2. 上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306;
3. 上海海洋大学水产科学国家级实验教示范中心，上海 201306
2. Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;
3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306
鳜（Siniperca chuatsi）属硬骨鱼纲、鲈形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、鳜属（Siniperca），俗称季花鱼、桂花鱼，其肉质细嫩、营养丰富、没有小刺，是我国传统淡水名贵经济鱼类。自20世纪80年代以来，鳜人工繁殖技术的突破推动了其养殖业的发展。目前鳜产业年产值超200亿元，但在养殖过程中也存在品种退化、病害频发等问题，鳜良种选育仍然是提高其产量和品质的首要途径。
成熟的microRNA（miRNA）是一类20-24 nt的非编码小分子RNA，其在进化和功能上均具有保守性[1]。通常，miRNA与靶基因mRNA的3'端非编码区（3'-untranslated region，3'-UTR）不完全互补配对结合，引起靶基因mRNA的降解，从而负调控靶基因的表达，即在转录后水平上影响表型[2]。miRNA的发现和技术的成熟，丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对靶mRNA进行更有效调节的机制，展现了细胞内基因表达调控全方位、多层次的信号网络系统。
miRNA的研究对象遍及动物、植物和微生物，且miRNA几乎参与从生物胚胎发育到死亡的生命阶段所有的生物过程[3]。miRNA在水产动物（鱼、虾、蟹、贝）中也有研究报道，如miR-430在斑马鱼胚胎发育阶段的表达和功能[4]。有关鳜miRNA的研究起步较晚，数量也较少，可分为miRNA转录组和单个miRNA两类研究。迄今为止，通过高通量测序研究鳜miRNA转录组的报道有3篇：第一篇见于2013年，该研究以翘嘴鳜红肌（慢肌）与白肌（快肌）为研究对象，发现了186个保守和3个新miRNAs，在两种肌肉纤维中存在60个显著差异表达miRNA[5]；以饲养6个月后的慢长和快长翘嘴鳜为研究对象，混合大脑、脑垂体、肝脏和肌肉样本，发现252个已知miRNAs和12个新miRNAs，其中36个miRNAs在组间表达差异显著[6]；以孵化后第30天的慢长和快长翘嘴鳜肌肉为材料，鉴定出433个保守miRNAs，组间8个差异miRNAs[7]。就单个miRNA而言，miRNA-181a通过靶定小清蛋白（Parvalbumins，PVALBs）而影响鳜肌肉松弛率[8]；miR-143可以通过调控靶基因肌分化因子（MyoD）而促进成肌细胞增殖和肌肉增生[9]；对翘嘴鳜进行饥饿后再投喂，miR-10c、miR-107a、miR-133a-3p、miR-140-3p、miR-181a-5p、miR-206、miR-214[10]和miR-222[11]的相对表达会显著上调，上述miRNAs可能与鳜鱼骨骼肌快速生长相关。此外，还发现温度升高会降低miR-146a在鳜胚胎发育各个时期的表达[12]。，
综上所述，目前关于鳜miRNA转录组的研究多以肌肉等不同组织为研究对象，鱼龄最低为孵化后30 d，研究的单个miRNA大部分与鳜鱼骨骼肌发育相关。为了深入理解鳜的发育机制，本研究以鳜孵化后第3天、第17天和第28天的全鱼为材料，通过高通量测序建立上述各阶段miRNA组，并选取miR-199-5p和miR-203b进一步分析其可能的mRNA靶基因及相关的调控通路。本研究首次了解鳜孵化后前30 d内miRNAs表达特征、可以为深入了解miRNA对鳜胚胎发育过程的调控作用奠定基础、丰富有关miRNAs和靶基因间作用的认知，也可为鳜分子标记辅助育种提供候选基因。
1 材料与方法 1.1 材料实验用鳜鱼苗取自上海市浦东新区孙农水产养殖场。亲鱼经激素催产、人工授精。受精卵在直径70 cm的孵化桶中孵化，水温为23-25℃。孵化当天记为第0天（D0），分别在孵化后第3天（D3）、第17天（D17）、第28天（D28）、第60天（D60），第90天（D90）取样，每批随机取20-50尾（日龄越小取样越多）。取其中15尾D3，10尾D17、5尾D28全鱼分别混合后用于小RNA测序文库制备（图 1）。其余样品用于荧光定量分析，荧光定量分析前需做如下处理：D17、D28样本去除头、尾，D60、D90样本采集白肌（去除鳞片后背鳍起点下背侧第一肌节区域）。另取3尾体重500 g左右的健康鳜，用MS-222麻醉，于冰上解剖，取肝、脑、肠、白肌样本用于组织表达谱分析。所有样品分装于冻存管，迅速置于液氮中，并长期存放于-80℃冰箱备用。
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| 图 1 孵化后D3、D17和D28鳜形态 |
采用Trizol法提取样品的总RNA，使用紫外分光光度计（Eppendorf BioPhotometer）和琼脂糖/EB凝胶电泳法分别确定总RNA的纯度和完整性。取质量较好的RNA样品用于相关分析。采用TruSeqSmall RNA Sample Prep Kits（Illumina，San Diego，USA）试剂盒制备小RNA测序文库。流程如下：用T4 RNA连接酶2将腺苷化单链DNA 3'接头和5'接头连接到小RNA上，进行反转录反应，对反转录产生的cDNA序列进行PCR扩增，将140-160 bp长度范围的PCR产物用6% polyacrylamide Tris-borate-EDTA胶回收，完成文库的制备，对构建好的文库用Illumina Hiseq2000/2500进行测序，测序读长为单端1X50 bp。
1.2.2 miRNA组数据分析使用联川生物公司开发的软件处理数据。首先，清理由于样本制备、测序接头、非典型miRNA特征序列以及测序仪器光学数码处理而产生的非纯序列，保留碱基长度在18-26 nt序列。然后，将剩余序列比对RFam数据库和重复序列数据库（Repbase）以去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。经清理、过滤后的数据称之为Valid数据并用于后续分许。鳜尚无基因组数据，故以斑马鱼基因组为参考。使用Bowtie软件与miRbase21.0斑马鱼及其他脊椎动物的己知的miRNA进行保守性分析比对，并鉴定出鳜3个不同发育时期的miRNAs。在比对分析中允许5'和3'末端长度变化以及序列内部存在一个错配的情况。用Expdiff方法两两比较并判断不同发育阶段样品中miRNA的表达量是否存在显著差异。利用维恩图（Venn diagrams）直观地显示出样品两两间共同检出的miRNA个数以及差异miRNA的个数。
1.2.3 引物设计及合成根据鳜MyoD（Gene ID：JN561167.1）、斑马鱼Wnt5b（Gene ID NM_130937）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_130937。用Primer Premier 6.0软件设计并由上海生工生物工程有限公司合成相关引物，序列见表 1。
利用定量RT-PCR检测miR-199-5p / miR-203b在肝、脑、肠、白肌及在D3、D17、D28、D60和D90的相对表达量。
1.2.5 miR-199-5p和miR-203b的靶基因验证设计并合成靶基因3'UTR区域包含miR -203b作用位点及突变的引物序列（表 1），上游引物插入XhoⅠ酶切位点CTCGAG，下游引物插入NotⅠ酶切位点GCGGCCGC（表 1序列中下画线部分）。PCR产物经过纯化后与psiCHECKTM-2载体相连后进行测序，测序正确的质粒命名为psiCHECKTM2- MyoD-3'-UTR（wt）和psiCHECKTM2- MyoD-3'-UTR（mutant）。培养293T细胞系，将细胞接种到96孔板中，待细胞密度达到70%时，将miR-203b mimic分别和psiCHECKTM2-MyoD-3'-UTR（wt）和psiCHECKTM2- MyoD-3'-UTR（mutant）进行共转染，以psiCHECKTM-2为对照，按Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书步骤检测细胞荧光素酶表达量，重复3次。另构建miR-199-5p靶基因质粒psiCHECKTM2-Wnt-3'-UTR（wt）和psiCHECKTM2- Wnt-3'-UTR（mutant），实验操作同上。本实验所用293T细胞系、psiCHECK -2空载体购自ATCC生物公司（美国）。
1.2.6 Myod/Wnt在孵化后90 d内的表达变化利用定量RT-PCR检测Myod / Wnt mRNA在D3、D17、D28、D60和D90的相对表达量。
1.2.7 数据分析应用荧光定量比较Ct值法（2-△△Ct法）分析各基因相对表达量。细胞试验重复处理3次，数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法进行多组样本间差异显著性分析，以P < 0.05作为统计意义上的显著水平。
2 结果 2.1 孵化后30 d内3个时期鳜miRNA转录组测序与分析以孵化后不同发育时期（D3、D17和D28）的鳜全鱼为研究对象分别构建小RNA文库。利用高通量测序获得原始测序数据总数（Total）和原始测序种数（Unique），3个时期的测序总数分别为13 359 823、10 010 888和13 241 828，测序种数分别为1 788 344、2 291 006和2 200 409（表 2）。经清理过滤得到的valid数据总数和种数分别为6 270 721，46.94%；6 850 048，68.43%；9 690 349，73.18%和440 107，24.61%；1 248 822，54.51%；1 284 112，58.36%（表 2）。Valid数据大部分分布在20-24 nt，符合Dicer酶切割的典型特征。和Rfam数据库比对发现的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA等非miRNA序列组成，见表 3。
共鉴定出1 084个miRNAs，其中已知的（known，reads既有miRbase支撑也有基因组位置支撑）miRNAs 432个，保守的（conservative，reads有miRbase支撑但pre-miRNA没有基因组位置支撑）miRNAs 624个，新的（novel，reads无miRbase支撑但有基因组位置支撑）miRNA 28个。D17时期鉴定出的miRNA个数最多为926个，在D3和D28时期分别有763和862个。在3个发育时期都表达的有628个miRNAs，只在D3、D17和D30中表达的分别有71、104和70个miRNAs。
分别比较D17与D3，D28与D3，D28与D17两两之间的差异表达miRNAs（P < 0.1、P < 0.05或P < 0.01）。P < 0.1时，两两之间差异miRNAs个数分别为417，430，265（包含上调和下调）；P < 0.05时，差异miRNAs个数分别为391、414和243；P < 0.01时，差异miRNAs个数分别为362、388和213。不同显著性p值的阈值下，D17和D3间差异miRNAs数均多于D28和D17间差异miRNAs数。D17和D3相比，上调miRNAs明显多于下调；D28和D17相比，下调miRNAs明显多于上调（图 2）。
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| 图 2 不同时期两两之间的差异表达miRNAs |
在众多差异表达的miRNAs中筛选统计学上差异最显著的（P value = 0）进一步分析发现，在D3到D28阶段持续下调的miRNAs有dre-miR-10d-5p，dre-miR-9-7-3p，dre-miR-10c-5p，dre-miR-222a-3p，dre-miR-26a-5p和dre-miR-199-5p。持续上调的miRNAs有dre-miR-200c-3p，aca-miR-194-5p，dre-miR-192，dre-let-7a，dre-let-7h，dre-let-7e，dre-miR-1388-5p，dre-miR-1，dre-miR-199-3-3p，dre-let-7g，dre-miR-122，dre-miR-203a和dre-miR-203b。
2.2 miR-199-5p / miR-203b组织表达谱及其在孵化后90 d内表达量的变化miR-199-5p / miR-203b在检测的组织中均有一定的表达，但表达丰度存在一定差异，miR-199-5p在白肌和肠道组织中的表达较高（图 3-A），miR-203b在白肌中的表达最高（图 3-B）。
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| 图 3 miR-199-5p / miR-203b组织表达谱 |
进一步验证miR-199-5p / miR-203b与肌肉发育是否相关，利用实时荧光定量检测miR-199-5p / miR-203b在D3（全鱼），D17（躯干）、D28（躯干），D60（白肌）、D90（白肌）的相对表达情况。miR-199-5p随发育时期延续而表达逐渐减弱（图 4-A）。miR-203b随发育时期延续而表达逐渐增强（图 4-B）。
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| 图 4 miR-199-5p / miR-203b在孵化后90 d内表达变化量 |
利用TargetScan预测miR-199-5p和miR-203b的靶基因分别为Wnt和Myod。
与转染psiCHECKTM-2空载体或psiCHECKTM2- Wnt-3'-UTR（mutant）相比，miR-199-5p mimic和psiCHECKTM2- Wnt -3'-UTR（wt）共转染时荧光素酶活性显著下降（P < 0.05）（图 5-A）与转染psiCHECKTM-2空载体或psiCHECKTM2- Myod-3'-UTR（mutant）相比，miR-203b mimic和psiCHECKTM2-MyoD-3'-UTR（wt）共转染时荧光素酶活性显著下降（P < 0.05）（图 5-B）。
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| 图 5 miR-199-5p和miR-203b的靶基因验证 A：1.转染psiCHECKTM-2空载体，2.共转染miR-199-5p mimic和psiCHECKTM2-Wnt-3'-UTR（wt），3.共转染miR-199-5p mimic和psiCHECKTM2- Wnt-3'-UTR（mutant）；B：1.转染psiCHECKTM-2空载体，2.共转染miR- 203b mimic和psiCHECKTM2-MyoD-3'-UTR（wt），3.共转染miR-203b mimic和psiCHECKTM2-MyoD-3'-UTR（mutant）。*表示差异显著（P<0.05） |
Wnt mRNA随发育时期延续而表达逐渐增强（图 6-A），MyoD mRNA在D17表达量较高，之后表达量逐渐减弱（图 6-B）。
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| 图 6 Wnt/ Myod在孵化后90 d内表达变化 |
本研究利用高通量测序技术获得孵化后D3、D17和D28时期鳜全鱼miRNA转录组，经清理过滤后得到的valid数据总数分别为6 270 721、6 850 048和9 690 349，样品间存在一定的差异，D28时期获得的数据最多，推测发育早期个体较小对文库的建立可能有一定影响。本研究中共鉴定出已知的miRNA known 432个，不同发育时期中鉴定出的miRNA个数存在明显的差异，有在3个发育时期都表达的也有只在某一时期表达的miRNAs，D17时期鉴定出的miRNA个数最多，且D17和D3间差异miRNAs数多于D28和D17间差异miRNAs数，这些充分说明生物体发育过程中miRNA对基因表达调控的时效性，也暗示了在D17时期miRNA更广泛的参与调控，相应得个体本身也可能经历着更多的发育变化。
对差异表达最显著（P value = 0）且在3个时期都表达的miRNAs进行归类，有在上述发育阶段持续下调的miRNAs（dre-miR-10d-5p，dre-miR-9-7-3p，dre-miR-10c-5p，dre-miR-222a-3p，dre-miR-26a-5p和dre-miR-199-5p），也有持续上调的miRNAs（dre-miR-200c-3p，aca-miR-194-5p，dre-miR-192，dre-let-7a，dre-let-7h，dre-let-7e，dre-let-7g，dre-miR-1388-5p，dre-miR-1，dre-miR-199-3-3p，dre-miR-122，dre-miR-203a-3p和dre-miR-203b-3p）。
已有的研究表明这些miRNAs与生物个体发育相关，如miR-10家族会和调控生物形体发育的Hox基因共表达，并对Hox的转录起到调控作用[13]；miR-26调节血管平滑肌细胞的分化，并通过抑制ctdsp2（Carboxy-terminal domain RNA polymerase Ⅱ polypeptide A small phosphatase 2）而参与神经形成[14-15]；miR-221可以通过靶定干细胞标志物CD117而阻止内皮细胞迁移和增生[16]，此外也和血管形成相关[17]；mir-200家族在上皮细胞-间充间质转化中起到重要作用，并可以维持细胞的上皮表型[18]；MiR-194只在脊椎动物中被发现，其在小鼠中的靶基因是RhoB（Ras homolog gene family，member B），该基因可以调控微丝骨架重组，进而影响内耳螺旋神经元形成[19]；miR-192是由p53诱导的miRNA，可以广泛的参与细胞周期调控[20]，在羊骨骼肌发育过程中，miR-192可以调控羊肌肉卫星细胞sheep satellite cells（SCs）增殖和成肌分化，其靶基因是眼癌（Retinoblastoma 1，RB1）[21]；miR-1388可以抑制GATA1（Erythroid transcription factor）和ALAS2（Erythroid-specific delta-aminolaevulinate synthase）的表达，进而影响红细胞分化[22]；miR-1属于肌肉特异性miRNA，参与调控心肌在内的多种肌肉组织的发育和生理[23]；let-7是被大家所熟知的可以控制干细胞分裂和分化时期的保守miRNA[24]；miR-122在人体肝脏中随个体发育会不断增加直至成年，占到肝脏总miRNA的70%以上，是在各种组织表达最多的miRNA之一[25]；MiR-199a-3p对成肌细胞分化起着非常重要的作用。抑制miR-199a-3p，肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）、肌球蛋白重链（MyHC）表达均显著升高，肌萎缩标记基因MuRF1表达降低，同时肌管形成增加，融合指数和肌管直径升高[26]。本研究中，上述miRNAs在鳜早期发育过程中表现活跃（差异表达显著），且存在持续上调或下调的规律性表达，表明上述miRNAs参与了鳜早期发育，且在功能上可能是保守的。
在持续下调的基因中选择dre-miR-199-5p做深入分析。miR-199是一类家族，只在脊椎动物中被发现且参与调控多种发育机制，在肌肉发育调控方面，miR-199a是重要的心肌细胞尺寸调控基因[27]。miR-199a-5p通过靶向SIRT1促进心肌纤维化相关基因表达[28]；miR-199a-5p参与调控平滑肌肥大以及器官重构。抑制miR-199a-5p的表达，可以上调包括WNT2在内的诸多靶基因，进而促进膀胱平滑肌细胞增殖，同时减小细胞体积[29]，Wnt信号通路参与调控肌肉的形成与分化[30]。本实验中，鳜孵化后到D90，Wnt mRNA表达随发育推移而持续增强。miR-199-5p在白肌和肠道组织中的表达较高，miR-199-5p随发育时期延续而表达逐渐减弱，miR-199-5p和Wnt mRNA的表达表现为负相关，双荧光报告实验验证了Wnt是miR-199-5p的靶基因。综上，说明miR-199-5p可能和鳜肌肉生长相关。
在持续上调的基因中选择dre-miR-203做深入分析。通常miR-203在皮肤发育和生理过程中发挥重要调控作用。有研究表明该miRNA也和骨骼肌相关，如在鸡骨骼肌中，miR-203可以抑制细胞增殖、成肌细胞的增殖和分化，上述过程中miR-203靶基因为c-JUN和MEF2C，c-JUN在细胞增殖中起重要作用，而MEF2C是肌肉发育的关键转录因子[31]。同时，miR-203可以通过调控和肌纤维肥大相关的靶基因EIF4进而影响鸡肌肉质量[32]。在罗非鱼骨骼肌中，稚鱼时期miR-203b表达低，成鱼时期高。静默miR-203b在罗非鱼体内的表达，可以导致MyoD上调，并激活下游基因。MyoD与成肌细胞增殖和肌肉增生相关[33]。本实验中，MyoD mRNA在D17表达量较高，之后表达量逐渐减弱，可能由于D17时期肌肉增生较快，而D28之后肌肉增生下降，转向肥大。miR-203b在鳜白肌中的表达最高，随发育时期延续miR-203b表达逐渐增强，D28之后，miR-203b和MyoD表达呈负相关，双荧光报告实验验证MyoD是miR-203b的靶基因，综上说明miR -203b可能和鳜肌肉生长相关，且在发育后期miR-203b对MyoD抑制作用更加明显。
本研究中发现的miRNAs涉及个体发育的各个方面，其中和肌肉发育相关的miRNAs较多。以往只以肌肉为材料研究鳜骨骼肌发育相关miRNA，本研究以鳜发育早期全鱼为材料建立转录组，筛选显著差异的miRNA，也能发现和鳜肌肉生长相关的候选miRNA，可能是因为在早期胚胎阶段肌肉本身所占的比例较大，取样时肌肉生长相关的候选miRNA会富集。
4 结论本研究利用高通量测序技术获得鳜孵化后3个发育时期（D3、D17和D28）全鱼miRNA转录组，共鉴定出432个已知的miRNAs，28个新的miRNA。鳜早期发育过程中miRNA的调控作用具有时效性，表现为上述不同发育时期中miRNA个数存在明显差异，其中D17时期miRNA个数最多。一些和发育相关的miRNAs在上述时期的表达呈现持续上调或下调的特点。实时荧光定量表明miR-199-5p和miR-203b在鳜白肌中均有较高的表达，miR-199-5p / miR-203和WnT / MyoD在一定发育时期分别表现负相关，双荧光素酶报告验证了WnT和MyoD分别是miR-199-5p和miR-203的靶基因。综上，miR-199-5p、miR-203可能与鳜骨骼肌肉发育相关。
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