丹参(Salvia miltiorrhiza)，别名紫丹参、血参、大红袍、红根等，来源于唇形科鼠尾草属植物，以根入药，其干燥根及根茎，是著名的活血化淤药，也是大宗药材之一^[1]。目前，丹参野生资源不断减少，栽培丹参逐渐成为市场供应的主要来源，而栽培丹参存在生长周期长、质量不可控、农药残留等问题，寻找一种替代资源尤为重要。利用发根农杆菌诱导丹参生成毛状根的方法早在20世纪90年代就已建立，并且获得了稳定的丹参毛状根株系，且在毛状根中及培养基中都相继发现了丹参酮类、丹酚酸类化学成分^[2-3]，且丹参毛状根具有生长迅速、无激素依赖性、生长周期短等优点，是优良的丹参替代材料。但目前丹参毛状根在规模化生产上还存在毛状根质量不稳定、有效次生代谢产物含量低等问题，制约其工业化应用。研究者发现促进毛状根生长及提高其有效成分的方法有很多，如基因克隆、改变培养基成分及其浓度、添加诱导子、前提物质、金属离子及选择生长调节剂等^[4]，其中诱导子的利用可能是解决这一问题的较好途径之一。有研究发现，茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MJ)作为生物诱导子的一种，在植物次生代谢过程中起诱导信号转导的作用，能有效刺激植物次生代谢产物的生物合成，能诱导包括萜类、黄酮类、生物碱类等化合物的积累^[5]。本实验以茉莉酸甲酯作为丹参毛状根的诱导子，研究茉莉酸甲酯对丹参毛状根中次生代谢产物含量的影响，确定茉莉酸甲酯的诱导作用，为丹参毛状根培养的生产应用提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

丹参(Salvia miltiorrhiza)材料分别采集于四川中江、山东等地，由电子科技大学生命科学与技术学院植物基因组工程实验室根据不同产地来源培育成不同品系的无菌苗。选用Ds5品系。携带Ri质粒的卸甲根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1(pRiA4)由上海师范大学开国银教授惠赠，保存于电子科技大学植物基因组工程实验室。

1.2 方法 1.2.1 丹参毛状根的诱导培养

丹参毛状根采用叶盘法，用根癌农杆菌C58C1感染丹参无菌苗获得，诱导培养15-20 d，切取长度1-2 cm生长良好的毛状根接入筛选培养基中，培养基配方为B5+500 mg/L Cef⁺筛选压(50 mg/L Kan)，置于25℃黑暗条件连续培养，每10 d继代1次，继代1-2次，培养20-30 d^[6]。

切取丹参根系材料上长度约5 cm、旺盛生长的侧根及主根，测定鲜重后转入液体发酵培养基(1/2 B5+500 mg/L Cef)中进行发酵培养，每瓶放入3-5根，26℃，120 r/min，黑暗培养18 d；在丹参毛状根液体培养基中加入浓度为200 μmol/L的MJ进行诱导处理，设置3次重复，未添加MJ为对照，观察毛状根诱导培养第5、10和15天的生长情况，分别取样测定诱导培养10 d和15 d的毛状根鲜重；培养15 d后，取样测定毛状根的干重，水溶性酚酸类化合物(迷迭香酸、丹酚酸B)和脂溶性丹参酮类化合物(丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A)的含量。

1.2.2 茉莉酸甲酯用量及溶液配制

茉莉酸甲酯(MJ)以无水乙醇为助溶剂，配制成50%的母液，过0.22 μm微孔滤膜除菌，加入培养基中，使MJ终浓度为200 μmol/L^[7]。

1.2.3 丹参毛状根样品制备

将诱导培养一定时间的丹参毛状根从培养基中取出，自来水冲去培养基，吸水纸吸干，40℃烘箱烘干至恒重，室温冷却，称取干重，干燥后的毛状根作为有效成分含量测定的材料，回流1 h得到样品，测定其HPLC含量。

1.2.4 丹参毛状根有效成分含量测定

将10 mg/mL的丹参毛状根甲醇提取液用于HPLC检测^[8]。检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，SP-120-5-C18-AP，4.6 mmID×250 mm；流动相A：0.2%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；检测波长：270 nm；流速：0.7 mL/min；柱温：35℃；梯度洗脱条件：0-5 min：10%乙腈；5-10 min：10%乙腈-20%乙腈；10-15 min：20%乙腈-25%乙腈；15-40 min：25%乙腈-60%乙腈；40-60 min：60%乙腈；60-70 min：60%乙腈-100%乙腈；70-80 min：100%乙腈。色谱图如图 1所示。

2 结果 2.1 茉莉酸甲酯诱导条件下丹参毛状根表型变化

分别观察茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根(MJ⁺)和未被茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根(MJ^-)在诱导培养5、10和15 d后的生长量及液体培养情况。结果(图 2和表 1)表明，随培养时间增加，丹参毛状根分支数量逐渐增加：从诱导培养第5天起，随培养时间增加，相较对照(MJ^-)，MJ⁺处理条件下丹参毛状根生长量逐渐增加，诱导培养15 d时丹参毛状根鲜重显著高于对照，且毛状根表皮色泽显著加深。以上结果表明，MJ⁺处理条件下，可以促进丹参毛状根生长，并可调控丹参毛状根次生代谢产物合成、积累，从而可能影响丹参毛状根次生代谢产物组分、含量改变，因此，进一步测定MJ+处理条件下丹参毛状根中主要次生代谢产物含量。

2.2 茉莉酸甲酯对毛状根中丹参酮类成分含量的影响

分别测定MJ^-、MJ⁺培养15 d丹参毛状根中2种脂溶性丹参酮类化合物(丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A)含量(图 3)。通过茉莉酸甲酯的处理，丹参毛状根中丹参酮Ⅰ的含量达0.0523 mg/g，是对照的1.53倍；丹参毛状根中丹参酮Ⅱ_A的含量达到0.106 2 mg/g，是对照的1.16倍。由结果可见，茉莉酸甲酯诱导毛状根，能有效地提高丹参毛状根中丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A的含量。

2.3 茉莉酸甲酯对毛状根中酚酸类成分含量的影响

分别测定MJ^-、MJ⁺培养15 d的丹参毛状根中2种水溶性酚酸类化合物(迷迭香酸、丹酚酸B)的含量(图 4)。通过茉莉酸甲酯处理，丹参毛状根中迷迭香酸的含量达51.724 mg/g，是对照的1.37倍；丹参毛状根中丹酚酸B的含量达到52.054 mg/g，是对照的4.43倍。结果表明，茉莉酸甲酯诱导毛状根，可显著提高其迷迭香酸和丹酚酸B的含量。

3 讨论

已有研究表明，诱导子对丹参毛状根次生代谢产物生产效率及积累量有影响^[9]。茉莉酸甲酯作为植物次生代谢过程中起诱导信号传导作用的物质，也是毛状根培养的生物诱导子之一，有研究者发现利用茉莉酸甲酯作为诱导子，可有效提高曼陀罗、颠茄等物种毛状根中次生代谢产物的积累和释放^{[5, 10]}；王学勇等^[7]通过实验也证明了茉莉酸甲酯能有效提高丹参酮类成分在丹参毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放，但尚未有试验证明茉莉酸甲酯对丹参毛状根中酚酸类化合物的积累是否有正效应。

本实验通过对比茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根(MJ⁺)和未被茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根(MJ^-)中酚酸类化合物及丹参酮类化合物的含量，结果发现茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根的丹参酮类化合物丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A分别是MJ^-的1.53倍和1.16倍，酚酸类化合物迷迭香酸和丹酚酸B分别是MJ^-的1.37倍和4.43倍，其中丹酚酸B的效果尤为显著，达到了4.43倍，由此进一步证实了茉莉酸甲酯能有效提高丹参毛状根中丹参酮类成分的积累，并首次证明酚酸类成分的合成和积累也有显著提高，说明通过茉莉酸甲酯诱导可以实现丹参有效次生代谢产物的高效生产，为丹参毛状根的工业化应用提供了试验依据。由丹参毛状根生长情况可看出，随培养时间增加，次生代谢产物的含量逐渐增加，在确定茉莉酸甲酯对丹参毛状根中有效成分含量积累的正效应后，其诱导培养的最佳时间则需要进一步探索。

4 结论

茉莉酸甲酯能有效提高丹参毛状根中丹参酮类成分的积累，可显著提高酚酸类成分的合成和积累，通过茉莉酸甲酯诱导实现丹参有效次生代谢产物的高效生产。