榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus)又名金顶侧耳、金顶蘑，属担子菌门(Basidiomycota)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)，侧耳属(Pleurotus(Fr.)Quel.)^[1]。其味道鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分，其中氨基酸含量尤为丰富，且必需氨基酸含量高^[2]。榆黄菇属高营养、低热量食品，长期食用，有降低血压、降低胆固醇含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖症患者的理想保健食品^[3]。

榆黄菇的人工栽培开始于20世纪70年代，现在已经能够进行周年栽培。但是到目前为止，在栽培上大都将采集的野生菌株直接用于生产，或者经过筛选驯化后作生产用菌种，新品种选育的报道较为少见^[4]。食用菌种质资源是优良品种育种的基础材料，育种成效除了取决于掌握种质资源的数量，还很大程度取决于对这些种质资源多样性的遗传特性掌握。分子标记作为食用菌遗传多样性研究中的一个重要手段，其应用越来越广泛^[5]。

ISSR是由Zietkeiwitcz等^[6]1994年创建的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记，结合了RAPD和SSR方法的优点，是一种具有稳定性和高重复性的分子标记方法，被广泛应用于食用菌方向^[7-8]。SRAP是一种由美国加州大学Li等^[9]开发的分子标记技术，通过独特的双引物设计，利用上游引物针对外显子区域，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异性扩增，上游引物和下游引物自由结合，配对出不同组合进行反应。由于物种及个体间的差异导致内含子、启动子和间隔序列不同进而产生多态性。

由于每一个方法的开发原理不同，聚类分析结果通常会存在较大的差异，将多个分子标记综合运用能最大优化聚类分析结果。目前，榆黄菇还没有系统的遗传多样性分析，鉴于此，本研究采用ISSR和SRAP两种分子标记的方法，对收集自全国19个榆黄菇菌株进行遗传多样性研究，旨为榆黄菇的分类鉴定、遗传育种和种质资源保护提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料

本研究所用菌株的名称及来源参见表 1。

1.1.2 试剂及培养基

马铃薯葡萄糖琼脂粉(BD Difco)，蛋白胨(OXIOD)，分析纯磷酸二氢钾、硫酸镁等化学试剂，均购自国药集团北京化学试剂公司；2×Taq PCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司(Sangon)合成。PDA综合培养基：马铃薯葡萄糖琼脂粉40 g、硫酸镁1.5 g、磷酸二氢钾3 g、VB₁ 10 mg、水1 000 mL。

1.1.3 仪器

PCR仪(Eppendorf Mastercycler Gradi-ent)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、紫外可见分光光度计(Labtech UV9100)、电泳仪(北京六一DYY-Ⅲ-12B)、电子分析天平(奥豪斯)、台式高速冷冻离心机(Eppendorf 5415R)、移液器(Eppendorf)等。

1.2 方法 1.2.1 PCR扩增

取在PDA平板上活化7-10 d的榆黄菇菌种，刮取少量菌丝作为实验材料，DNA的提取参照许峰等^[10]方法。ISSR扩增反应体系及扩增程序参照冯伟林等^[11]方法，ISSR-PCR反应的总体积为25 μL，体系为：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L引物(1 μL)，20-50 ng DNA(1 μL)，加灭菌双蒸水(10.5 μL)至25 μL。将反应液按上述体积加入0.2 mL离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。

ISSR-PCR程序设定：94℃预变性4 min，然后94℃变性30 s，以低于引物Tm值温度5℃复性45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。

SRAP扩增反应体系及扩增程序参照边银丙等的方法^[12]，SRAP-PCR反应的总体积为25 μL，体系为：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.4 μmol/L引物R(1 μL)、引物F(1 μL)，20-50 ng DNA(1 μL)，加灭菌双蒸水(9.5 μL)至25 μL。将反应液按上述体积加入0.2 mL离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。

SRAP-PCR程序设定：94℃预变性7 min，94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，共38个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

取8 μL PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳(2%)，置于紫外凝胶成像系统上观察并拍照记录。(所用引物参见表 2-3)

1.2.2 数据处理及分析

上述电泳图谱中同一水平上将扩增出的强带或分辨性好的弱带，均视为扩增阳性，并赋值“1”，未扩增出条带视为扩增阴性，赋值“0”，用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析。

2 结果 2.1 供试菌株ISSR分析结果

以提取的19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的PCR扩增筛选，选出10条引物(表 2)在供试菌株上扩增效果良好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。10条引物共扩增出102条DNA片段，其中多态性条带为80个，多态性为78.4%(表 4)。

不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度大多为200-2 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息(图 1-图 2)。

2.2 供试菌株SRAP分析结果

以提取的19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的PCR扩增筛选，获得的10对引物(表 3)在供试菌株上扩增效果良好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。10对引物共扩增出92条DNA片段，其中多态性条带为70条，多态性为76.1%(表 5)。

不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度大多为200-2 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息(图 3-图 4)。

2.3 供试菌株聚类分析结果

综合20条引物扩增出的194条DNA片段，其中多态性条带150条，多态性达77.3%。用NTSYSpc 2.10软件对19个榆黄菇供试菌株进行聚类分析，获得各菌株间的聚类图(图 5)。

根据聚类分析结果可知，在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类，表明19个供试榆黄菇菌株间具有较大的遗传差异，第一类包括01号、03号、04号、06号，第二类包括02号、05号、11号、12号、15号、16号、17号，第三类为13号，第四类包括07号、08号、09号、10号、14号、18号、19号；而在0.96的相似值水平上，除09号和10号两个菌株未区分开外，其余17个菌株均可单独分开。

3 讨论

食用菌菌种的鉴定和保护是食用菌产业的重要问题，市场上常出现“同名异物“或”同物异名”的现象，不仅不利于育种者的积极性也给生产者带了巨大的经济损失^[4]。传统的菌种鉴别是在子实体层次对子实体的颜色、大小、朵型等形态特征及其生理生化反应特征、栽培特性等为依据，易受生长环境的影响，一般只能鉴定到属内种间这一水平，而对于种内菌株却难以鉴别，且整个鉴定流程时间长、准确率低^[3]。

近年来，随着分子生物学技术的发展，已有多种分子标记技术(RAPD，ISSR和SRAP)应用于食用菌的分类鉴定^[13]。周洁等^[8]利用11个ISSR引物对40个姬菇杂交菌株及2个亲本菌株进行分析，分析结果表明，42个供试菌株遗传相似系数变异范围为0.428 6-0.853 7，在相似系数0.668 0时，42个菌株聚为7类，两亲本各具一类，杂交菌株与亲本菌株遗传差异较大。许峰等^[10]利用9对SRAP引物对22个白色金针菇进行聚类分析，在相似系数0.820水平时，将供试菌株分为5大类，技术揭示了北京地区金针菇菌株的遗传多样性。张静等^[14]运用SRAP，ISSR和RAPD技术对40个双胞蘑菇进行分析，其中SRAP平均多态率为70.21%；ISSR平均多态率为78.33%；RAPD平均多态率为61.94%，根据距离值不同，将40个双孢蘑菇分为6个或9个类群，更好的解释供试菌株间的亲缘关系。目前国内的分子标记技术在香菇^[15]、木耳^[16]等食用菌方面应用较广泛，但榆黄菇的报道较少，张秋胜等^[17]和崔丹等^[18]仅运用ISSR技术分析榆黄菇的遗传多样性。由于每一个方法的开发原理不同，聚类分析结果通常会存在比较大的差异，将多个分子标记综合运用能最大优化聚类分析结果^[19]。

本实验共收集了不同地区的19个榆黄菇品种，通过ISSR和SRAP两种分子标记技术，利用筛选的引物以19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，一共扩增出194条DNA片段，其中，多态性条带有150个，多态性比例为50%-100%不等，平均为77.3%，说明19种榆黄菇遗传多样性比较丰富，可以利用和开发的菌种资源较多；不同引物扩增出每种DNA的条带数量不等，为3-13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200-2 000 bp，包含了丰富的多态性。聚类分析结果表明：19株榆黄菇菌株间的遗传相似系数范围为0.67-0.95，在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类。7号和8号菌株同是引自山东莒县的菌株，聚类分析结果中聚为一簇，说明榆黄菇品种存在一定的地域性；11号和16号是来自不同地区的品种，亲缘关系虽然较近，但是仍然存在一定的差异，说明不是一个品种或同一品种通过不断的传代已经发生遗传变异；通过目前的手段没有能够区分9号和10号菌株，说明二者的亲缘关系很近，且两种菌株都是来自于江苏高邮，可能是同物异名。

本研究应用分子标记技术从DNA水平上系统分析评估榆黄菇种质资源的遗传多样性，为榆黄菇种质资源的鉴定、保护和育种提供了理论支持。

4 结论

本实验筛选出适合供试榆黄菇菌株的10条ISSR引物和10对SRAP引物，利用筛选的引物以19个供试榆黄菇菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，一共扩增出194条DNA片段，其中，多态性条带有150个，多态性比例为50%-100%不等，平均为77.3%，说明19个榆黄菇遗传多样性比较丰富；不同引物扩增出每种DNA的条带数量不等，为3-13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200-2 000 bp，包含了丰富的多态性。聚类分析结果表明：在相似系数为0.70水平上，可将19个供试榆黄菇菌株分为4大类，表明19个供试榆黄菇菌株间具有较大的遗传差异。