衰老常伴随着相关性疾病的发生，包括各组织、器官疾病如恶性肿瘤、动脉粥样硬化、组织/器官纤维化等^[1]。因此，延缓衰老进程中免疫系统的“老化”是重要的研究方向。造血干细胞是所有免疫细胞和血细胞的源泉，是机体免疫监控的发出者。HSCs经分化，形成MPPs，经再分化形成共同淋巴系祖细胞（Common lymphocyte progenitors cells，CLPs）和共同髓系祖细胞（Common myeloid progenitor cells，CMPs），前者经一系列的分化形成B淋巴细胞、T淋巴细胞，NK细胞，形成获得性免疫系统的细胞组分；后者继续分化为GMPs和MEPs（Megakaryocyte/erythroid progenitor cells，巨核细胞/红细胞祖细胞），GMPs经一系列的分化形成先天免疫系统的细胞组分（粒细胞，巨噬细胞等）^[2-3]。然而，当外伤感染，肿瘤等病理情况下，GMPs的子细胞会停留在未成熟的状态，该组分的细胞被称之为“髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）”^[4]。MDSCs能抑制T细胞的活化与增殖，是细胞免疫失能的“原凶”^[5]。因此，本研究从免疫的源头出发，分析HSCs及其下游造血祖细胞的发育情况，以诠释衰老进程中免疫系统“老化”，逐渐失能，致使更多伴随衰老进程疾病发生的原因。本研究将为衰老进程中机体免疫下降提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

本实验使用C57BL/6j小鼠，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，维持于广西师范大学实验室动物中心。选择8周（青年小鼠）、1年（中年）、2年（老年）的健康雄鼠用于实验。

1.1.2 实验试剂和耗材

红细胞裂解液（Solarbio），胎牛血清、DMEM basic（Gibco），Fixation/Permeabi-lization buffer、7-AAD、Anti-Mouse CD34-PE、Anti-Mouse Lin-FITC、Anti-Mouse CD127-PerCP Cy5.5、Anti-Mouse CD117-APC eFlour 780、Anti-Mouse Sca-1-PE-Cy7、Anti-Mouse CD16/32-APC、Anti-Mouse Gr-1-PE、Anti-Mouse CD11b-APC、Anti-Mouse B220-FITC、Anti-Mouse/Human Ki67-PE、Anti-Mouse CD127-PerCP-Cy5.5（eBioscience），70ul细胞筛网（BD）。

1.1.3 实验仪器

流式细胞分析仪（BD FACSVe-rse），冷冻离心机Labofuge 400 R、超纯净去离子水组合系统Nanopure（Thermo Scientific）。

1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓细胞（Bone marrow cells，BMs）的提取

断颈处死小鼠，将小鼠浸泡于75%酒精20 s；取其股骨和胫骨，并剪去骨两端；用吸取DMEM完全培养液（含1%双抗，10% FBS）的注射器吹出骨髓组织；随后用移液枪将骨髓吹打成单细胞悬液，并收集于离心管中。经离心（4℃，1 200 r/min，5 min，下同）后，加入红细胞裂解液裂解2 min，之后加入PBS稀释终止裂解并经离心后弃上清，加入PBS重悬细胞，经过滤后用70 μm细胞筛过滤，经计数后待用。

1.2.2 小鼠造血细胞丰度分析

分别取青年、中年、老年小鼠骨髓2×10⁶细胞，经离心后与特定抗体组合（各取1test抗体经混合后再稀释100倍）混合均匀，将细胞置于4℃避光孵育30 min。孵育结束后洗涤细胞，加人1.5 mL PBS用于流式分析。同时准备空白对照组细胞和孵育单独抗体的细胞，分别用于流式细胞仪电压和补偿调节。

1.2.3 小鼠造血干/祖细胞活化与周期分析

细胞经1.2.2行抗体孵育，用Fixation/Permeabilization buffer进步固定渗透（按该试剂盒说明书上执行）。经渗透结束后经离心，去上清，加入稀释100倍的Ki-67，避光、4℃孵育30 min（活化分析）。或加入500 μL PBS，重悬细胞，再加入5 μL7-AAD后常温避光孵育15 min（细胞周期分析），用于流式细胞分析其Ki67⁺细胞或细胞周期时相分布。

1.2.4 数据分析与处理

流式数据用Flowjo7.6上分析；所得整理数据在prism软件上行Two-way ANOVA分析或t检验。

2 结果 2.1 小鼠衰老进程中HSPCs丰度发生特征性变化

为分析随年龄增长小鼠HSPCs的丰度变化，分别从老年、中年和青年C57BL/6j小鼠中提取骨髓细胞，标记荧光偶联抗体，行流式细胞术分析。结果发现在衰老进程中造血干/祖细胞丰度发生特征性变化（图 1）。青年小鼠、中年小鼠、老年小鼠骨髓细胞中HSCs、MPPs的丰度随着年龄的增加逐渐升高（HSCs：0.009±0.002%VS 0.019±0.005%VS 0.061±0.013%；MPPs：0.238±0.016% VS 0.301±0.011% VS 0.332±0.023%，P < 0.05）。与之相似的先天免疫细胞的祖细胞GMPs随着年龄的增加其在骨髓细胞中的比例也逐渐升高（0.608±0.106% VS 1.023±0.125% VS 1.330±0.089%，P < 0.05）。但处于MPPs和GMPs之间的CMPs随着年龄的增加反而逐渐降低（0.583±0.103% VS 0.388±0.052% VS 0.227±0.032%，P < 0.05）。巨核细胞/红细胞祖细胞随小鼠年龄增加未表现出明显的变化。随着小鼠年龄增长，其造血干/祖细胞发生的特征变化提示HSCs可能逐渐被活化，细胞得以增殖累积，且偏向髓系细胞分化。

2.2 小鼠衰老进程中HSPCs增殖活性改变

为分析小鼠骨髓HSPCs增殖活性是否改变，首先分析了HSCs的激活情况；其次分析了造血干/祖细胞是否加速细胞分裂；利用Ki67和7-AAD检测不同年龄阶段的小鼠HSCs退出静息和HSPCs进入细胞周期的情况。结果显示，小鼠随着年龄的增加，HSCs退出G0期（Ki67⁺）的细胞增多。相比青年小鼠，老年小鼠HSCs更多被活化（老年：青年=0.096±0.020% VS 0.018±0.003%），进入细胞周期（图 2-A）。与之相一致的是，随着小鼠年龄的增加，HSCs进入分裂期（S/G2/M）的频率增加（图 2-B）。小鼠骨髓造血祖细胞随着年龄增长，细胞周期时相同样的发生显著性改变。与细胞丰度检测结果一致，MPPs、GMPs随年龄增加进入分裂期的细胞比例也增加，细胞分裂活跃。CMPs在中、老年小鼠骨髓中分裂期的细胞减少。MEPs分裂期的细胞比例在小鼠衰老进程中并未发生明显改变。以上结果揭示了随着小鼠年龄的增长，其部分HSCs被活化，经过快速分裂和细胞增殖，细胞得以累积；同时细胞加速分化形成下游细胞，并偏向髓系祖细胞分化。

2.3 小鼠衰老进程中HSPC偏向髓系分化

为进一步验证在衰老进程中小鼠骨髓HSPCs是偏向髓系方向分化的，本研究利用流式细胞术检测了骨髓中免疫细胞产生情况（因T细胞成熟于胸腺，故未进行T细胞含量的分析）。结果（图 3）表明，老年小鼠骨髓中B淋巴细胞（B220⁺）明显减少（老年：青年=8.14±1.84% VS 20.72±2.22%，图 3-A）。同时，老年小鼠骨髓中髓源性抑制细胞（Gr-1⁺CD11b⁺）比例显著高于青年小鼠中的髓源性抑制细胞（55.90±5.47% VS 32.4±1.42%，图 3-B）。该结果证明了衰老进程中，小鼠HSCs偏向髓系方向分化，且免疫抑制细胞群在积累。

3 讨论

包括癌症在内的许多人类疾病的发病率会随着年龄的增加而提高^[6]，这些疾病增加的原因之一是免疫系统“老化”。造血干细胞作为免疫系统的发出者，是衰老进程中免疫下降、免疫细胞失衡的根本原因。为此检测造血干/祖细胞在衰老进程中的细胞丰度、活化、增殖情况，并初步分析了免疫细胞的组分变化。据研究结果得出如下结论：（1）在衰老进程中HSPCs丰度增加，细胞增殖活跃；（2）HSCs的分化偏向髓系抑制细胞，产生大量GMPs和经典的髓源性抑制细胞。衰老与肿瘤、应急等病理情况有着相似的HSPCs丰度变化特征。在肿瘤进程中，HSCs大量激活与扩增，并促进下游MPPs、GMP积累，髓源性抑制细胞也积累，促进免疫抑制^[7]；在感染状态下，HSCs同样得到活化，髓系细胞增殖加速^[8-9]。揭示了HSC活化、髓系扩增是衰老和应急状态下的一个共同特征。

HSCs的偏向分化在HSCs自我更新中就得以发展。Weksberg等^[10]发现侧群细胞（Side population，SP）CD150⁺或LSK（Lin^-Sca-1⁺CD117⁺）CD150⁺的造血干细胞亚群在老年（80week）小鼠中明显高于青年小鼠（8week），该群细胞经体内分化主要向髓系细胞分化，提示了该亚群的HSCs的偏髓系分化源于HSCs本身的髓系偏向。其他的研究也表明，表型LKS CD34-Flt3-的HSCs CD150上调表达，随着年龄的增长，该亚群细胞在整个老年HSCs池中的占有支配地位。该HSCs亚群移植重建后的造血发生了骨髓细胞偏倚^[11-12]。基于这些结果与研究结论为本研究中髓系细胞偏向分化给予佐证。

本研究组的前期研究提出了早期造血祖细胞（主要是GMP）具有免疫抑制功能^[7]。然而在衰老进程中，HSCs的活化和扩增，以及MPP的扩增的最终目的可能是为GMP及更下游的髓系细胞的积累“服务”（基于在衰老进程中造血细胞的偏髓系分化发育）。积累的髓系细胞明显为免疫抑制奠定了细胞基础，以致衰老伴随着高频率疾病的发生。本研究虽然未提供免疫抑制的直接证据，但正常来源GMPs和MDSCs同样有着免疫抑制功能，这在本研究组之前的工作中已经得到证实。另外，在衰老进程中CD8⁺ T细胞增殖能力减弱，未成熟的T细胞大量积累^[13]。以上足以证明髓系抑制细胞在T细胞的增殖与活化中可能发挥着重要的抑制作用。

近年来HSLs经典的分化通路受到冲击。Adolfsson^[14]提出MPPs直接分化形成GMPs和MEPs，没有CMPs的存在。同样地，在人类HSCs中也得到了相同的结果^[15]。本研究中CMPs的丰度会随着衰老进程和肿瘤发生^[7]而细胞比例下降，与髓系扩增虽然相矛盾，但这一现象可能为Adolfsson J提出分化通路提供参考。

衰老免疫主要问题之一是免疫细胞失衡，因此针对免疫细胞失衡可开展如下工作：着重从免疫细胞的源头——HSCs上解决髓系偏向分化的问题，促进免疫细胞平衡发育；提高老年机体免疫器官功能作用，防范如老年胸腺等器官的衰竭，提高老年机体获得性免疫细胞的再生能力；促进髓系细胞成熟发育，减少未成熟细胞、髓系抑制细胞的积累。

4 结论

本研究发现在小鼠骨髓细胞中HSCs和MPPs、GMPs的丰度随着年龄的增加而显著升高，细胞分裂能力增强。GMP及其下游的髓系抑制细胞积累。结果揭示了在衰老进程中HSCs被活化，增殖并偏向髓系抑制细胞分化与积累，抑制机体免疫功能。