH5.0)下形成C-G*C、T-A*T三螺旋结构，从而拉近AuNPs之间的距离，使AuNPs粒子聚沉、发生从红色到蓝色的颜色变化[36]。2011年，中山大学凌连生教授团队利用Ag+可以在弱碱性(pH8.0)条件下稳定C-G*C三螺旋结构的性质，使AuNPs粒子上的两条链通过C-G*C Ag+三螺旋结构，距离有效拉近，发生颜色变化，从而实现Ag+的传感检测[37]。2015年，伊朗Khalil Abnous教授团队设计了一种基于TNAs茎环结构的可视化传感器，通过靶物质(四环素)与loop区域的亲和结合、诱导TNAs茎环结构解组装、释放第三链，在高盐条件(50 mmol/L NaCl)下，释放的第三链能够维持AuNPs的稳态，抵抗高盐聚沉效应，使溶液呈现明亮的红色；而阴性对照组因TNAs茎环结构的稳定存在，AuNPs在高盐环境中发生聚沉呈现蓝色，从而实现了四环素的可视化、超灵敏(检测限，Limit of detection，LOD=266 pmol/L)检测[27]。通过与AuNPs结合，使TNAs生物传感器具有可视化、简便、快速等优点，但由于AuNPs的聚沉容易受盐离子浓度、金属阳离子浓度的干扰，因此基于AuNPs的可视化TNAs生物传感器的稳定性有待于进一步研究。
2.6 荧光TNAs生物传感器荧光TNAs生物传感器是以TNAs作为生物识别元件对输入信号进行识别响应，以荧光响应信号的强度变化，实现对目标物的传感响应的方法。最常使用的研究策略是根据荧光供体基团与荧光受体基团的距离变化诱导FRET，发生正向的荧光增强或负向的荧光减弱，从而表征对目标物的传感响应。2001年，新泽西Thomas Antony[20]团队建立了一种正向的荧光增强型的TNAs传感方法：预先在分子信标的5'末端与3'末端标记荧光供体基团(Fluorescein)与荧光受体基团(DABCYL)，在没有待测双链DNA出现时只有很低的背景信号；当体系中存在待测的双链DNA时，分子信标解构发生结构变化、并与双链DNA分子形成三螺旋DNA，使Fluorescein基团与DABCYL基团之间的距离增大、无法发生FRET而淬灭Fluorescein基团的荧光，因此发射出较强的荧光，从而通过荧光强度变化表征待测双链DNA的浓度。2014年，山东大学姜玮教授团队利用荧光淬灭基团(Black hole quencher-1，BHQ-1标记的三核酸第三链与荧光基团(6-carboxyfluorescein，6-FAM)标记的双链DNA，通过Ag+稳定三螺旋DNA的形成，同时6-FAM与BHQ-1发生FRET导致荧光淬灭。当存在转录因子(Transcription factors，TFs)时，目标物TFs与双链结合释放BHQ-1标记的第三链，使双链DNA的6-FAM释放荧光信号，实现对TFs的定量检测[14]。
除此之外，利用芘分子在单体状态与二聚体状态的荧光发射波长与荧光发射强度不同，也可对TNAs生物传感信号进行表征。2015年，湖南大学谭蔚泓教授团队设计了一种茎环状的DNA三螺旋分子开关，只有当目标物Tmb、ATP、L-Arm存在时，目标物与茎环结构的loop区域亲和结合、茎环状三螺旋结构解构，第三链自发形成发卡结构、使标记在5'端与3'端的芘分子在空间上聚集形成二聚体，在480 nm处的荧光强度显著增强，实现Tmb、ATP、L-Arm的通用型检测[25]。利用标记荧光基团建立的TNAs生物传感器通常能够实现目标物的灵敏检测，但由于标记荧光基团的高昂成本与技术制约，荧光TNAs生物传感方法的建立往往需要耗费更多的人力物力。
2.7 表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)-TNA生物传感器SERS-TNAs生物传感器是以TNAs作为生物识别元件对输入信号进行识别响应，以SERS响应信号的强度变化，实现对目标物的传感响应的方法。目前，常常把SERS信号分子修饰在DNA链或纳米材料上构建Raman增强基底，实现对目标待测物的传感响应。2012年，谭蔚泓教授团队利用目标物与loop区域的特异性亲和、诱导的DNA三螺旋茎环的结构变化，实现了SERS信号分子(罗丹明6G，rhodamine 6G，R6G)标记的银纳米粒子(Silver nanoparticles，AgNPs)在金膜表面的距离发生改变，导致SERS信号的传感响应[38]。2012年，Duncan Graham教授团队将Raman信号分子羧基-X-罗丹明异硫氰酸盐(Carboxy-X-rhodamine isothiocyanate，ROX-ITC)标记在AgNPs上，利用三核酸DNA的序列特异性结合，通过改变待测双链DNA的长度，实现TNAs的长度变化、进而调节AgNPs粒子间的距离变化，通过AgNPs间的距离与SERS信号强度呈负相关，实现对不同长度的双链DNA的测定[39]。2014年，湖南大学杨荣华教授团队利用目标物与loop区域的特异性亲和、诱导的DNA三螺旋茎环的结构变化、释放第三链，第三链被链霉亲和素包被的硅珠捕获后、促发带有活性巯基(-SH)末端修饰的链式杂交反应(Hybridization chain reaction，HCR)，HCR自组装体与Raman信号分子(4-氨基苯硫酚，4-aminobenzenethiol，4-ABT)修饰的AuNPs共价偶联、实现SERS信号的传感响应[40]。
2.8 电化学TNAs生物传感器电化学TNAs生物传感器是以TNAs作为生物识别元件对输入信号进行识别响应，以电化学响应信号的强度变化，实现对目标物的传感响应的方法。由于电化学传感平台具有制作成本低廉、操作简便、靶标范围广泛等优点，常常将标记有电化学信号分子的核酸链固定在电极表面，依据有无待测物导致的固定化核酸链上信号分子传递电子的效率差别，实现电化学信号(电流、电阻抗和点位等)的表征。1997年，前捷克共和国Emil Palecek教授团队利用固定化的DNA单链利用三核酸DNA的序列特异性结合靶标双链DNA形成三螺旋DNA，TNAs结构中G单元发生电化学氧化传递电子，实现了电化学DNA传感[41]。但利用G氧化传递电子的缺陷是传感体系容易受到外界环境干扰、不利于复杂样品的检测。2014年，罗马大学Francesco Ricci教授团队利用标记有氧化还原反应基团(甲基蓝)的固定化单链DNA序列特异性探针捕获目标DNA单链、形成夹钳状三螺旋DNA、促使甲基蓝与金电极的靠近、导致传递电子的效率增强。利用待测DNA单链的浓度与有效电子传递的正相关关系，实现了单链DNA在复杂血清样本中的单碱基错配区分[28]。由于氧化还原基团标记的固定化探针会增加电化学传感平台的检测成本，2015年，青岛农业大学李峰教授团队利用G-四链体(G-Quadruplex)功能核酸作为免标记的电化学信号分子，使固定化的DNA探针与具有目标DNA互补区域的分子信标链形成茎环状DNA三螺旋、封闭探针链G-四链体的类辣根过氧化物酶活性。当体系中出现目标DNA，目标物与loop区域互补、诱导茎环状DNA三螺旋发生结构转换、暴露出固定化DNA探针链。在氯高铁血红素的诱导下，探针链形成有活性的G-四链体结构，发挥类辣根过氧化物酶活性传递电子，实现电化学信号的输出与目标DNA链的检测[42]。
2.9 pH响应的TNAs生物传感器由于酸性条件促进C质子化、促进平行式C-G*C三螺旋碱基对的稳定形成、从而促进TNAs的稳定形成；而中性条件促进平行式T-A*T三螺旋碱基对的稳定形成、从而促进TNAs的稳定形成[18]，因此由C-G*C、T-A*T组装的三螺旋DNA结构具有pH效应。研究者们开发出了多种具有pH响应效应的TNAs生物传感器。pH响应的TNAs生物传感器的显著特点是通过改变溶液的pH，可视实现传感器可逆化的周期性响应。但由于反应体系的复杂性，其周期性响应的循环次数通常不够理想，需要进一步加强研究。
2.9.1 pH响应的TNAs等温扩增传感器pH响应的TNAs等温扩增传感器是以TNAs为pH响应元件、介导的恒温扩增传感器。2014年，中国科学院樊春海教授与罗马大学Francesco Ricci教授合作研究了两种pH响应模式的DNA链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)传感器。一种是OH-激活的SDA：在OH-诱导下，以C-G*C为主要序列组成的三螺旋结构中的Hoogsteen键断裂形成双螺旋结构，加入侵入链(Invading strand，IS)发生SDA、产生游离的三螺旋第三链、发生后续的SDA。另一种是H+激活的SDA：带有两侧黏性末端的双链S首先与IS杂交结合，在H+诱导下，IS与abc链形成三螺旋DNA、释放b*c*d*链、发生后续的SDA。利用标记在DNA链上的荧光供体基团与荧光受体基团表征pH响应的SDA传感器的搭建[43]。2015年，蒙特利尔大学Alexis Vallee-Belisle教授与罗马大学Francesco Ricci教授合作研究了两种pH响应模式的杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)传感器。在OH-诱导下，储存有HCR自组装能量的发卡tH1的5'末端的Hoogsteen键断裂，暴露出黏性末端，发生后续的HCR；在H+诱导下，HCR激发子链与含有HCR自组装能量的发卡tH1能够形成I·tH1三螺旋结构、链剥离释放cb*黏性末端、发生后续的HCR。利用标记在DNA链上的荧光供体基团与荧光受体基团表征pH响应的HCR传感器的搭建[44]。
2.9.2 pH响应的TNAs纳米开关pH响应的TNAs纳米开关是指以TNAs为pH响应元件、调控所构建的DNA纳米组装体发生结构变化，发挥开关(on-ff)型作用、能够开启或关闭表征信号的两态传感器。2004年，普渡大学Chengde Mao教授利用标记有罗丹明绿与BHQ-1的荧光探针F、长链DNA(L)与断链DNA(S)进行双链自组装体与三链-镊子状自组装体的结构转换，通过改变溶液的pH(5.0-8.0)、可逆性地改变三螺旋DNA的形成与解构，通过FRET与聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)表征了所设计的纳米开关的镊子样非三螺旋-on态与镊子样三螺旋-off态[45]。2015年，北京理工大学张小玲教授，厦门大学康怀志教授与湖南大学谭蔚泓教授合作研究了一种基于C-G*C碱基对的镊子状TNAs纳米开关。该纳米开关由三条链构成，在中性条件下，三条链杂交成长直双链结构，因无法实现FRET，使纳米开关呈现强荧光信号的on态；酸性条件诱导C质子化形成C-G*C碱基对，形成的TNAs不仅使纳米开关的结构变成类镊子样形态，而且发生FRET使纳米开关呈现发出微弱荧光信号的off态，实现了在pH 4.6-7.8范围内对细胞内pH梯度的检测[46]。
2014年，罗马大学Francesco Ricci教授团队通过改变构成三螺旋结构的单链DNA的序列构成，且在单链DNA两侧分别标记荧光供体基团(Alexa Fluor 680和AF680)与荧光淬灭基团(BHQ-1)，通过调节溶液pH，使单分子三螺旋纳米开关在低pH条件下形成链内三螺旋结构、淬灭荧光，纳米开关处于off态；高pH条件下Hoogsteen键断裂形成双螺旋解构、AF680恢复荧光发射，纳米开关处于on态。因此，所构建的单链DNA三螺旋纳米开关实现了跨5.5个pH单位(pH5.5-11.0)的传感检测[18]。
2.9.3 酶促反应介导TNAs的pH传感响应酶促反应介导TNAs的pH传感响应是指以通过酶促反应生成质子或消耗质子，调控TNAs结构的生成或结构、实现信号传感响应的过程。2015年，罗马大学Francesco Ricci教授团队首先研究了酶促反应调控的单链DNA三螺旋纳米开关的on-off状态转换。以谷胱甘肽转移酶催化谷胱甘肽产生质子、调控on型TNAs纳米开关转换为三螺旋结构的off型；以脲酶催化尿素消耗质子、调控off型的具有三螺旋结构的TNAs纳米开关转换为双螺旋结构的on型。然后，研究者建立了酶促反应介导的链替代传感模型：利用脲酶催化尿素消耗质子，调控TNAs的Hoogsteen键断裂、生成双螺旋，再使用侵入链进行链替代反应、输出荧光信号。最后，研究者建立了酶促反应介导的配体释放/携带传感模型：利用乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱释放质子，使与配体链杂交形成双螺旋DNA的单链DNA形成分子内三螺旋组装体、释放配体链；利用脲酶催化尿素消耗质子，破坏单链DNA形成的分子内三螺旋组装体，与配体链杂交生成双螺旋、携带配体链[47]。将酶促反应与TNAs的pH效应组合传感，为拓展TNAs生物传感器在体内的应用奠定了理论基础。
2.9.4 pH响应的纳米粒子的聚集/分散pH响应的纳米粒子的聚集/分散是指通过pH变化调控TNAs的形成与解构、调控纳米粒子间的距离、使纳米粒子发生聚集或分散的传感现象。2006年，成均馆大学Yang-Gyun Kim教授与Insung S. Choi教授合作，预先分别在两种AuNPs表面标记两种不同的核酸链，形成偶联有分子内双链DNA的AuNPs-A与偶联单链DNA的AuNPs-B。在酸性条件(pH5.0)下，C质子化形成C-G*C碱基对、促使两条DNA链形成分子间三螺旋结构、拉近AuNPs-A与AuNPs-B之间的距离，使AuNPs聚沉呈现蓝色。在中性条件(pH6.5)下，C-G*C碱基对中的Hoogsteen键断裂、三螺旋结构解体，AuNPs-A与AuNPs-B之间的距离增大、使AuNPs分散呈现红色，实现了pH调控的AuNPs间可逆的聚沉与分散，通过颜色变化表征AuNPs之间的聚集与分散[36]。2008年，普渡大学Chengde Mao教授预先在一种AuNPs表面标记具有镜像序列的Oligo A链形成A型AuNPs，在另一种AuNPs表面标记与Oligo A链互补的Oligo B链形成B型AuNPs。在中性条件(pH8.0)下，A型AuNPs与B型AuNPs上标记的DNA链杂交使AuNPs之间具有一定的距离；在酸性条件(pH5.0)下，C质子化形成C-G*C碱基对稳定TNAs的结构，拉近A型AuNPs与B型AuNPs之间的距离，产生更强的电子耦合，通过AuNPs的最大吸收峰红移表征AuNPs之间的聚集与分散[48]。
2.9.5 pH响应的DNA折纸单元的低聚/分散DNA折纸(Origami)单元作为一种新型的DNA纳米自组装结构单元，可以使用TNAs发挥桥连作用，实现pH响应的低聚与分散。2015年，以色列希伯来大学Itamar Willner教授团队以TNAs作为DNA折纸单元的桥梁，构建了DNA Origami的二聚体[49]。首先，研究者在DNA Origami单元T3与T4上分别标记(1)链与(2)链，通过(1)链与(2)链的链杂交、使T3与T4形成二聚体；当体系pH调至4.5，C质子化形成C-G*C碱基对、使(1)链形成分子内三螺旋结构，同时发挥桥连作用的分子间双链杂交解构、使二聚体T3/T4分散；当体系pH再次调至7.0，C去质子化导致Hoogsteen键断裂、三螺旋解构，T3与T4重新形成二聚体，实现DNA Origami单元的可逆化的低聚与分散。然后，研究者在DNA Origami单元T5与T6上分别标记(3)链与(4)链，通过(3)链与(4)链的链杂交、形成三螺旋发挥桥连作用、使T3与T4形成二聚体；当体系pH调至9.5，T去质子化导致T-A*T碱基对的Hoogsteen键断裂、三螺旋解构，使二聚体T5/T6分散；当体系pH再次调至7.0，促进T-A*T碱基对与三螺旋结构的形成，T5与T6重新形成二聚体，实现DNA Origami单元的可逆化的低聚与分散。
2.9.6 pH响应的单链闭环DNA的低聚/分离单链闭环DNA作为一种人工DNA纳米结构单元，可以在TNAs的桥连作用下，实现pH响应的低聚与分散。2016年，希伯来大学Itamar Willner教授团队以TNAs作为单链闭环DNA纳米结构单元的桥梁，构建了单链闭环DNA的二聚体[50]。首先，分别合成单链DNA闭环R1与R2，使C1、F1与R1链杂交、稳定R1的环状形态，同时使C2、F2与R2链杂交，稳定R2的环状形态；当体系pH调至7.0，C去质子化无法形成三螺旋结构，桥连链L1与R1链间杂交形成双螺旋、使R1与R2形成二聚体；当体系pH调至4.5，C质子化形成C-G*C碱基对、使桥连链L1与R2形成分子间三螺旋结构，发挥去桥连作用、使二聚体R1/R2分离；当体系pH再次调至7.0，C去质子化导致Hoogsteen键断裂、三螺旋解构，桥连链L1重新与R1链间杂交形成双螺旋、使R1与R2重新形成二聚体，实现单链闭环DNA单元的可逆化的低聚与分离。然后，改变策略、使用桥连链L2与L3连接R1与R2：当体系pH调至7.0，促进T-A*T碱基对的形成，L2、R1与L3形成三螺旋结构，使R1与R2形成二聚体；当体系pH调至10.0，T去质子化导致形成T-A*T碱基对中的Hoogsteen键断裂、三螺旋解构、使使二聚体R1/R2分离；当体系pH再次调至7.0，再次形成T-A*T碱基对、L2、R1与L3形成三螺旋结构、使R1与R2形成二聚体，实现单链闭环DNA单元的可逆化的低聚与分离。
2.9.7 pH响应的微胶囊近年来，微胶囊作为一种有效的药物载体，受到广泛关注。2016年，希伯来大学Itamar Willner教授团队利用碳酸钙(CaCO3)微粒携带冷光量子点硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)，外部包被多聚烯丙胺盐酸盐(Poly- allylamine hydrochloride，PAH)后，五条DNA链自组装、沉积在带正电的PAH外层形成微胶囊；并利用pH响应的TNAs调控了两种微胶囊的解组装[8]。在酸性条件(pH5.0)条件下，富含CG核酸自组装体的微胶囊核酸外层中的C质子化形成C-G*C碱基对、形成分子内三螺旋结构，使微胶囊外部的DNA自组装体解组装，导致微胶囊解组装释放CdSe/ZnS量子点，在620 nm处发射荧光。在碱性条件(pH9.0)下，富含AT核酸自组装体的微胶囊核酸外层中的T去质子化导致T-A*T碱基对中的Hoogsteen键断裂、分子间三螺旋解构，使微胶囊外部的DNA自组装体解组装，导致微胶囊解组装释放CdSe/ZnS量子点，在560 nm处发射荧光。
2.9.8 pH响应的DNA瓦片的自组装/解组装DNA瓦片(DNA tile)作为一种典型的DNA自组装体，常常被视作通过黏性末端杂交互补、形成DNA晶格与DNA管状结构的基本元素[51-52]，在DNA纳米技术中举足轻重。2016年，罗马大学Francesco Ricci将pH响应的TNAs-SDA回路模块化，与DNA tile的自组装反应模块串联，实现了DNA tiles的自组装[53]：在碱性条件下，C去质子化导致C-G*C碱基对中的Hoogsteen键断裂、分子间三螺旋解构激活SDA回路、生成去保护链(Deprotector)；D激活钝化的DNA瓦片单元(Protected tile，PT)自组装形成超分子DNA管状结构，释放荧光信号。2017年，加利福尼亚大学Elisa Franco教授与罗马大学Francesco Ricci教授合作，通过pH变化调控单链DNA三螺旋传感器与调控子(Regulator)的杂交、调控DNA Tiles的自组装与解组装[54]：碱性条件下，C去质子化导致C-G*C碱基对中的Hoogsteen键断裂、单链DNA三螺旋传感器结构，生成的单链与regulator杂交生成双螺旋DNA，钝化regulator、使regulator无法与活性DNA tile的黏性末端杂交，活性DNA tile单元通过黏性末端杂交互补，自组装成为DNA超分子管状结构。酸性条件下，C质子化形成C-G*C碱基对、形成单链DNA三螺旋传感器、使regulator从regulator-构成DNA三螺旋传感器的富CG的链形成的杂交双链中脱落；被剥离后的regulator与活性DNA tile的黏性末端杂交、钝化DNA tile活性单元，使DNA超分子管状结构解组装成单个DNA tiles单元。
2.10 TNAs介导的扩增传感器由于扩增反应体系加入，使TNAs生物传感器往往具有较好的灵敏度；但由于反应体系的复杂性，增加了传感方法建立的难度。2014年，青岛科技大学唐波教授设计了一种以磁纳米粒子-茎环状三螺旋DNA为生物识别元件、利用指数扩增反应(Exponential amplification reaction，EXPAR)放大识别信号的多循环SERS传感器，实现了溶菌酶的高灵敏、通用型、快速检测[55]。首先，目标物溶菌酶通过与磁纳米粒子-茎环状三螺旋DNA的Loop区域亲和、改变三螺旋结构，暴露出的3'端单链区域与标记有SERS生物条形码的Capture DNA杂交，在聚合酶与切刻内切酶的共同作用下、发生EXPAR反应剥离Trigger DNA链，释放的Trigger DNA再次形成磁纳米粒子-茎环状三螺旋结构进入cycle 1；然后，在cycle 2中，cycle 1的EXPAR过程中由切刻内切酶切割、聚合酶剥离的DNA 1能够不断打开磁纳米粒子-茎环状三螺旋结构，与标记有SERS生物条形码的Capture DNA，不断促进cycle 1中的EXPAR扩增效率；在cycle 3中，cycle 1与cycle 2反应过程释放的trigger 1能够不断打开磁纳米离子-茎环结构，暴露的3'端单链区域与标记有SERS生物条形码的Capture DNA杂交，发生EXPAR反应，不断生成的Trigger DNA进入cycle 1促进cycle 1中的EXPAR扩增效率。
2015年，中山大学凌连生教授团队借助TNAs与HCR搭载了一种增强型的电化学双链DNA检测平台[12]。研究者首先在金电极表面共价偶联捕获探针(Capture probe)，当存在目标物双链DNA(dsDNA target)时，加入检测探针(Detection probe)，则capture probe/ dsDNA target/detection probe形成带有单链黏性末端的三螺旋DNA结构；然后，单链黏性末端促发HCR，加入AuNPs表征电化学信号，从而实现对dsDNA target的检测。
同年，凌连生教授团队建立了一种基于TNAs的PCR扩增传感器[56]。利用Tmb的劈裂适配体探针probe A与probe B结合目标物Tmb、形成带有单链区域的双链DNA，在DNA聚合酶的延伸作用下生成完整双链；该双链DNA作为聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)的模板，在上下游引物P1与P2与辅助下生成大量PCR扩增产物；加入分子信标(Molecular beacon，MB)，分子信标的茎环结构被PCR的双链扩增产物打开、形成DNA三螺旋结构，因荧光供体基团与荧光淬灭基团无法发生FRET、荧光信号显著增加，进行对PCR扩增的表征，实现了对Tmb的灵敏检测。
2.11 纳米材料-TNAs生物传感器近年来，具有纳米尺度的新型纳米材料与功能核酸结合，因具有诸多优良性质，如颜色变化、配体携带/释放与相态转变，而受到广泛关注。TNAs作为功能核酸的重要组成成分，与AuNPs粒子共价偶联后、通过pH调节，可以构建基于TNAs与AuNPs的可视化传感器；与DNA origami纳米单元或DNA单链闭环纳米单元共价偶联、通过pH调节，可以实现基于TNAs的DNA纳米单元的低聚与分散。
核酸水凝胶是利用核酸序列的可编辑性、核酸行为的可预知性、功能核酸的功能可控性，通过核酸自组装形成的亲水性三维核酸网状聚合物。基于TNAs的水凝胶主要指通过TNAs对不同外界环境因素的响应(主要指pH变化)，完成水凝胶的胶态-液态相态转化、使包裹在水凝胶中的信号分子在液态时被释放、在胶态时被封闭的“智能水凝胶”。2015年，以色列希伯来大学Itamar Willner教授团队将构成TNAs的两条链分别共价偶联在丙烯酰胺单体上，构建了两种模式的水凝胶胶-液态相态传感转换[57]。在酸性(pH5.0)-中性(pH7.4)不同的pH条件下，中性pH使两条DNA链双链杂交、丙烯酰胺单体链相互交联、形成聚丙烯酰胺凝胶态；酸性pH使其中一条DNA链形成分子内TNAs，聚丙烯酰胺解体生成丙烯酰胺单体，由胶态相变为液态。在中性(pH7.0)-碱性(pH10.0)不同的pH条件下，中性pH使两条DNA链杂交生成TNAs、丙烯酰胺单体链相互交联、形成聚丙烯酰胺凝胶态；碱性pH使分子间TNAs解构、聚丙烯酰胺解体生成丙烯酰胺单体，由胶态相变为液态。如果水凝胶的初次形成在有固定形状的模具中完成，借助丙烯酰胺单体上双螺旋残基的相互作用，可以为水凝胶从液态恢复至固态提供短暂记忆，制作成具有的形状记忆的“智能水凝胶”[58-59]。
除去丙烯酰胺可以作为TNAs水凝胶的单体，TNAs与多聚酰胺(Polyamidoamine，PAMAM G5)、右旋糖酐结合，也可以制作TNAs水凝胶。2016年，哈佛-麻省理工健康科技联合中心的Natalie Artzi教授团队设计了一种基于三链RNA的双色荧光TNAs单元，该TNAs结构能够与多聚酰胺结合、形成稳定的三螺旋纳米颗粒；该三螺旋纳米颗粒与右旋糖酐结合形成TNAs水凝胶，在体内调控癌细胞内源miRNA的表达，从而发挥抗癌作用[10]。目前，基于三螺旋核酸的水凝胶研究仍处于初级的理论探索阶段，其在传感、细胞成像、药物递送等领域具有巨大的应用潜力。
3 三螺旋生物传感器的应用 3.1 TNAs传感器用于单分子成像近些年，研究者将TNAs传感器用于成像领域，并做出了初步探索。2015年，京都大学Masayuki Endo教授与Hiroshi Sugiyama教授合作，将TNAs纳米传感元件应用于单分子成像[60]。研究使用C-G*C与T-A*T两种碱基对构建TNAs纳米结构，将靶标DNA链(1st-strand)与第三条DNA链(3rd-strand)分别标记在DNA origami单元上，当体系中存在第二条DNA链(2nd-strand)，通过Waston-Crick氢键与Hoogsteen键的共同作用形成TNAs结构，使用快速原子力显微镜(Atomic force microscope，AFM)成像技术，可以观察到DNA origami单元的中心形成了X形的交叉节点，即TNAs结构，实现了将TNAs应用于单分子成像。
3.2 TNAs传感器用于配体的携带和释放近些年，研究者将TNAs传感器用于配体的携带与释放，并做出了初步探索。2016年，罗马大学Francesco Ricci教授团队将TNAs结构与劈裂适配体结合，设计了一种通用型、模块化的TNAs传感方法，利用TNAs结构的形成调控目标小分子的携带与释放[61]。首先，研究者通过TNAs的形成拉近了劈裂ATP适配体的空间距离，在加入目标物ATP之后可以有效形成目标物/适配体的超分子聚合物，起到携带小分子目标物的作用；在加入TNAs结构中第三链的互补链competitor之后，competitor与TNAs的第三链结合形成更稳定的双链DNA，破坏TNAs结构，使目标物/适配体的超分子聚合物结合能力下降，从而释放ATP，起到释放小分子目标物的作用。同时，由通用型、模块化的TNAs传感模块也可以用于调控单链DNA的携带与释放。
2017年，希伯来大学Itamar Willner团队将TNAs与金属-有机骨架(Metal-Organic Frame works，MOFs)结合，设计了一种pH响应性的用于配体释放的门控模型[9]。研究者首先将氨基修饰的单链DNA(2)共价修饰到有羧基修饰的MOFs表面；然后将R6G作为模式配体目标物装载到MOFs内部，利用偶联在MOFs表面的单链DNA(2)与单链DNA(3)形成的杂交双链发挥锁式功能、将R6G封锁在MOFs内部(pH 7.4)；当体系pH调至5.5时，C质子化形成的C-G*C碱基对促使单链DNA(3)形成TNAs结构、打开杂交双链，使装载到MOFs内部的R6G分子释放。综上所述，TNAs生物传感器具备携带与释放配体的潜力，但目前的研究仅仅停留在模式分子的研究层面。
3.3 TNAs传感器用于细胞调控2016年，哈佛-麻省理工健康科技联合中心的Natalie Artzi教授团队研究了一种基于RNA序列的TNAs水凝胶传感器[10]。该TNAs水凝胶传感器利用特异的RNA序列识别癌细胞内micro RNA(miRNA)，发挥抑制癌细胞miRNA-221与替换癌细胞miRNA-205的双重功能，在体内调控癌细胞内源miRNA的表达，发挥了抗癌作用。
3.4 TNAs传感器用于检测近年来，TNAs传感器广泛应用于各类目标物的检测，大大推动了快速检测领域的技术革新。基于核酸链的互补、三螺旋核酸的特异性结合与aptamer与目标物的特异亲和，目前TNAs传感器用于检测的目标物类别主要包括：核酸类目标物、细胞类目标物、蛋白类目标物、金属离子类目标、微生物类目标物和抗生素类目标物[27]等。
3.4.1 检测核酸类目标物将TNAs传感器应用于核酸类目标物的检测，使用最为广泛。2013年，罗马大学Francesco Ricci教授团队建立了夹钳状TNAs荧光传感器，基于Waston-Crick氢键与Hoogsteen键形成的TNAs结构，实现了单链DNA的高灵敏度、高特异性检测，能够区分单碱基错配[11]。2013年，福州大学林振宇教授团队建立了基于TNAs的电化学传感器，利用标记有二茂铁的固定化核酸探针捕获双链DNA形成TNAs结构、导致的电化学信号变化，定量检测双链DNA[62]。2017年，湖南大学杨荣华教授与张小华教授团队建立了茎环状TNAs电化学传感器，基于固定在金电极上的DNA探针与标记有二茂铁的DNA探针形成的TNAs结构，在加入单链DNA待测物后的TNAs结构转变、导致的电信号变化，实现了对单链DNA待测物的检测[63]。2017年，湖南大学郑晶教授与杨荣华教授团队合作，将带有荧光基团(Cy5，ROX)标记的茎环状TNAs传感元件偶联在AuNPs上，由于FRET作用AuNPs淬灭了荧光基团的荧光；借助胞吞作用将AuNPs/TNAs超分子复合物摄入细胞后，通过信使RNA(Messenger RNA，mRNA)破坏TNAs结构、释放荧光标记的DNA探针、定量输出荧光信号，实现了细胞内mRNA的定量[64]。
3.4.2 检测细胞类目标物TNAs传感器可以用于细胞类目标物的检测。2014年，山东农业大学张教授团队将TNAs传感器应用于癌细胞的检测[13]。首先，研究者将适配体(Aptamer)链标记在Fe3O4/Au复合纳米颗粒表面，在cDNA链与Aptamer链互补之后，借助氯化甲氧糵因的稳定作用、使cDNA与双链质粒形成稳定的TNAs结构，导入细胞后，TNAs结构如蛋白合成系统、高表达绿色荧光蛋白，实现了对目标细胞的检测。
3.4.3 检测蛋白类目标物TNAs传感器可以用于蛋白类目标物的检测。2016年，GuangfengWang教授团队在姜玮教授利用TNAs传感器检测TF的基础上[14]，利用电化学平台的固定化DNA探针捕获被TF置换下来的单链核酸，进而促发HCR反应，实现了以TF为代表物的蛋白质类的检测[65]。
3.4.4 检测金属离子类目标物TNAs传感器可以用于金属离子类目标物的检测。2007年，伊利诺伊大学Yi Lu教授团队使用含有TNAs结构铜离子依赖型脱氧核酶(DNAzyme)荧光传感器，实现了铜离子的特异性灵敏检测[66]。2016年，济南大学魏琴教授利用T-Hg2+-T形成的分子内杂交双链使茎环状TNAs结构解构、释放出的固定化单链探针利用AuNPs辅助、输出电化学信号，实现Hg2+的检测[67]。
3.4.5 检测微生物类目标物TNAs传感器可以用于微生物类目标物的检测。2017年，中国农业大学罗云波教授团队构建了一种基于茎环状TNAs的可视化传感器[16]。研究者利用大肠杆菌内毒素(脂多糖)与茎环状TNAs传感元件的Aptamer loop区域结合，破坏TNAs结构、释放的单链DNA探针被固定化的捕获DNA探针抓获、促发HCR反应，利用生物素-亲和素标记的辣根过氧化物酶显色系统可视化输出检测信号，实现了大肠杆菌的可视化检测。
4 总结与展望对TNAs生物传感器的研究仍处于初级探索阶段。在理论层面，首先，通用型TNAs传感元件的应用受制于目标物-aptamer与TNAs形成的热动力学平衡，仍需要借助物理化学、数学建模等交叉学科进一步完善通用型TNAs的理论模型、实现通用型分析传感；其次，可逆型TNAs纳米开关的再生效率通常在数次可逆反应后明显降低，如何提高其再生效率及其使用次数仍是亟待解决的问题；最后，目前应用的TNAs传感器的三螺旋序列组成主要局限在T-A*T与C-G*C两种碱基对，探索其他三螺旋碱基对的理论性质、突破TNAs设计的序列枷锁，对TNAs生物传感器的推广应用十分必要。在应用层面，目前的TNAs生物传感器主要应用于快速分析检测领域，处于检测方法的搭建阶段，且有些检测分析方法流程复杂、不易重复再现，距离快速、灵敏、特异的检测目标仍有较大差距。因此，简化TNAs传感器检测方法的设计、增加其检测稳定性仍然任重道远；TNAs生物传感器虽然具备携带与释放配体、细胞内成像的潜力，但其研究仅仅停留在模式目标物的研究层面，距离药物递送、生物成像的应用目标仍有较大差距；TNAs传感器在胞内调控等应用仍处在模型研究阶段，仍要需要继续探索。对于学科发展而言，DNA纳米科技的发展离不开材料学的支撑，目前AuNPs与水凝胶技术的发展已经大大丰富了TNAs生物传感器的搭建，未来新型材料的发展势必会带动纳米级TNAs生物传感器的革新与进步。相信随着科技的进步，TNAs的生物传感器在未来一定会有更为广阔的应用前景。
| [1] |
Wang F, Liu X, Willner I. DNA switches:from principles to applications[J]. Angew Chem, 2015, 54(4): 1098-1129. DOI:10.1002/anie.201404652 |
| [2] |
Seelig G, Soloveichik D, Zhang DY, et al. Enzyme-free nucleic acid logic circuits[J]. Science, 2006, 314(5805): 1585-1588. DOI:10.1126/science.1132493 |
| [3] |
Qian L, Winfree E, Bruck J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades[J]. Nature, 2011, 7356: 368-372. |
| [4] |
Liu X, Lu CH, WIllner I. Switchable reconfiguration of nucleic acid nanostructures by stimuli-responsive DNA machines[J]. Accounts of Chemical Research, 2014, 47(6): 1673-1680. DOI:10.1021/ar400316h |
| [5] |
Felsenfeld G, Davies DR, Rich A. Formation of a 3-stranded polynucleotide molecule[J]. J Am Chem Soc, 1957, 79(8): 2023-2040. DOI:10.1021/ja01565a074 |
| [6] |
Yamagata Y, Emura T, Hidaka K, et al. Triple helix formation in a topologically controlled DNA nanosystem[J]. Chemistry, 2016, 22(16): 5494-5498. DOI:10.1002/chem.201505030 |
| [7] |
Porchetta A, Idili A, Vall Eb Lisle A, et al. General strategy to introduce pH-Induced allostery in DNA-based receptors to achieve controlled release of ligands[J]. Nano Lett, 2015, 7: 4467-4471. |
| [8] |
Liao WC, Riutin M, Parak WJ, et al. Programmed pH-responsive microcapsules for the controlled release of CdSe/ZnS quantum dots[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8683-8689. DOI:10.1021/acsnano.6b04056 |
| [9] |
Kahn JS, Freage L, Enkin N, et al. Stimuli-responsive DNA-functionalized metal-organic frameworks(MOFs)[J]. Adv Mater, 2017, 29(6). |
| [10] |
Conde J, Oliva N, Atilano M, et al. Self-assembled RNA-triple-helix hydrogel scaffold for microRNA modulation in the tumour microenvironment[J]. Nat Mater, 2016, 3: 353-363. |
| [11] |
Idili A, Plaxco KW, Vallée-Bélisle A, et al. Thermodynamic basis for engineering high-affinity, high-specificity binding-induced DNA clamp nanoswitches[J]. ACS Nano, 2013, 12: 10863-10869. |
| [12] |
Li Z, Miao X, Xing K, et al. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 74: 687-690. |
| [13] |
Xi D, Wang X, Ai S, et al. Detection of cancer cells using triplex DNA molecular beacons based on expression of enhanced green fluorescent protein(eGFP)[J]. Chem Commun, 2014, 50(67): 9547-9549. DOI:10.1039/C4CC03925D |
| [14] |
Zhu D, Zhu J, Zhu Y, et al. Sensitive detection of transcription factors using an Ag+-stabilized self-assembly triplex DNA molecular switch[J]. Chem Commun, 2014, 50(95): 14987-14990. DOI:10.1039/C4CC06205A |
| [15] |
Liu JW, Lu Y. A DNAzyme Catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu2+ ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity[J]. J Am Chem Soc, 2007, 32: 9838-9839. |
| [16] |
Xu W, Tian J, Shao X, et al. A rapid and visual aptasensor for Lipopolysaccharides detection based on the bulb-like triplex turn-on switch coupled with HCR-HRP nanostructures[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2016, 89(2): 795-801. |
| [17] |
Maher LJ, Dervan PB, Wold BJ. Kinetic analysis of oligodeoxyribo-nucleotide-directed triple-helix formation on DNA[J]. Biochemistry, 1990, 29(37): 8820-8826. DOI:10.1021/bi00489a045 |
| [18] |
Idili A, Vall Eb Lisle A, Ricci F. Programmable pH-triggered DNA nanoswitches[J]. J Am Chem Soc, 2014, 16: 5836-5839. |
| [19] |
Trkulja I, H Ner R. Monomeric and heterodimeric triple helical DNA mimics[J]. J Am Chem Soc, 2007, 129(25): 7982-7989. DOI:10.1021/ja0715501 |
| [20] |
Antony T, Thomas T, Sigal LH, et al. A molecular beacon strategy for the thermodynamic characterization of triplex DNA: Triplex Formation at the Promoter Region of Cyclin D1[J]. Development Genes & Evolution, 2001, 212(8): 365-373. |
| [21] |
Antony T, Subramaniam V. A molecular beacon strategy for real-time monitoring of triplex DNA formation kinetics[J]. Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12(3): 145-147. |
| [22] |
Ihara T, Ishii T, Araki N, et al. Silver ion unusually stabilizes the structure of a parallel-motif DNA triplex[J]. J Am Chem Soc, 2009, 131(11): 3826-3827. DOI:10.1021/ja809702n |
| [23] |
Han MS, Lyttonjean AK, Mirkin CA. A gold nanoparticle based approach for screening triplex DNA binders[J]. J Am Chem Soc, 2006, 128(15): 4954-4955. DOI:10.1021/ja0606475 |
| [24] |
Patterson A, Caprio F, Vall Eb Lisle A, et al. Using triplex-forming oligonucleotide probes for the reagentless, electrochemical detection of double-stranded DNA[J]. Anal Chem, 2010, 82(21): 9109-9115. DOI:10.1021/ac1024528 |
| [25] |
Zheng J, Li J, Jiang Y, et al. Design of aptamer-based sensing platform using triple-helix molecular switch[J]. Anal Chem, 2011, 83(17): 6586-6592. DOI:10.1021/ac201314y |
| [26] |
Du Y, Mao Y, He X, et al. A signal on aptamer-based electrochemical sensing platform using a triple-helix molecular switch[J]. Analytical Methods, 2014, 6(16): 6294-6300. DOI:10.1039/C4AY00807C |
| [27] |
Ramezani M, Danesh NM, Lavaee P, et al. A novel colorimetric triple-helix molecular switch aptasensor for ultrasensitive detection of tetracycline[J]. Biosens Bioelectron, 2015, 70: 181-187. DOI:10.1016/j.bios.2015.03.040 |
| [28] |
Idili A, Amodio A, Vidonis M, et al. Folding-upon-binding and signal-on electrochemical DNA sensor with high affinity and specificity[J]. Anal Chem, 2014, 86(18): 9013-9019. DOI:10.1021/ac501418g |
| [29] |
Kandimalla ER, Agrawal S. Hoogsteen DNA duplexes of 3'-3'- and 5'-5'-linked oligonucleotides and trip formation with RNA and DNA pyrimidine single strands:experimental and molecular modeling studies[J]. Biochem, 1996, 48: 15332-15339. |
| [30] |
Betts L, Josey JA, Veal JM, et al. A nucleic acid triple helix formed by a peptide nucleic acid-DNA complex[J]. Science, 1995, 270(5243): 1838-1841. DOI:10.1126/science.270.5243.1838 |
| [31] |
Baker ES, Hong JW, Gaylord BS, et al. PNA/dsDNA complexes:site specific binding and dsDNA biosensor applications[J]. J Am Chem Soc, 2006, 128(26): 8484-8492. DOI:10.1021/ja060069s |
| [32] |
Li K, Liu B. Conjugated polyelectrolyte amplified thiazole orange emission for label free sequence specific DNA detection with single nucleotide polymorphism selectivity[J]. Anal Chem, 2009, 81(10): 4099-4105. DOI:10.1021/ac9003985 |
| [33] |
Tom G, Lars R, Oliver S. Triplex molecular beacons as modular probes for DNA detection[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2007, 46(27): 5223-5225. DOI:10.1002/(ISSN)1521-3773 |
| [34] |
Hamidi-Asl E, Raoof JB, Ojani R, et al. A new peptide nucleotide acid biosensor for electrochemical detection of single nucleotide polymorphism in duplex DNA via triplex structure formation[J]. J Iran Chem Soc, 2013, 10(6): 1075-1083. DOI:10.1007/s13738-013-0254-0 |
| [35] |
马小明, 孙密, 林悦, 等. 基于金纳米材料的可视化生物传感器的研究进展[J]. 分析化学, 2018, 1(46): 1-10. |
| [36] |
Jung YH, Lee KB, Kim YG, et al. Proton-fueled, reversible assembly of gold nanoparticles by controlled triplex formation[J]. Angew Chem, 2006, 45(36): 5960-5963. DOI:10.1002/(ISSN)1521-3773 |
| [37] |
Xiong C, Wu C, Zhang H, et al. Gold nanoparticles-based colorimetric investigation of triplex formation under weak alkalic pH environment with the aid of Ag+[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2011, 79(5): 956-961. DOI:10.1016/j.saa.2011.04.002 |
| [38] |
Zheng J, Jiao A, Yang R, et al. Fabricating a reversible and regenerable Raman-active substrate with a biomolecule-controlled DNA nanomachine[J]. J Am Chem Soc, 2012, 134(49): 19957-19960. DOI:10.1021/ja308875r |
| [39] |
Guerrini L, Mckenzie F, Wark AW, et al. Tuning the interparticle distance in nanoparticle assemblies in suspension via DNA-triplex formation:correlation between plasmonic and surface-enhanced Raman scattering responses[J]. Chem Sci, 2012, 7: 2262-2269. |
| [40] |
Zheng J, Hu Y, Bai J, et al. Universal surface-enhanced Raman scattering amplification detector for ultrasensitive detection of multiple target analytes[J]. Anal Chem, 2014, 4: 2205-2212. |
| [41] |
Cai X, Rivas G, Shirashi H, et al. Electrochemical analysis of formation of polynucleotide complexes in solution and at electrode surfaces[J]. Anal Chim Acta, 1997, 344(1): 65-76. |
| [42] |
Wang X, Jiang A, Hou T, et al. A versatile label-free and signal-on electrochemical biosensing platform based on triplex-forming oligonucleotide probe[J]. Anal Chim Acta, 2015, 890: 91-97. DOI:10.1016/j.aca.2015.06.059 |
| [43] |
Amodio A, Zhao B, Porchetta A, et al. Rational design of pH-controlled DNA strand displacement[J]. J Am Chem Soc, 2014, 136(47): 16469-16472. DOI:10.1021/ja508213d |
| [44] |
Idili A, Porchetta A, Amodio A, et al. Controlling hybridization chain reactions with pH[J]. Nano Lett, 2015, 8: 5539-5544. |
| [45] |
Chen Y, Lee SH, Mao C. A DNA nanomachine based on a duplex-triplex transition[J]. Angew Chem, 2010, 43(40): 5335-5338. |
| [46] |
Yang M, Zhang X, Liu H, et al. Stable DNA nanomachine based on duplex-triplex transition for ratiometric imaging instantaneous pH changes in living cells[J]. Anal Chem, 2015, 12: 5854-5859. |
| [47] |
Erica DG, Anne-Marie D, Alexis VB, et al. Enzyme-operated DNA-based nanodevices[J]. Nano Lett, 2015, 15(12): 8407-8411. DOI:10.1021/acs.nanolett.5b04566 |
| [48] |
Chen Y, Mao C. pH-induced reversible expansion/contraction of gold nanoparticle aggregates[J]. Small, 2010, 12: 2191-2194. |
| [49] |
Wu N, Willner I. pH-stimulated reconfiguration and structural isomerization of origami dimer and trimer systems[J]. Nano Lett, 2016, 16(10): 6650-6655. DOI:10.1021/acs.nanolett.6b03418 |
| [50] |
Hu Y, Ren J, Lu CH, et al. Programmed pH-driven reversible association and dissociation of interconnected circular DNA dimer nanostructures[J]. Nano Lett, 2016, 16(7): 4590-4594. DOI:10.1021/acs.nanolett.6b01891 |
| [51] |
Fu TJ, Seeman NC. DNA double-crossover molecules[J]. Biochemistry, 1993, 32(13): 3211-3220. DOI:10.1021/bi00064a003 |
| [52] |
Rothemund PW, Ekani-Nkodo A, Papadakis N, et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126(50): 16344-16352. DOI:10.1021/ja044319l |
| [53] |
Amodio A, Adedeji AF, Castronovo M, et al. pH-controlled assembly of DNA tiles[J]. J Am Chem Soc, 2016, 138(39): 12735-12738. DOI:10.1021/jacs.6b07676 |
| [54] |
Green LN, Amodio A, Hkk S, et al. pH-driven reversible self-assembly of micron-scale DNA scaffolds[J]. Nano Lett, 2017, 17(12): 7283-7288. DOI:10.1021/acs.nanolett.7b02787 |
| [55] |
Ye S, Wu Y, Zhang W, et al. A sensitive SERS assay for detecting proteins and nucleic acids using a triple-helix molecular switch for cascade signal amplification[J]. Chem Commun, 2014, 50(66): 9409-9412. DOI:10.1039/C4CC03988B |
| [56] |
Li Y, Miao X, Ling L. Triplex DNA:A new platform for polymerase chain reaction-based biosensor[J]. Sci Rep, 2015, 5: 13010-13013. DOI:10.1038/srep13010 |
| [57] |
Ren J, Hu Y, Lu C H, et al. pH-responsive and switchable triplex-based DNA hydrogels[J]. Chem Sci, 2015, 6(7): 4190-4195. DOI:10.1039/C5SC00594A |
| [58] |
Hu Y, Lu CH, Guo W, et al. A shape memory acrylamide/DNA hydrogel exhibiting switchable dual pH-responsiveness[J]. Adv Funct Mater, 2016, 25(44): 6867-6874. |
| [59] |
Hu Y, Guo W, Kahn JS, et al. A Shape-memory DNA-based hydrogel exhibiting two internal memories[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2016, 55(13): 4210-4214. DOI:10.1002/anie.201511201 |
| [60] |
Yamagata Y, Emura T, Hidaka K, et al. Triple helix formation in a topologically controlled DNA nanosystem[J]. Chemistry, 2016, 22(16): 5494-5498. DOI:10.1002/chem.201505030 |
| [61] |
Del GE, Idili A, Porchetta A, et al. A modular clamp-like mechan-ism to regulate the activity of nucleic-acid target-responsive nanos-witches with external activators[J]. Nanoscale, 2016, 8(42): 18057-18061. DOI:10.1039/C6NR06026A |
| [62] |
Zheng H, Ma X, CHen L, et al. Label-free electrochemical impedance biosensor for sequence-specific recognition of double-stranded DNA[J]. Analytical Methods, 2013, 19: 5005-5009. |
| [63] |
Xiong E, Li Z, Zhang X, et al. A triple-helix molecular switch electrochemical ratiometric biosensor for ultrasensitive detection of nucleic acids[J]. Anal Chem, 2017, 89(17): 8830-8835. DOI:10.1021/acs.analchem.7b01251 |
| [64] |
Tang P, Zheng J, Tang J, et al. Programmable DNA triple-helix molecular switch in biosensing applications:from in homogenous solutions to in living cells[J]. Chem Commun, 2017, 53(16): 2507-2510. DOI:10.1039/C6CC09496A |
| [65] |
Xiong Y, Lin L, Zhang X, et al. Label-free electrochemiluminescent detection of transcription factors with hybridization chain reaction amplification[J]. RSC Advances, 2016, 6(44): 37681-37688. DOI:10.1039/C6RA00701E |
| [66] |
Liu J, Lu Y. A DNAzyme catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu2+ ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity[J]. J Am Chem Soc, 2007, 129(32): 9838-9939. DOI:10.1021/ja0717358 |
| [67] |
Wang H, Zhang Y, Ma H, et al. Electrochemical DNA probe for Hg2+ detection based on a triple-helix DNA and Multistage Signal Amplification Strategy[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2016, 86: 907-912. |