漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，由日本学者Yoshida^[1]于1883年在日本漆树漆液中首次发现。漆酶能够降解酚类、芳胺类、羧酸、金属有机化合物等底物生成醌类化合物、羰基化合物和水^[2]，在食用菌栽培^[3-5]、饮料加工^[6]、生物制浆^[7]、废水脱色^[8-11]、食品安全^[12]和环境保护^[13]等方面具有广泛的应用潜力，已成为生物学、化学、环境科学等交叉领域的研究热点^[14-15]。

大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)，又名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红色球盖菇，属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科、球盖菇属^[16]。大球盖菇含有蛋白质、糖类、矿物质、维生素等营养物质，人体必需氨基酸齐全，作为一种无污染的安全食品，不仅是国际菇类交易市场的十大菇类之一，也是联合国粮农组织向发展中国家推荐栽培的新菇种之一。

分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌、子囊菌及半知菌等高等真菌^[1]，如灵芝^[2]、黑木耳^[17]、平菇^[18]、灰树花^[19]、白灵菇^[20]、云芝^[21-23]等，但不同种属产漆酶能力各不相同，其酶学性质也存在较大差异，目前大球盖菇产漆酶的报道较少。本研究从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离到漆酶，对其进行酶学性质研究，旨在为其工业化生产与应用提供理论指导。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

大球盖菇Sr-01菌株由天津市林业果树研究所食用菌研究室保藏。

1.1.2 培养基

PDA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，pH 5.5。液体发酵培养基(g/L)：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，MgSO₄ 1 g，KH₂PO₄ 2 g，pH 5.5。

1.1.3 试剂

ABTS，美国Sigma公司；Q-Sepharose琼脂糖凝胶、Superdex 200葡聚糖凝胶，美国GE Healthcare公司；蛋白质分子量标准Marker，宝生物工程(大连)有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器

电子天平(BS224S型)：北京赛多利斯仪器系统有限公司；pH计(PHS-3C型)：上海精密科学仪器有限公司；卧式恒温摇床(HNY-211C型)：天津欧诺仪器股份有限公司；紫外可见分光光度计(TU-1810型)：北京普析通用仪器有限责任公司；高速冷冻离心机(GL-20C型)：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅(DK-320S型)：上海精宏实验设备有限公司；蛋白凝胶电泳仪(DYCZ-24DN型)：北京市六一仪器厂；全波长酶标仪(Multiskan FC型)：美国Thermo Scientific公司。

1.2 方法 1.2.1 粗酶液的制备

菌株活化：将供试菌株从试管斜面接入PDA固体平板，28℃培养6 d。发酵培养：取已活化的菌株，用打孔器切取直径1 cm的菌饼3块，接入装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/min培养6 d。发酵结束后，4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清，即粗酶液。

1.2.2 分离纯化 1.2.2.1 硫酸铵分级沉淀

向粗酶液中加入(NH₄)₂ SO₄至30%饱和度，4℃静置2 h，10 000 r/min离心20 min，取上清，继续加入(NH₄)₂ SO₄至70 %饱和度，4℃静置2 h，10 000 r/min离心20 min，取沉淀，重悬于去离子水，置于MW 3500的透析袋中，4℃透析12 h，每隔4 h换1次水，10 000 r/min离心20 min，取上清，冷冻干燥，即粗蛋白^[17]。

1.2.2.2 Q-Sepharose阴离子交换层析

将样品重悬于50 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)，10 000 r/min离心10 min，取上清，上样于50 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)已平衡的Q-Sepharose阴离子交换层析柱，先用50 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)洗脱未吸附蛋白，再用含0-1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)梯度洗脱，流速1.0 mL/min，收集洗脱液，每管1.0 mL，测定各洗脱峰的漆酶活性。

1.2.2.3 Superdex 200凝胶过滤层析

用含500 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.0)平衡Superdex 200凝胶过滤层析柱，将经Q-Sepharose阴离子交换层析的活性组分浓缩至2.0 mL，上样，用含500 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris(pH 8.0)缓冲液洗脱，流速1.0 mL/min，收集洗脱液，每管1.0 mL，测定各洗脱峰的漆酶活性。

1.2.3 酶学性质研究 1.2.3.1 最适反应温度和热稳定性

将反应体系在不同温度下(10-80℃)处理5 min，测定漆酶活性，每组3个重复，以活力最高值为100%，计算其它温度下的相对酶活。将反应体系在不同温度下(10-80℃)处理60 min，测定漆酶活性，每组3个重复，以各温度下初始活力为100%，计算处理后残余活力。

1.2.3.2 最适反应pH和pH稳定性

将反应体系分别置于pH 2.0-8.0缓冲液中，35℃处理5 min，测定漆酶活性，每组3个重复，以活力最高值为100%，计算其它pH下的相对酶活。将反应体系分别置于pH 2.0-8.0的缓冲液中处理60 min，测定漆酶活性，每组3个重复，以各pH下初始活力为100%，计算处理后的残余活力。

1.2.3.3 金属离子对酶活的影响

在反应体系中分别添加终浓度为0.5 mmol/L的不同金属离子(Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺)，每组3个重复，35℃处理5 min，测定漆酶活性，以金属离子未处理的酶活力为100%，计算添加金属离子后的相对酶活。

1.2.4 指标测定 1.2.4.1 活性测定

采用ABTS法^[2]。2 mL反应体系，含0.5 mmol/L ABTS溶液(pH 5.0、0.1 mmol/L的HAc-NaAc缓冲液配制)1.9 mL，样品0.1 mL，以去离子水为空白对照，30℃反应5 min，420 nm波长处测吸光值。1个酶活力单位(U)定义为1 min氧化1 μmol/L底物ABTS所需的酶量。

1.2.4.2 相对分子质量测定

采用SDS-PAGE法^[24]。分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，上样量10 μL。根据已知相对分子质量的标准蛋白Marker在SDS-PAGE中的相对迁移率，估计漆酶的相对分子质量。

1.2.5 数据处理

所有试验均设3个重复，试验数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析。

2 结果 2.1 分离纯化

由图 1可知，粗蛋白经Q-Sepharose阴离子交换柱层析梯度洗脱后出现1个穿透峰(QF)和5个洗脱峰(QE1-5)，5个洗脱峰所对应的NaCl浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mol/L，测定酶活发现活性组分集中在第2个洗脱峰，即洗脱至30 min时出现的吸收峰QE2具有漆酶活性。

由图 2可知，阴离子交换层析后得到的活性组分QE2经Superdex 200凝胶过滤层析后出现4个洗脱峰(SE1-4)，测定酶活发现活性组分集中在第3个洗脱峰，即洗脱至80 min时出现的吸收峰SE3具有漆酶活性。

纯化后的漆酶经SDS-PAGE检测，结果(图 3)显示为单一条带，表明样品已达到电泳纯，其相对分子质量约40 kD，凝胶过滤层析结果也显示相似的分子量，表明该漆酶为单体蛋白。

漆酶分离纯化结果如表 1所示，纯化后的漆酶比活力为152.79 U/mg，回收率为35.8%。

2.2 酶学性质 2.2.1 最适反应温度和热稳定性

由图 4可知，大球盖菇漆酶在35℃时活性最高，在20-50℃范围内表现出较高活性，相对酶活保持在80%以上。高于70℃时，酶活显著降低，这可能是因为高温导致蛋白变性而使其失活。因此，该漆酶的最适反应温度为35℃，适宜在较温和条件下反应。由图 5可知，大球盖菇漆酶在10-40℃范围内表现出较好的稳定性，相对酶活保持在80%以上。随着温度升高，酶活逐渐降低，高于70℃时，漆酶已完全失活。因此，该漆酶对高温比较敏感，不适宜在高温条件下贮存。

2.2.2 最适反应pH和pH稳定性

由图 6可知，大球盖菇漆酶在pH 4.0时活性最高，在pH 3.0-5.0范围内表现出较高的活性，相对酶活保持在80%以上。当pH小于3.0或大于5.0时，随着pH降低或升高，酶活逐渐降低，当pH大于7.0时，漆酶已完全失活。因此，该漆酶的最适反应pH为4.0，适宜在弱酸性条件下反应。由图 7可知，大球盖菇漆酶在pH 3.0-5.0范围内表现出较好的稳定性，相对酶活保持在80%以上。当pH小于3.0或大于5.0时，随着pH降低或升高，酶活逐渐降低。因此，该漆酶适宜在弱酸性条件下贮存。

2.2.3 金属离子对酶活的影响

与空白对照相比，Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对酶活有激活作用，其中Cu²⁺的激活作用最显著，使酶活提高23.5%；其它金属离子对酶活均表现出不同程度的抑制作用，其中Fe²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺的抑制作用最显著，相对酶活分别为对照组的63.5%、73.3%、67.3%，而K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mn²⁺对酶活抑制作用较小(图 8)。

2.2.4 优化反应后的酶活力

根据温度、pH、金属离子的最适反应条件，在35℃、pH4.0、0.5 mmol/L Cu²⁺存在的条件下，对纯化后的漆酶进行活性测定，比活力可达222.93 U/mg，比优化前提高45.9%。

3 讨论

大球盖菇作为一种新兴的珍稀优质食用菌，具有广阔的开发潜力和市场前景。但是，由于我国引种栽培较晚，国内有关研究较少，已有研究主要集中在育种、栽培等方面，对其活性成分的报道较少。因此，大球盖菇中活性蛋白及其功能的探讨与研究，对于蛋白质资源的开发与利用具有重要意义。

本研究采用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析，从大球盖菇发酵液中分离到相对分子质量约40 kD的漆酶，其中所涉及的分离纯化方法与其他学者采用的技术手段类似，如翁彩红等^[2]采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析，从松杉灵芝发酵液中分离到52 kD的漆酶。韩增华等^[17]通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析，从黑木耳发酵液中分离到19 kD的漆酶LacC。马茜茜等^[25]采用DEAE-cellulose、CM-cellulose和Q-Sepharose离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析，从云芝发酵液中分离到67 kD的漆酶。陈晓平等^[26]采用盐析、DEAE-Agarose离子交换层析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，从桑黄发酵液中分离到69.3 kD的漆酶。

食用菌漆酶的酶学性质在不同种属间差异较大，大多数食用菌漆酶的最适反应温度在25-50℃之间，最适pH值在4.0-6.0之间^{[1, 27]}。如肖楚等^[28]研究发现黑木耳漆酶的最适温度为45℃，最适pH值为4.0，姚良同等^[29]研究发现滑菇漆酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH值为4.8。但赵晓燕等^[30]研究发现灰树花漆酶的最适反应温度和pH分别为65℃和2.2，佟硕秋等^[19]研究表明灰树花漆酶催化ABTS的最适pH值为3.0，55℃时活性最高。

本研究中大球盖菇漆酶催化ABTS的最适反应温度为35℃，在低于40℃条件下处理60 min，相对酶活仍保持在80%以上。少数食用菌漆酶具有耐高温性，如韩增华等^[17]研究发现黑木耳漆酶LacC的最适反应温度为55℃，窦隆等^[18]研究发现糙皮侧耳漆酶的最适反应温度为63℃。

大多数食用菌漆酶在酸性pH值下催化效率较高^{[16, 20]}，且不同来源的漆酶最适pH范围不同。本研究中大球盖菇漆酶的最适反应pH值为4.0，在pH 3.0-5.0范围内处理60 min，相对酶活仍保持在80%以上，表明该漆酶为酸性蛋白，不适宜在过酸或偏碱的条件下反应。

大多数金属离子均可影响漆酶活性^[27]。本研究发现Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对大球盖菇漆酶具有激活作用，其中Cu²⁺激活作用最显著，而Fe²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺则有显著抑制作用。因此，在生产应用中应严格控制反应体系中Fe²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺的存在。

4 结论

通过硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析，从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离到相对分子质量约40 kD的漆酶，最适反应温度为35℃，在10-40℃范围内具有良好的稳定性，最适pH值为4.0，在pH 3.0-5.0范围内具有良好的稳定性，Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对酶活有激活作用，Fe²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺对酶活有显著抑制作用。