随着社会生活水平的提高，人们对于水产品的需求量的日益增多，随之带来的是水产行业的迅猛发展。但是，在养殖过程中出现的一些问题诸如病害频发、药物残留以及由此带来的水域污染问题都严重制约着水产行业的发展，在临床上需要一种经济适用、可持续发展的疾病防控方法，免疫防控技术应运而生。

1942年，Duff首次将杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）的灭活口服疫苗应用于硬头鳟并获得成功后，开创了水产疫病防控的新纪元。20世纪70年代，荷兰英特威公司使用福尔马林来灭活细菌，制造出细菌性灭活疫苗，通过注射和浸泡的方式来防治鲑鱼弧菌病和肠红嘴病。实验结果表明，这种疫苗能够有效抑制弧菌病的发生和传播，给北美的鲑鱼养殖业带来了巨大的成功^[1]。1988年，挪威法玛克公司在欧洲成功研制出一种细菌灭活疫苗用于防治冷水鱼弧菌病，此举为挪威的三文鱼养殖业挽回了巨大的经济损失；1991年，该公司又开发出世界上第一例防治疥疮病的细菌灭活鱼疫苗并推向市场，这一疫苗因其良好的疾病防治效果，最后成功获得了欧洲的商业许可^[1]。据不完全统计，到2012年年底，全球商业化生产的水产疫苗数量已经有140多种^[2]。但口服疫苗由于免疫保护率偏低，成本较高，占据的比例很小，到2013年底，国外主要的商品化渔用疫苗产品中仅有传染性胰脏坏死病毒亚单位疫苗和传染性三文鱼贫血病毒亚单位疫苗通过口服进行接种。而中国仅获得新兽药证书的5种水产疫苗中，没有一种是口服疫苗。本文综述了水产口服疫苗的研究进展，旨为研究安全高效并且成本低廉的新型口服疫苗提供一定的参考信息。

1 水产疫苗的概况

我国的水产疫苗研究工作开展得比较晚，始于上世纪50年代草鱼出血病土法疫苗研究，但是进步缓慢^[3]。据不完全统计，目前我国研究的水产疫苗种类达50余种，涉及病原近30种，但获得国家新兽药证书的水产疫苗只有5种，获得生产批文的水产疫苗仅有草鱼出血病活疫苗与嗜水气单胞菌灭活疫苗2种，与欧美发达国家还存在较大差距^[4-5]。

2 水产疫苗的接种方式

水产疫苗的常用接种方式主要有浸泡、注射和口服。水产疫苗的注射接种主要分为肌肉注射和腹腔注射两种方式。肌肉注射主要用于DNA疫苗等核酸疫苗的接种，而腹腔注射主要用于传统灭活疫苗和减毒疫苗的接种^[6]。

当前，国内主要有两类疫苗获得批准：一类是减毒疫苗，其典型代表是草鱼出血病弱毒疫苗；另一类是传统灭活疫苗，其代表主要有鱼嗜水气单胞菌灭活疫苗等。这些疫苗主要通过对鱼体进行腹腔注射从而使鱼体产生免疫能力^[5]。注射免疫可保证免疫个体数量和疫苗剂量的准确性，并能同时免疫多种抗原，减少注射的次数^[7]。但是采用注射这种疫苗接种方式在实际生产和临床试验上也存在一定的缺陷：首先，这种免疫方式对体型小的鱼并不适用；其次，其接种方式费时费力，对于大规模养殖场工作量巨大；同时，由于操作人员的水平差异也会对鱼体造成不同程度的伤害。此外，有时伴随疫苗注射使用的麻醉剂会影响鱼群的生命活动^[8]。

浸泡免疫又分为4种方式，包括直接浸泡、高渗浸泡、喷雾和浸浴^[6]。浸泡免疫这一方式适用于体型较小的鱼类，省时省力，但是这种疫苗接种方式的缺点是抗原的需要量大，并且容易使鱼群产生强烈的应激反应。近年来，有研究者将超声波和浸泡免疫结合起来，可通过增强细胞渗透性来加强免疫的效果。

口服疫苗被认为是水产疫苗最具可操作性的免疫方式，主要考虑到水生动物生活环境离不开水体，并且养殖数量较大。这种疫苗接种方式几乎适用于所有规格的鱼类，采取拌入饲料口服的方式，省时省力，但口服疫苗因为免疫鱼体数量和疫苗剂量不能得到有效保证，抗原易受消化道的影响，从而使其提供的免疫保护力在目前低于注射免疫。

3 口服疫苗的作用机制

鱼类的肠道黏膜分为两个部分：上皮层和固有层^[9]。在所有生物体内，黏膜表面是病原体进入的主要部位^[10]，而黏膜表面覆盖有免疫增强黏液的保护层，此保护层作为防御病原体的第一道防线，鱼的黏液中含有多种与免疫相关的因素如凝集素、黏蛋白、抗菌肽、毒素、免疫球蛋白等^[11]。通常认为鱼类口服疫苗免疫主要以黏膜免疫为主，它在鱼类疾病的防御过程中起着主导作用，但是目前对于黏液免疫作用机制的研究并不是特别清晰。

鱼类没有器官化的淋巴结或者淋巴集结，而只有弥散性的肠道淋巴组织，这是一种在功能上与哺乳类不同的组织^[12]，但是鱼类却有大量的淋巴细胞，由淋巴产生的免疫球蛋白能够抵御病原体和防止共生细菌进入上皮细胞^[13]。

在单克隆抗体技术的支持下，Companjen等^[14]在舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）的肠道内发现了淋巴组织，并且还发现舌齿鲈的淋巴细胞的数量从消化道到肛门呈现明显的数量梯度上升趋势。这种现象表明，后肠比其他任何肠道部位能产生更强的免疫应答反应，推测口服疫苗主要在后肠发挥作用。由于抗原呈递效率的不稳定性，以及疫苗容易受到鱼类胃肠黏膜系统中的各种消化酶的影响，口服疫苗产生的免疫效果并不如理想条件下的好。一般认为，口服疫苗的效果不如肛门灌注，这是由于口服疫苗在消化道中受到消化酶的降解或破坏，使到达后肠的抗原达不到发挥预期免疫效果的数量要求^[15]。

为了避免这种现象，研究者们运用各种手段和技术使口服疫苗免受胃酸和肠道中各类消化酶的影响，从而保障其免疫效果，同时减缓疫苗中抗原物质的释放，使之持续释放抗原物质，以产生更大程度的免疫应答反应。

4 口服疫苗的种类

由于口服疫苗需要激发局部或者全身的免疫应答，这些疫苗在到达发生免疫反应的组织之前，抗原需要被保护，以防受到破坏，影响免疫效果^[16]。实验表明，高浓度的胃酸可能在口服疫苗到达肠道淋巴组织之前就使之变性或失去活性^[17]，肠道内蛋白酶的存在，一部分抗原会受到蛋白酶的降解^[18]。由于口服疫苗可能会在鱼类消化系统内被降解，或当拌入饲料中时，也可能与饲料中的成分互相作用，影响饲料的适口性甚至影响疫苗本身应有的免疫效果。因此，口服疫苗需要得到妥善的保护，尽量避免疫苗的裸露，使之能更好地发挥免疫效果^[19]。

4.1 佐剂疫苗

免疫佐剂是指一种能够增强机体的特异性免疫反应的物质，但其本身并不会引起任何特定的反应，它是一类免疫类增强剂^[20]。到目前为止，用作疫苗佐剂的常见材料有聚合微球体、生物被膜、抗原成分和细胞因子，有的菌体有时也可以作为疫苗的佐剂^[21]。

4.1.1 聚合微球体

常见的聚合微球体的包裹材料主要有海藻酸盐、壳聚糖还有脂质体等，这类疫苗有时也被称为微囊疫苗。抗原成分可以是全病原、重组表达的蛋白或者核酸。

Romalde等^[22]用福尔马林灭活格氏乳球菌（Lactococcus garvieae），由海藻酸钠丙酮微粒包裹疫苗用以口服免疫虹鳟鱼。在口服疫苗1-24 h后，在胃和小肠中检测到该种藻酸盐微球完好无损。同时，在用肛门插管法接种该种疫苗16-24 h后，也能在后肠检测到海藻酸盐微粒。这一结果表明海藻酸钠丙酮微粒能够有效抵抗消化道中的低pH环境和各种蛋白酶的降解。腹腔注射疫苗口服海藻酸钠丙酮微粒疫苗和无包裹的的疫苗，攻毒结果显示，三者的相对存活率分别为83.3%、50%和7%，说明虽然口服疫苗的免疫效果不如注射疫苗，但实验中海藻酸盐可有效保护疫苗，有效提高免疫效果。余俊红等^[23]分别将全细胞浓缩疫苗和微胶囊疫苗拌料投喂鲈鱼鱼苗，免疫一周后，进行注射攻毒，结果表明两组的免疫保护力分别为51%和56.2%，而对照组的死亡率高达95%，这表明微胶囊疫苗可以提高抗原的保护性。孙翰昌等^[24]用生物可降解材料聚丙烯酸树脂来制备肠型点状产气单胞菌（Aeromonas punctata f.intestinalis）的微粒疫苗，并用其口服免疫草鱼。攻毒实验结果表明，佐剂疫苗、全菌疫苗和微粒疫苗的免疫保护率分别为71.4%、66.7%和52.4%。

除了全病原抗原外，包裹重组表达的蛋白，也是常见的口服疫苗抗原类型。Caruffo等^[25]利用酿酒酵母同时表达血凝素酯酶（Hemagglutinin-esterase，HE）病毒的表面蛋白与鲑鱼贫血病毒（ISAV）毒株F蛋白的保守区域，包裹在一个阳离子多糖基质胶囊里。将该疫苗混入三文鱼配合饵料中，疫苗组的存活率高达66.7%。任燕等^[26]用壳聚糖-海藻酸钠包裹哈维氏弧菌（Vibrio harveyi，Vh）重组外膜蛋白OmpK，制备复合微囊疫苗，口服免疫斜带石斑鱼，口服微囊疫苗组的RPS（相对存活率）达到62.5%，高于OmpK蛋白组（P < 0.01）。Dubey等^[27]将迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）的外膜蛋白A包裹在壳聚糖纳米微粒（NP）中，形成纳米微粒重组外壳蛋白（np-rOMP），免疫缨野鲮（Labeo fimbriatus），以灭活全细胞大肠杆菌（iwc-nt）疫苗、空纳米微粒疫苗作为对照组。攻毒实验结果显示np-rOMP疫苗组、iwc-nt疫苗组、空疫苗组的存活率分别为73.3%、48.28%和为23.33%。表明np-rOMP疫苗较iwc-nt疫苗能在鱼体内产生更高的免疫水平，从另一方面也说明了壳聚糖微粒在疫苗呈递过程中起的保护作用。

已经证实，DNA疫苗可以提高鱼体对疾病的防御能力，但是口服裸露的DNA疫苗的免疫效果并不理想。de las Heras等^[28]将一种表达衣壳蛋白VP2基因的DNA疫苗包裹在海藻酸钠微球内避免其受到消化系统的影响，并用该疫苗免疫虹鳟鱼。结果显示，在接种该疫苗的早期，衣壳蛋白VP2基因在虹鳟鱼的不同器官内均有表达。该疫苗能诱导先天免疫反应，相较于在接种7-15 d后再接种空质粒疫苗，该疫苗能提高鱼体内IFN的表达量，并且高达十几倍。还有研究者也将重组DNA技术与微囊疫苗结合起来对鱼类进行口服免疫^[29]。

4.1.2 生物被膜

生物被膜（Biofilm，BF）有时也被用作口服疫苗的佐剂。生物被膜是一些附着在生物或非生物表面的微生物细胞的聚集膜样物，这些微生物附着的表面经常被细胞外聚集物质（Extracellular polymeric substances，EPSs）包裹，EPSs作为生物被膜中的微生物的保护屏障，可增强它们对环境压力的耐受性，如干燥、渗透压、紫外线辐射、消毒和抗生素治疗等^[30]。将生物被膜运用在口服疫苗上，可以保护疫苗中的抗原成分在到达肠道淋巴组织的过程中免受消化液的影响，使其发挥应有的免疫功能。

如丁诗华等^[31]采用复乳挥发法制备含嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）被膜或灭活菌体的聚乳酸-乙醇酸共聚物（Poly-（1actide-co-glycolide），PLG）疫苗微粒，口服免疫草鱼。实验结果显示，被膜疫苗微粒疫苗组、全菌疫苗微粒疫苗组及空微粒组在攻毒后的相对存活率分别为46.7%、36.7%和6.7%，被膜疫苗和全菌疫苗能使草鱼对嗜产生水气单胞菌一定的抵抗力。

4.1.3 抗原成分

Josepriya等^[32]发现固定化抗原（iAg）可作为抗隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染的保护性抗原，并把热休克蛋白70C（Hsp70C）作为固定化抗原疫苗的佐剂，可提高鱼体对于隐核虫感染的抗原免疫保护力。将iAg与Hsp70C的cDNA共同和相对独立封装在壳聚糖纳米粒子中，作为抗隐核虫感染的口服疫苗免疫石斑鱼，攻毒试验表明，口服免疫32 d后含iAg和Hsp70C的疫苗组和含iAg的疫苗组RPS为100%；42 d后，含iAg和Hsp70C的疫苗组、含iAg的疫苗组RPS分别为51%，15%。Hsp70C作为固定化疫苗的佐剂能够增强石斑鱼对于隐核虫感染的抗原免疫保护力。这类复合型疫苗成功地提高了石斑鱼的存活率，这一结果对于制备防治隐核虫感染的疫苗提供了一种新思路。

4.1.4 菌体成分

Chen等^[33]发现鳗弧菌（V. anguillarum）可作为抗神经坏死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）亚单位口服疫苗的生物佐剂，同时卤虫幼体可作为该疫苗的载体。该实验以NNV的外壳蛋白作为抗原，鳗弧菌的热休克蛋白60基因作为启动子，运用基因重组技术，获得重组外壳蛋白，将重组的鳗弧菌灭活并由卤虫幼体携带，阳性对照为大肠杆菌口服疫苗组，口服免疫石斑鱼。攻毒后，鳗弧菌疫苗组的RPS为51.3%，大肠杆菌口服疫苗组的RPS为23.1%，鳗弧菌作为该疫苗的生物佐剂起到了积极地辅助作用。

在制备佐剂疫苗时，并不仅限于一种佐剂材料的使用，可能同时使用两种或两种以上的佐剂材料，以保证更好的免疫效果。Rivas-Aravena等^[34]用病毒的DNA复制酶（Ad）作为佐剂与灭活的ISAV（V）包裹在壳聚糖纳米微粒（NP）中，连续7 d口服免疫三文鱼。30 d后腹腔注射ISAV毒液进行攻毒，结果显示，NP-V疫苗组可提供40.4%的免疫保护率，NP-V+NP-Ad疫苗组能提供77.9%的免疫保护率。这些数据表明实验中的DNA复制酶作为佐剂能提高三文鱼的存活率，而DNA复制酶与NP结合更能显著增强三文鱼抵抗ISAV的免疫能力。

在这些佐剂材料中，微球可以使疫苗免受消化道各种酶类的影响，还可起到延缓释放抗原的作用；而生物被膜也可以降低呈递过程中消化液对疫苗中抗原成分的影响。总体来讲，佐剂可以保护抗原成分使之更好地发挥免疫效应^[35]。但同时也存在一些问题：首先，佐剂疫苗使用的生产材料大多价格昂贵、使用的剂量大而且需要对养殖生物进行多次免疫，这一系列的因素使得佐剂疫苗的生产成本大大增加；其次，就目前对于水产口服佐剂疫苗的研究并未考虑水产生物的肠道黏膜免疫系统的特殊性，某些佐剂因子可能会引起黏膜免疫的非特异性反应，降低了疫苗的使用效率^[36]。因此，在实际生产实践中，另外一种疫苗——生物载体疫苗也广泛应用。

4.2 生物载体疫苗

生物载体疫苗也叫作活载体疫苗，是在基因工程技术的支持下，外源抗原成分借助非致病性的微生物得以表达的一种疫苗^[37-38]。

口服疫苗通常是拌入饵料中或者用人工合成的材料进行包裹，这样就可能造成饵料的适口性不佳，导致疫苗的摄入量较低，不能达到预期的免疫效果^[39]。为了解决这一问题，许多研究者尝试采用天然的生物饵料作为疫苗的载体来增强疫苗的摄入。已经报道的生物载体包括卤虫、蚕蛹、益生菌及植物等。

余俊红等^[23]在用微胶囊疫苗口服免疫鲈鱼时，对疫苗进行了两种形式的处理，即直接拌入饲料和卤虫携带。结果表明，相较于其他疫苗，卤虫携带生物微胶囊疫苗能够在鲈鱼鱼体内发挥最好的免疫效果，其对应的疫苗组在一周内的相对存活率高达75%；直接口服的微胶囊疫苗次之，其疫苗组一周的相对存活率约为63%。这一现象表明口服生物-载体疫苗的免疫保护率优于直接口服微囊疫苗。

魏克强等^[40]通过基因重组技术研制白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）重组囊膜蛋白亚单位疫苗，其成分为受到重组杆状病毒HyNPV-Vp28和HyNPV-Vp19感染的家蚕蛹的匀浆，口服免疫克氏原螯虾（Procambarus clarkii）长达75 d，在免疫35 d后分别进行口服和注射攻毒实验，观察虾体在接种疫苗后对WSSV的抵抗能力。结果表明，口服攻毒实验后，rVp28、rVp28+ rVp19疫苗组的RPS分别达到63.16%、68.42%，与对照组相比具有较好的免疫效应，说明这种类型的重组蛋白亚单位疫苗可有效提高克式原螯虾的免疫能力。

任鹏丽等^[41]用枯草杆菌作为表达草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）衣壳蛋白VP4的载体，并以此制备口服疫苗。用含有重组芽孢CotC-VP4的疫苗口服免疫草鱼，以口服CotC空载质粒组作为阴性对照，以注射草鱼出血病商品疫苗组为阳性对照。攻毒试验结果显示，在两周以内，阴性对照组的死亡率均高达90%以上，阳性对照组仅为10%，而口服重组芽孢疫苗组分别为45%和60%。从实验结果来看，生物载体口服疫苗的免疫效果虽然不如注射疫苗的效果好，但是也能够使草鱼鱼体对GCRV产生一定的疾病免疫能力。

张毅等^[42]利用PCR重叠延伸技术将蛋白转导域TAT序列与WSSV的vp28基因融合，以原核宿主大肠杆菌作为表达载体，表达TAT-VP28融合蛋白。口服免疫克氏原螯虾（Procambarus clarkii），分别连续免疫7 d和14 d后，进行WSSV攻毒实验。实验结果显示，10 d内对照组的死亡率超过90%，VP28、TAT-VP28蛋白疫苗组的死亡率分别为36.7%、43.3%；50.0%和60%。攻毒实验结果表明，相较于VP28亚单位疫苗，TAT-VP28重组亚单位疫苗对WSSV感染具有良好的抵抗效果，且其免疫保护率较高。

除了使用菌体作为疫苗的生物载体外，有时水生植物也可作为疫苗的生物载体成分发挥作用。

贾晓会等^[43]利用鱼腥藻7120（Anabaena sp. PCC 7120）作为表达主要包膜蛋白VP28的载体，口服免疫凡纳滨对虾（L. vannamei）仔虾，观察仔虾在接种此种疫苗后对WSSV的抵抗力。实验者将仔虾分为5组，1组和2组投喂未经处理的饲料；3组口服含野生型鱼腥藻的疫苗，4组口服无鱼腥藻的疫苗，5组口服含VP28蛋白的突变型疫苗，各组持续投喂10 d，对2-4组进行5 h的WSSV浸泡攻毒实验。攻毒实验结果显示，1-5组的存活率分别为100%、0%、15.5%、20.6%和68%，重组生物疫苗能够使凡纳滨对虾产生抵抗WSSV的较好的免疫能力。

生物载体疫苗相较于传统的疫苗，在表达外源抗原成分时有更多的选择性，并且在抗原呈递方面有效性较高^[44]，可根据不同的抗原特性制备不同的载体疫苗，或者在同一种载体疫苗上插入多种外源抗原，达到一种疫苗可防治几种疾病的效果^[45]。

生物载体疫苗还可以诱导机体产生非特异性甚至特异性免疫反应，但是正是由于载体会使机体产生免疫反应这一特性，载体会受到母源抗体的干扰，从而影响生物载体疫苗的二次免疫反应；同时，生物载体疫苗的抗原成分也会对宿主造成潜在的威胁性^[46]。因此，针对抗原选用合适的生物载体，提高生物载体疫苗的安全性和适用性成为大批量生产生物载体疫苗的前提。

4.3 其他的一些口服疫苗

除了上述佐剂疫苗和生物载体疫苗外，Companjen等^[14]制备了一种特殊的口服疫苗，该口服疫苗主要为融合蛋白，由肠黏连分子和植物病毒肽组成，肠黏附分子结合在肠道内，植物病毒肽作为抗原诱导体液免疫反应。在实验中运用融合的肠道黏附分子和表达于马铃薯块茎的B和T细胞的抗原表位，二者具有良好的异源线性，通过口服疫苗，随后在鲤鱼的后肠中发挥免疫功能，介导体液免疫反应的发生。

付天增等^[47]制备了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗，并与全菌灭活疫苗分别口服免疫罗非鱼（Oreochromis niloticus），首次免疫后14 d再采用相同方法增强免疫。攻毒结果显示，灭活全菌疫苗和菌蜕疫苗的RPS分别为60%、77%，两者的相对保护率相较于对照组明显偏高（P < 0.05），证明菌蜕疫苗相比于灭活全菌疫苗能够在罗非鱼感染爱德华菌病时提供更高的免疫保护力。

5 结语

疫苗通过口服进行免疫是一种较为简单快捷的免疫方式，它避免了注射疫苗和浸泡疫苗存在的一些问题，减少了劳动强度和人工投入，更重要的是减少了注射免疫带来的强应激反应。这种免疫方式并不受鱼体大小、种类、地点及时间等的限制，是一种较为理想的疫苗给予方式。口服疫苗在消化道中主要以黏膜免疫为主，但是就目前的研究来看，其黏膜免疫的具体机制尚不清楚。因此，在后续的工作中应该就黏膜免疫这方面展开更深入的研究。

研究口服疫苗一个不可回避的问题就是怎样避免消化道对抗原的影响，怎样维持疫苗在到达后肠前的稳定性和完整性，以及抗原的释放问题。就目前处于实验室研究阶段的口服疫苗其免疫效果仍然与注射疫苗的免疫效果有差距，甚至有时只能达到注射疫苗免疫效果的一半。因此，在疫苗生产中抗原的处理方式，有效剂量，疫苗的包裹材料、载体及佐剂等的类型、疫苗形式以及免疫时间、免疫次数、实验鱼的生理发育阶段等都需要研究者进一步详尽的研究，不断攻克水产口服疫苗的关键技术，切实提高口服疫苗的免疫效果，为水产养殖的健康保驾护航。