CRISPR是细菌及古细菌中的一种基于RNA的后天免疫防御系统（Clustered regularly interspersed short palindromic repeats）[1]。CRISPR可利用导向RNA指导Cas蛋白（CRISPR-associated proteins）对目的基因组进行修饰，其结构包括3部分：5'端的反式激活核糖核酸基因，中间部分的Cas蛋白结构基因和3'端的CRISPR基因座，反式激活核糖核酸基因表达产生的tracrRNA和CRISPR基因表达产生的crRNA组成二元复合体，能够引导Cas蛋白识别切割目标位点[2]。Barrangou等[3]发现噬菌体入侵后，细菌利用CRISPR系统整合来自噬菌体的基因组，并改变自身的细胞表型的抵抗性，用以抵抗入侵的噬菌体，而且这种抵抗特异性取决于整合序列的相似性。2008年，Marraffini等[4]首次通过实验在葡萄球菌中验证了这种功能。所谓结构决定功能，加州大学UCB人员报告了两种主要的Cas9蛋白子型晶体结构，进而揭示了所有Cas9家庭成员的结构核心[5]，这对后期理解CRISPR的作用机理具有重要意义。
到2012年，CRISPR这个新型基因组定向编辑系统基本成型，并首次登上历史舞台[6-8]，与ZFN、TALEN相比，该系统由导向RNA识别靶位点，简单，精确，高效。形象地说，其精确度几乎与word文档中的“查找替换”功能相当。随着CRISPR的不断发展，现已应用于体外培养的细胞[7-8]和各种不同的模式生物中，从将其应用于小鼠[9-10]、细菌[11]、真菌[12]、斑马鱼[13]，到实现在植物中的基因组编辑[14]，如对西红柿品种的改良[15]以及编辑棉花耐盐相关的内源基因[16]，再到对人类细胞的基因组编辑[8]，同时也证实了该技术在高等灵长类动物中的可应用性[17]，近两年在猪、猴等大型动物中实现靶向基因编辑并成功构建动物模型、细胞模型应用于医学。2017年，来自密歇根州立大学等机构的研究人员首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对猕猴胚胎进行了编辑[18]。最近，科学家使用CRISPR技术编码细菌DNA中的信息，这是CRISPR技术首次被用于向DNA中写入数据[19]。基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。可以说，短短几年CRISPR基因编辑技术迅速席卷了从基础科学研究到农业育种及基因治疗的各个领域。
2 CRISPR技术的改进历程随着CRISPR的不断发展，该技术不仅可以编辑基因组中的单个基因，也可以对不同的基因位点同时进行编辑。不仅能对DNA编辑，也首次实现了对RNA的编辑。2016年4月，来自美国加州大学的研究人员从改变CRISPR/Cas9系统的角度出发，设计了PAMmer短核酸片段与gRNA一起引导Cas9靶向RNA。经检验，该系统成功地靶向编码蛋白ACTB、TFRC和CCNA2的RNA[20]。这一发现使得不需要使用人工标记就能实现一段时间内在活细胞中追踪RNA，保证了正常的细胞过程。之后，科学家发现了几种新型的CRISPR酶，它们是CRISPR蛋白-Cas13a突变体，这些酶如果被激活就像“吃豆人”一样能够“嚼碎”RNA，因此这些酶类或许能作为诊断传染性病毒的敏感检测器[21-22]。但CRISPR本身在应用中显得不尽完美，科学家不断致力于完善CRISPR本身，以提高该技术的精确性和有效性。
传统的CRISPR是利用Cas9蛋白对目标基因进行切割，2013年首次报道的基于标准系统的CRISPRi（CRISPR interference）能够精确有效和可逆地抑制基因表达，它使用的是由两种蛋白组分形成的融合蛋白：可经强力霉素（Doxycycline）诱导而失活的Cas9蛋白（dCas9）和KRAB蛋白的抑制结构域[23]。2016年，Mandegar等[24]首次利用CRISPRi抑制了人类诱导多能干细胞（iPSCs）基因的表达：先将编码dCas9的基因和编码KRAB抑制结构域的基因融合，形成融合基因dCas9-KRAB的抑制基因，将该融合基因导到病毒载体上，并导入宿主细胞（如iPSCs和源自iPSCs的心肌细胞）使其表达，产生的融合蛋白停留在基因组靶位点上并抑制基因表达而无需切割DNA。尽管CRISPRi暂时地抑制基因表达确实比标准系统精确高效，但真正应用到基因治疗领域则必须考虑病毒载体的可实施性。2015年9月，CRISPR领头人之一张锋发现了一种迄今为止最为简单的CRISPR系统——CRISPR/Cpf，酶Cpf1来自弗朗西斯氏菌，具有双重切割功能：能切割DNA，也能切割RNA。利用Cpf1切割crRNA前体发夹结构上游从而产生成熟的crRNA，成熟的crRNA引导酶Cpf1特异性地靶向目标序列[25]，显而易见，这个过程并不需要tracrRNA分子的帮助。因此，CRISPR/Cpf比CRISPR/Cas9更为简单，比CRISPRi应用更广泛。并且，在2016年6月的一项新研究中，使用Cpf1蛋白家族中编辑效率最高的AsCpf1和LbCpf1开展Degenome-seq测试结果表明，CRISPR/Cpf几乎没有脱靶效应[26]，这更证明了相比于Cas9，Cpf更优越。
2015年11月，Bolukbasi等[27]科学家将程序化的DNA结合结构域pDBD融入CRISPR/Cas9系统，从而衰减Cas9固有的DNA结合蛋白亲和力，结果表明，这种可调控的Cas9-pDBD嵌合体可以提高约100倍的精确性。同年12月，来自美国德州理工大学健康科学中心的研究人员通过将双链延伸约5 bp、改变胸腺嘧啶到胞嘧啶或鸟嘌呤的连续序列的第4个胸腺嘧啶等方法优化sgRNA，使CRISPR基因敲除能力提高50%[28]。也有科学家通过使用PAM经过修饰的金黄色葡萄球菌，测试扩宽靶点范围后CRISPR的效果，从而改变该技术的准确性，而且这种改变PAM的特异性不需要结构信息，因此对于Cas9直系同源物具有广泛的适用性[29]。在一项新的研究中，科学家将一种脱氨酶引入CRISPR/Cas9系统，这样引起DNA单个核苷酸的变化可避免产生有害的双链断裂[30]。2017年，科学家默克研发了一种新型基因组编辑技术，名为“proxy-CRISPR”，它能够覆盖先前无法到达的基因组区域，使得CRISPR变得更加高效、灵活和具有特征性[31]。这些研究结果表明，通过对PAM、sgRNA、核酶等方面的研究，CRISPR技术局限性在不断改进和完善。
除此之外，也有科学家从研究CRISPR的精细结构和作用机制出发来改进该系统。美国加州大学的科学家利用X射线晶体衍射对CRISPR/Cas9剪切DNA的过程进行了更深入地观察，在捕获Cas9蛋白进行DNA编辑时的3D图像之后，发现Cas9会使DNA螺旋发生弯曲30°，为R环的形成提供了所需的变形结构。理解CRISPR在作用过程中R环的形成原因，可以帮助避免对DNA链进行错误剪切[32]。在细菌中，CRISPR识别并作用于外源DNA，从而阻止它对细菌细胞的破坏。而大肠杆菌是如何区分该细菌自身和外来遗传物质的，Hayes等[33]科学家构建了大肠杆菌的CRISPR相关抗病毒防御复合体识别病毒遗传物质时的结构图，解释了其作用机制。以上这些研究对于提高CRISPR的准确性、解决CRISPR的靶向错误以及治疗临床疾病都具有重要意义。
与捕获外源DNA的CRISPR系统十分类似，研究人员还发现细菌能够利用RT-Cas1融合蛋白，以一种依赖于RT（逆转录酶）的方式在体内获得外源RNA，RT-Cas1和Cas2能够在体外将该RNA整合到细菌本身的CRISPR序列中，有望将该系统转入有机体内作为病毒检测器使用[34]。此外，加拿大戴尔豪斯大学医学院Dellaire博士首次证实在非分裂细胞中进行基因编辑确实是可能的[35]。第一个CRISPR编辑的有机体——工程化蘑菇也已经开始种植并售卖[36]等，这些研究无疑将CRISPR的发展推到了一个新的高度。
尽管CRISPR技术广泛应用于各大领域，但是它同时也存在着“脱靶效应”这个科学家一直以来攻克的难题。2016年初，在CRISPR共同体会议上（Creating a CRISPR Community），美国马萨诸塞州总医院和哈佛医学院的Keith Joung等对Cas9蛋白进行了多种改造，最终将其靶向错误下调到探测限制之下。Caribou Biosciences CEO Rachel Haurwitz也报告了一种由Caribou Biosciences与DuPont Pioneer合作开发的新型基因组水平无偏技术，用于探测CRISPR的靶向错误，期待该技术能提高CRISPR的有效性。近日，两种分析CRISPR/Cas9基因组编辑脱靶效应的新方法发表在了期刊Nature Methods上[37-38]。研究人员发现了两个CRISPR“关闭开关”：AcrllA2和AcrllA4，其中AcrllA4能将脱靶效应减少4倍，它们能够对Cas9酶发挥抑制作用，阻碍了它的活性，有效降低了脱靶效应[39-40]。此外，Cas9靶向人类细胞精确性的证实对于基因治疗和细胞疗法的发展也有很大的推动作用[41]。基于多重Digenome-seq（Digested genome sequencing）的工具，近日被科学家发现能同时绘制高达11种Cas9核酸酶的全基因组特异性，发现想要的和不想要的插入和缺失，节约了时间，降低了成本[42]。
3 CRISPR技术在基因治疗及医学领域方面的应用多年来，血液病、肿瘤、遗传病等疾病一直是医学界的研究难题，而CRISPR无疑推动了基因治疗攻克这些疾病的进程。移植器官的短缺一直是治疗器官衰竭的主要障碍，猪是异种供体最理想的动物，但内源性逆转录病毒（一种致癌病毒）的存在却成了器官移植路上的绊脚石。2015年11月，中国留学生杨璐菡领导的研究团队利用CRISPR清除了猪基因组中的这些致癌的病毒基因。他们首先确定了PK15（猪肾上皮细胞系）逆转录病毒的拷贝数是62，然后使用CRISPR灭活了这些病毒基因，并且通过实验证明消除这些病毒基因对于这种器官移植带来的传染性降低至少1 000倍[43]，此项研究扫清了猪器官用于人体移植的重大障碍，大大提高了异种移植在临床上应用上的可能性，因此被称为“基因工程的壮举”。而另一种疾病，由抗肌萎缩蛋白基因的突变造成的杜氏肌肉营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD），也是一个极具毁灭性的疾病，始终困扰着医学界。2016年，研究者在患杜氏肌肉营养不良症的小鼠模型中利用CRISPR敲除有缺陷的基因，恢复了肌营养不良蛋白的表达，成功治愈杜氏营养不良[44-46]，这标志着首次利用CRISPR成功实现对遗传病动物出生后的基因治疗，给此病的患者带来了希望。通过直接纠正致病突变，基因编辑技术CRISPR/Cas9表现出了治疗遗传疾病的重大潜能。研究人员通过研究利用该技术帮助治疗镰刀形细胞病和β地中海贫血症[47]。2017年，科学家利用CRISPR/Cas9技术，敲除视细胞上Nrl与Nr2e3这两个基因来帮助患者摆脱失明的阴影[48]。中国科学家发现无论在体外还是体内，CRISPR都能抑制HBV的表达，迈出了利用CRISPR治疗HBV的第一步[49]。之后，研究人员发现利用“基因魔剪” CRISPR/Cas9成功地在活体动物基因组中切除HIV-1 DNA片段，完全关闭了HIV-1的复制，从而消除HBV引发的后期感染，这项研究加速了CRISPR治疗HBV的进程[50-51]。
科学家Paquet等[52]成功利用CRISPR技术构建出细胞疾病模型，在细胞中重现了疾病发生的过程，研究者报告了一种基于CRISPR的基因组编辑框架，能够高效精确且有选择性地引入等位基因序列从而引起改变，并且建立“Correct”这种方式来实现无痕基因组编辑，该技术可以高效精确地将致病基因导入细胞中从而获取细胞模型进行更深入地研究，为基因疗法提供了新视角。
除此之外，杜克大学的科学家们利用CRISPR/Cas9技术将小鼠结缔组织中分离出的细胞直接转化成了神经元细胞。他们是利用CRISPR的修改版直接启动已经存在于基因组中的天然拷贝。这种方法产生的神经元细胞比以往更完整而持久，有望用于神经疾病的建模并开发新疗法[53-54]。2016年8月，美国康奈尔大学、中南大学湘雅医院等机构的科学家利用人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells，hESCs）平台和高通量药物/小分子化合物平台，与新型基因打靶技术CRISPR、新一代RNA测序技术以及hESCs定向胰岛β细胞分化技术结合，在全球首次完成了2型糖尿病易感基因在hESCs定向胰岛β细胞分化过程中的相关功能验证，并阐述了这些基因在2型糖尿病中的部分机制[54-55]。科学家们还利用基因编辑技术改造小鼠干细胞，使得它们能够抵抗关节炎和其他的慢性疾病导致的炎症[56]。基于CRISPR/Cas9技术，科学家发明了一种同源非依赖性靶向插入技术（Homology-independent targeting insertion，HITI），该技术是一种全新的、可应用于基础研究和临床治疗的基因编辑方法。这种技术能够部分恢复失明的啮齿类动物的视觉反应，为治疗多种视网膜疾病、心脏疾病和神经疾病等方法打开新的途径[57]。2016年科学家利用CRISPR/Cas9编辑小鼠胚胎干细胞，解释了一种类型的lncRNA（Long non-coding RNA）与细胞内的蛋白质相互作用的过程，从而控制心肌细胞的发展[58]。2016年8月，美国麻省理工学院的研究人员首次利用CRISPR/Cas9让人细胞变身为记忆存储系统[59]。2017年2月，西奈山伊坎医学院的研究人员创建了一种能够展示从正常血细胞到白血病一步步进展的新模型。科学家们是利用CRISPR技术将来自骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病患者的血细胞转变成诱导多功能干细胞。这类干细胞能够模拟疾病从健康状态到白血病的所有阶段[54, 60]。2017年1月，Salk研究所的科学家小组利用CRISPR技术首次成功培育出了人-猪嵌合体胚胎，这是干细胞研究领域的一个里程碑[54, 61]。同年7月，中国科学家首次将基因编辑技术用于干细胞的遗传增强，宣布了国际上第一例遗传增强人类干细胞（Genetically enhanced stem cells，GES细胞）的诞生。所谓遗传指的是这种基因组上的改变在干细胞分裂的过程中，能够稳定地传递给子细胞，而增强指的是经过这一微小的遗传密码的改变，干细胞会“老”的更慢，可以在患者体内存活更长时间，产生更好的再生治疗效果[62]。CRISPR作为基因编辑领域的一项新技术，它对医学领域的贡献可以说是百花齐放，硕果累累。
基于CRISPR，癌症的治疗也在不断取得突破性进展。2015年，研究者首次在一个癌症动物模型中系统地“敲除”了整个基因组的所有基因，揭示了与肿瘤进化和转移相关的一些基因[63]，可以说，这是利用CRISPR在体内鉴别癌症和其他复杂疾病相关基因的重要一步。2016年，科学家利用CRISPR/Cas9技术和特殊的DNA条形码（DNA barcodes）设计了一种用于描述和追踪含感兴趣突变的癌细胞亚群情况的方法。研究人员利用这一技术模拟了肺癌细胞抵抗EGFR抑制剂的不同机制。CRISPR-barcoding可以对大多数类型的遗传修饰进行调查，是一种简单且高度灵活的方法，有望促进对特定突变的功能研究[64]。2017年，来自匹兹堡大学医学院的研究人员利用CRISPR基因编辑技术有效靶向作用促癌“融合基因”，改善了恶性肝癌和前列腺癌小鼠模型的生存率[65]。科学家还利用CRISPR基因编辑系统对小鼠进行研究发现，小鼠机体中或许能够产生和人类机体肿瘤非常相似的结肠肿瘤，相关研究或许能帮助科学家阐明疾病进展的分子机制以及开发新型的治疗方法[66-67]。
4 CRISPR前景及展望CRISPR技术自出现就受到广泛关注，已成为新时代科学研究领域的有力工具。目前，尽管对其功能和作用机理进行了诸多研究，以优化CRISPR系统从而提高它的有效性和特异性，但是仍然存在一些不足之处，如20 bp的识别位点的特异性有限，可能造成较高的脱靶效应，最终导致严重后果，如引发癌症等。且在Cas9系统中，切割位点必须含有前间区序列邻近基序（Protospacer adjacent motif，PAM），限制了对任意序列的切割。此外，gRNA容易形成二级结构等等都对该技术都有一定的局限性，这些都需要进行更深层次地研究。
未来CRISPR系统研究重点依然在于降低脱靶率，提高其特异性和精确性，可以从优化sgRNA结构、脱靶检测方法、改造Cas9蛋白或寻找更合适的蛋白等方面入手。河北科技大学的韩春雨团队在2016年发现了类似于Cas9的Ago蛋白家族的内切酶也能利用寡核苷酸作为向导来降解入侵的基因组，这种NgAgo-gDNA系统不像Cas9系统需要PAM序列，结果表明这种方法无靶向不匹配而且能高效编辑富含G+C的目标基因组。同时，韩春雨指出，Argonaute家族有很多可能做基因编辑的蛋白质[68]。这项重大发现可以说是轰动了整个世界，许多科学家和学者对这一发明产生了好奇，纷纷在各大实验室展开重复实验。有些实验室成功复制了这一实验，但也有许多科学家无法成功复制这一伟大的发现，于是这项研究一直饱受争议。近日一个中国研究团队发表了一项关于NgAgo的新成果，证明了NgAgo-gDNA能够通过促进pgRNA（Peregenomic RNA）的降解有效抑制乙肝病毒的复制，但他们没有检测到NgAgo有任何DNA编辑的能力[69]。2017年8月2日，因被众多科学人员质疑，韩春雨团队主动要求撤稿。而韩春雨表示这项技术的确在自己的实验室有效，他们将会继续研究这项技术，调查重复率低的原因。这项新技术无疑为基因编辑技术的发明提供了新的研究方向和视角，其发展还处于初期阶段，有关此方面的问题还需科学家们进一步研究和验证。
其次，CRISPR改造生殖细胞受到了极大的伦理挑战。中国广州中山大学黄军课题组[70]用CRISPR首次编辑了人类胚胎基因组，这一事件引起了广泛的国际争议，许多科学家强烈反对利用CRISPR改造人类生殖细胞。然而，2016年3月，英国人类生育与胚胎学管理局宣布正式批准了伦敦弗朗西斯·克里克研究所研究员Kathy Niakan对人类胚胎进行编辑的请求。
CRISPR/Cas9基因驱动技术和其改造人类生殖细胞一样饱受争议。如果基因驱动能够在一定程度上控制一个物种的繁殖或生存，从理论上说，它就能够让该物种灭绝。加上CRISPR操作过程非常简单易懂，那么，一旦有人滥用，对人类而言将是危害性的毁灭。因此，对CRISPR技术避害扬正，让其更好地为人类服务，将是基因编辑界在研究过程中需要长期坚持的理念。
总之，CRISPR是新时代科学研究领域的有力工具，在食品、农业、医学等方面具有十分广阔的应用前景。但CRISPR不仅能进行基因组的编辑，而且在基因表达调控、细胞定位运输功能、新型沉默RNA系统等方面的作用也不断显现。此外，人类诱导多功能干细胞（iPSCs）和CRISPR/Cas9技术的发展从根本上改变了研究者对生物医学、干细胞生物学和人类遗传学的研究[71]。如今CRISPR技术应用于功能基因组学研究、转基因动物模型的构建、活细胞和组织中的基因组成像和谱系追踪[72]。相信在不久的将来，CRISPR将能够编辑整个生物网络，帮助人类逐步理解细胞系统，不断攻克各种疑难病症。
致谢 感谢山西师范大学生命科学学院13540301班的全体同学（成晓辉，崔冰洁，丁晨，郭俊，王学叶，齐迎迎，何方建，胡亚楠，侯旭峰，金麟雨，刘卓群，卢贵享，聂志华，朴意娜，苏鹏飞，王彤，赵丹，张玉萍，邹玉麟）在文献搜集、整理、翻译中所做的贡献。| [1] |
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