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单婷婷, 陈晓梅, 郭顺星, 王倩清, 王爱荣
石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究
生物技术通报, 2018, 34(6): 54-58

SHAN Ting-ting, CHEN Xiao-mei, GUO Shun-xing, WANG Qian-qing, WANG Ai-rong
Studies on Total RNA Extraction Methods from the Stems of Dendrobium Species
Biotechnology Bulletin, 2018, 34(6): 54-58

文章历史

收稿日期:2017-10-01

石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究
单婷婷1, 陈晓梅1, 郭顺星1, 王倩清2, 王爱荣1     
1. 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100193;
2. 鲁东大学农学院,烟台 264025
摘要:获得快速提取高质量石斛属植物茎总RNA的方法,为深入开展分子生物学研究奠定基础。采用7种方法提取铁皮石斛茎总RNA,凝胶电泳和紫外分光光度法检测质量,筛选最佳方法,并对方法进行验证。结果显示,经过比较,用改良华越洋多糖多酚试剂盒法(M7)提取的铁皮石斛茎总RNA的完整性、浓度和纯度均最好。用M7提取铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、球花石斛和重唇石斛的茎总RNA,以及提取不同生长条件(温室和大棚种植)和不同生长时间(大棚生长3个月、1年和2年)铁皮石斛的茎总RNA,所获样品的完整性、浓度和纯度均符合质量要求。M7操作简便,结果重复性好,适于石斛属植物茎总RNA的提取。
关键词石斛属植物    总RNA提取    改良华越洋多糖多酚试剂盒法    
Studies on Total RNA Extraction Methods from the Stems of Dendrobium Species
SHAN Ting-ting1, CHEN Xiao-mei1, GUO Shun-xing1, WANG Qian-qing2, WANG Ai-rong1     
1. Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193;
2. Agriculture College, Ludong Univercity, Yantai 264025
Abstract: This work is aimed to establish a fast and efficient method of extracting total RNA from the stem of Dendrobium species for further molecular biology investigation. Seven methods were used to extract the total RNA from the stem of Dendrobium officinale, then gel electrophoresis and UV spectrometer were applied to determine the quality of the extracted total RNA, and the screened method was verified by samples of D. officinale of different growth conditions and times, and of 5 species of Dendrobium. Results showed that the integrity, purity and extraction capacity of the stem total RNA of D. officinale by Improved HUAYUEYANG Quick RNA Isolation Kit((M7)was the best. The stem total RNA, extracted using M7, of D. officinale, of D. nobile, of D. chrysotoxum, of D. thyrsiflorum and of D. hercoglossum, and of D. officinale planting in plastic house and greenhouse for 1 year respectively, as well as in plastic house for 3, 12 and 24 months respectively, were verified to meet the quality requirements on the integrity, purity and extraction capacity. In conclusion, M7 is suitable for stem total RNA extraction of Dendrobium species for easy handle and fine repeatability.
Key words: Dendrobium species     total RNA extraction     improved HUAYUEYANG Quick RNA Isolation Kit    

全世界约有兰科石斛属(Dendrobium)植物1 500多种[1],我国有74种2变种,其中51种可作药用[2]。我国2015版药典规定,中药铁皮石斛的来源植物为铁皮石斛(D. officinale Kimura et Migor),中药石斛的来源植物包括金钗石斛(D. nobile Lindl)等多种同属近似种[3],药材的药用部位均为植物的新鲜或干燥茎[4]。石斛属植物茎多糖含量普遍较高,其中铁皮石斛茎多糖被认为是药材的主要有效成分。

高质量RNA是开展cDNA文库构建、荧光定量PCR检测、Northern杂交等分子生物学研究的必要前提[5]。对于富含多糖的植物组织,传统的RNA提取方法是经过SDS-盐酸胍处理去除多糖,或是在高浓度Na+或K+存在条件下,利用苯酚、氯仿抽提去除多糖,最后都通过LiCl沉淀RNA[6]。传统方法存在多糖去除不完全[7],LiCl沉淀导致RNA丢失,提取效率低,耗时长等缺点[8]。目前多用试剂盒方法提取RNA。试剂盒法主要是利用异硫氰酸胍去除多糖。异硫氰酸胍是强烈的蛋白质变性剂,不仅能有效解离核蛋白和核酸的复合体,还能抑制RNA酶的活性[9],且不易发生RNA丢失。与传统方法相比,试剂盒法还具有操作简单,重复性好等优点[10]

植物的不同组织和器官,由于化学成分组成的差异,导致提取RNA的方法有很大差别[11]。根据文献报道,铁皮石斛茎中次生代谢关键酶基因表达量最高[12-14],但是铁皮石斛RNA提取方法研究中使用的材料多为叶片,鲜有关于茎RNA提取方法的报道[15-18]。目前铁皮石斛依赖人工栽培生产药材,采收生长2-3年的茎入药,这个阶段多糖含量最高,通常可达20%-30%[19];叶和根的多糖含量分别为10%-14%和8%-10%[20]。鉴于此,本研究以多糖含量高的2年生铁皮石斛茎为实验材料,研究建立总RNA提取的试剂盒方法,以期为石斛属植物茎的分子生物学研究奠定基础,并为其他富含多糖的植物器官的RNA提取提供借鉴。

1 材料与方法 1.1 材料

用于方法学研究的铁皮石斛样品,采自江苏省泰州市江苏益草堂石斛股份有限公司(以下称为益草堂公司),为该公司生产的组培苗移栽种植大棚后生长两年的茎杆。干燥茎多糖含量29.5%。每种RNA提取方法采集3份样品,作为生物学重复。

铁皮石斛样品均来自益草堂公司生产的组培苗,生长条件和生长时间分别是:中国科学医学院药用植物研究所温室种植1年(W),益草堂公司种植大棚生长3个月(S)、1年(Y)和2年(L)。金钗石斛(J)、鼓槌石斛(D. chrysotoxum Lindl,G)、球花石斛(D. thyrsiflorum Rchb. f.,Q)和重唇石斛(D. hercoglossum Rchb. f.,C)均在药用植物研究所温室生长两年以上。W与Y用于比较不同生长条件的铁皮石斛,S、Y和L用于比较不同生长时间的铁皮石斛,L、J、G、Q和C用于比较不同种石斛属植物。以上每个样品采集3份,作为生物学重复。

以上植物均经过中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员鉴定。将新鲜石斛茎切段,迅速放入液氮中速冻,后置于-80℃保存,备用。

1.2 方法 1.2.1 RNA提取方法

研究共采用了7种RNA提取方法:TRIZOL法+去多糖辅助剂(M1)[17]、QIAGEN试剂盒法(M2)[21]、百泰克通用试剂盒法(M3)[17]、百泰克多糖多酚试剂盒法(M4)[22]、艾德莱多糖多酚试剂盒法(M5)[23]和华越洋多糖多酚试剂盒法(M6)[24]和改良华越洋多糖多酚试剂盒法(M7)。前6种方法均按照试剂盒附带的操作步骤提取RNA。M7在试剂盒操作步骤的基础上进行了2方面的改良:加大样品量;延长孵育时间。

改良华越洋多糖多酚试剂盒法(M7)提取RNA过程如下:(1)称取300 mg铁皮石斛茎段,液氮充分研磨后加入3 000 μL细胞裂解液混匀,50℃孵育10 min;(2)所得混合物的液体部分转移至离心管,加入900 μL去蛋白液和600 μL氯仿,震荡混匀,静置2 min,离心10 min;(3)上清液加入等体积漂洗液,颠倒混匀,混合物通过离心吸附柱,离心1 min,弃废液;(4)用洗柱液清洗吸附柱2次,每次清洗后离心1 min,弃废液;(5)取45 μL DNase buffer和5 μL RNAse free DNase I混合均匀,37℃预热1 min,加入吸附柱,静置5 min;(6)用去酶液清洗吸附柱2次,每次清洗后离心1 min,弃废液;(7)吸附柱加30-80 μL RNA洗脱液,静置3-5 min,离心1 min,收集RNA溶液。以上操作均在室温下进行,离心速度均为12 000 r/min。

1.2.2 RNA质量检测

RNA浓度及纯度用NanoDropTM2000分光光度计(Thermo Fisher,USA)检测[25],1.0 μL总RNA上样,平行检测5次,记录总RNA浓度、OD260/OD280,计算平均值。RNA纯度要求:1.8≤OD260/OD280≤2.2。RNA完整性用凝胶电泳检测[26],0.5×TBE Buffer电泳缓冲液,3 μL RNA混入0.6 μL 6×Loading Buffer(TaKaRa)点样,1.0%琼脂糖(Biowest® Regular Agarose G-10)凝胶,200 V电泳15 min。

1.2.3 M7的方法验证

用M7方法对各样品茎RNA进行提取,并检测RNA质量。

1.2.4 统计方法

对M2-M7的RNA浓度和纯度测定值用SPSS软件进行单因素方差分析,比较不同方法提取的茎总RNA的质量差异。由于方差不齐,用Dunnett's T3进行多重比较。

2 结果 2.1 七种方法提取RNA过程中的现象

七种提取RNA的方法,除了M1需要用异丙醇沉淀并自然干燥RNA,其他6种都是用吸附柱收集RNA的试剂盒法。选取上柱前实验过程中现象变化最明显的3个阶段进行观察,它们分别是:加入裂解液后、水浴离心后和加入氯仿后。

M2、M3和M4在加入裂解液后溶液比较黏稠(图 1-A)。水浴离心后7种方法都会出现沉淀(图 1-B),其中M2出现了白色絮状沉淀;M3和M4水浴离心后上清液仍较黏稠,不易吸取;氯仿的作用是将RNA与DNA和蛋白质分离,进入水相。加入氯仿后溶液分为3层:上层为含有RNA的水相;中层为DNA、蛋白质和其他杂质;下层为有机相(图 1-C)。这个阶段M4上层为黏稠的白色液体,M3实验过程中没有加入氯仿,分层出现在加入70%乙醇后,上清为黏稠的透明液体。由于水浴离心后已经将M2和M5上清液转移到过滤清除柱中,因此在这个阶段M2和M5无明显分层现象。

图 1 七种方法提取RNA过程中的现象 A:加入裂解液后;B:水浴离心后;C:加入氯仿后. M1:TRIZOL法+去多糖辅助剂;M2:QIAGEN试剂盒法;M3:百泰克通用试剂盒法;M4:百泰克多糖多酚试剂盒法;M5:艾德莱多糖多酚试剂盒法;M6:华越洋多糖多酚试剂盒法;M7:改良华越洋多糖多酚试剂盒法,下同
2.2 七种方法提取的总RNA的质量检测 2.2.1 RNA完整性

图 2为1.0%琼脂糖凝胶电泳图,M1、M2和M3方法没有rRNA条带,M4和M5方法rRNA条带不清晰,M6和M7方法有较整齐、清晰的28S和18S rRNA条带。

图 2 七种方法提取铁皮石斛茎总RNA的电泳图
2.2.2 RNA浓度和纯度

测定结果见表 1。M1总RNA浓度异常高,紫外检测有两个吸收峰,表明样品中掺杂有DNA,测定值不可靠,因此不参与统计。M2-M7数据的单因素方差分析结果表明,不同提取方法的总RNA浓度有显著性差异(P < 0.05),纯度没有显著性差异(P>0.05)。经Dunnett's T3多重比较,M7与M2和M3的总RNA浓度有显著性差异(P < 0.05)。M7总RNA浓度最高,为139.13±22.02 ng/μL,浓度变异系数(C.V)最低,为15.83%,总RNA纯度最高,OD260/OD280为2.12±0.01,表明该方法稳定,重复性好,提取获得的总RNA质量符合分子生物技术要求。M7总RNA浓度较M6提高了98.6%,纯度提高了79.7%,改良效果明显。

表 1 七种方法提取铁皮石斛茎总RNA的浓度和纯度(n=3)
2.3 M7方法验证 2.3.1 RNA完整性

经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,M7提取的不同生长条件(W和Y)和不同生长时间(S、Y和L)铁皮石斛,以及不同种石斛属植物(L、J、G、Q和C),均有整齐、清晰的28S和18S rRNA条带(图 3)。

图 3 M7方法验证的茎总RNA电泳图 M:Maker 2000;W-L均为铁皮石斛,W:温室种植1年,Y:大棚生长1年,S:大棚生长3个月,L:大棚生长2年;J:金钗石斛,G:鼓槌石斛,Q:球花石斛,C:重唇石斛
2.3.2 RNA浓度和纯度

M7提取的W、S、Y和L的铁皮石斛茎总RNA浓度在50 ng/μL-140 ng/μL之间,OD260/OD280在1.8-2.2之间。M7提取的J、G、Q和C茎总RNA浓度在60 ng/μL-110 ng/μL之间,OD260/OD280在2.0-2.1之间(表 2)。以上结果均能满足下游的分子生物学实验要求。

表 2 M7方法验证的茎总RNA(n=3)
3 讨论

RNA提取的原理是首先将细胞破碎裂解,利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和DNA的污染,再通过一系列的抽提、洗涤和沉淀,最终获得纯净的RNA[27]。富含多糖的植物组织,由于细胞破碎后多糖常与RNA形成难溶性物质,导致RNA分离困难,并造成初提时上清液黏稠,不能很好的与有机相分离,在去除多糖的同时造成RNA大量丢失,降低RNA得率[28]。因此,更高效的细胞裂解是从这类组织中获得高质量及高产量RNA的前提。

裂解细胞的方法分为物理方法(液氮研磨破碎法)、生物方法(酶方法:蛋白酶K、溶菌酶)和化学方法(CTAB、SDS、NaI、KI、蛋白质变性剂)。本研究所采取的7种方法,M1、M2、M4和M5主要是利用异硫氰酸胍变性剂来破碎细胞壁和去除RNA酶[29],M3和M6所使用的裂解液试剂公司保密。M1、M2和M3为通用试剂盒。李清等[21]报道用M2提取金钗石斛茎RNA可获得满意的结果。用M3提取铁皮石斛[17]、福建山樱花[30]、草珊瑚[31]等植物材料的RNA均出现DNA污染、RNA完整性差的现象。本研究结果与这些文献的报道一致。M4、M5和M6为多糖多酚试剂盒。据报道,M6多用于提取富含多糖多酚类植物的RNA。如甘薯[24]、番茄[32]、芒果等[33],提取结果能满足进一步实验的要求。M7在M6的基础上采取延长孵育时间和加大样品量的措施。延长孵育时间可以增加裂解液与细胞的接触,使其充分裂解,彻底释放RNA[23]。由于石斛属植物富含多糖,在加入裂解液之后会产生大量沉淀,上清液体积小,不易吸取。加大样品量可以获得足够的上清液,减少蛋白质等的污染。采取以上改良措施后,M7达到了去除杂质污染和提高RNA浓度的目的,获得了比M6更好的实验结果。

4 结论

改良华越洋多糖多酚试剂盒法(M7)既能有效去除多糖,也能满足后续分子生物研究对RNA质量的要求,可用于提取石斛属植物茎RNA,也可为富含酚类和多糖等物质的其他植物材料的RNA提取提供参考。

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