2. 四川农业大学水稻研究所，成都 611130
2. Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130
水稻稻曲病(Rice false smut)是由麦角菌科稻曲病菌Ustilaginoidea virens引起的真菌病害[1-2]。此病害已上升为水稻重要真菌病害之一[3]。稻曲病不但对水稻的产量和质量造成重大的影响，其稻曲球还产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素，毒素可抑制微管蛋白和细胞的有丝分裂[4-5]。近年来，对稻曲病菌的侵染过程、有性生殖类型、分子生物学等方面的研究有了较大的进展[6-8]。前人研究表明，稻曲病菌的菌丝能产生分生孢子和厚垣孢子，其分生孢子是病害的主要侵染源；分生孢子在水稻颖壳上附生，萌发生长成菌丝，随后菌丝通过内稃和外稃进入小穗内部，侵染雄蕊花丝，进而侵染整个花器官[9-10]。Fu等[11]研究报道，稻曲病菌的有性类型为同宗配合，通过同宗配合方式产生有性子囊孢子。子囊孢子也是稻曲病发生的初侵染源之一[12]。稻曲病菌的BAC(Bacterial artificial chromosome)文库[13]和cDNA文库[14]的构建，为致病基因的鉴定、比较基因组学等研究就奠定了基础。Zhang等[8]对稻曲病菌全基因组和功能基因的分析，为该菌侵染水稻机理提供了重要线索。
目前，稻曲病菌的基因组序列仍有许多gap，同时与致病相关的效能因子仍不明确。深入研究该菌的分子生物学水平的前提是获得理想的总DNA或RNA材料，而稻曲病菌的本身会产生大量的次生代谢产物，影响基因组DNA提取。虽然提取真菌DNA的方法比较多，但是不同真菌类群有不同的适宜提取方法[15]。江洁等[16]研究报道CTAB法对里氏木霉的基因组DNA提取效果优于SDS法；张宝俊等[17]通过比较试验发现SDS法对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的DNA提取效果优于CTAB法；贺羽等[18]研究结果表明CTAB法对苹果球壳孢腐烂病菌的DNA提取效果优于试剂盒法。本研究旨在筛选出一种适用于大量稻曲病菌基因组DNA提取的方法，进行测序，构建基因组小文库，并对文库数据进行分析，为稻曲病菌的基因组gap的填补和致病相关基因的鉴定提供数据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株稻曲病菌UV-cd2菌株为本实验室提供，采用马铃薯蔗糖固体培养基(PSA)进行培养。挑取PSA上培养的幼嫩菌丝于PS液体培养基中，置于28℃培养箱中进行振荡(150 r/min)培养，7 d后过滤收集菌丝；用无菌水洗涤菌丝2次，收集菌丝，-70℃保存备用。
1.1.2 主要试剂3% CTAB提取液(3% CTAB、1 mol/L NaCl、1 mol/L Tris-HCl(PH8.0)、0.5 mol/L EDTA、1% PVP、0.5% β-巯基乙醇)、3% SDS提取液(3% SDS、1 mol/L NaCl、1 mol/L Tris-HCl(PH8.0)、0.5 mol/L EDTA、1% PVP、0.5% β-巯基乙醇)、蛋白酶K(1 mg蛋白酶K溶于5 mL无菌双蒸水)、TE缓冲液(1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0))、醋酸钾溶液(5 mol/L KAC，-20℃预冷)、酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)、氯仿/异戊醇(24：1)(-20℃预冷)、RNase溶液(5mg RNase溶于5 mL无菌水，混匀，-20℃保存)、75%乙醇水溶液、无水乙醇。
真菌DNA提取试剂盒(产品编号：D3390-02)(Omega Bio-Tek公司，美国)。试剂盒主要成分：缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、平衡缓冲液、RNA酶、DNA洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
1.2 方法 1.2.1 稻曲病菌DNA提取 1.2.1.1 CTAB提取法取1 g稻曲病菌菌丝，加液氮研磨至粉状，加入4 mL 3%CTAB提取缓冲液；65℃水浴45 min(每隔10 min振荡1次，让菌丝细胞充分裂解)，10 000 r/min离心8 min，取上清液于一新离心管中，加入等体积的5 mol/L KAC(-20℃预冷)，在冰上冰浴30 min，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提2次；取上清液，加入2/3体积的-20℃冰冻的异丙醇，-20℃沉淀30 min以上(或过夜)，直到出现白色絮状沉淀为止，10 000 r/min离心8 min，收集沉淀；用75%酒精洗涤沉淀2次；再用无水乙醇洗涤1次，风干；加适量体积的无菌超纯水溶解沉淀DNA；加2 µL RNase，37℃水浴30 min；加等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次；取上清液，10 000 r/min离心8 min；取沉淀，加适量的双蒸水，65℃水浴，溶解DNA；电泳检测DNA的量和纯度。并用分光光度计测量OD值。
1.2.1.2 SDS提取法取1 g稻曲病菌菌丝，加液氮研磨至粉状，加入4 mL 3% SDS，其它步骤同1.2.1.1 CTAB提取法。
1.2.1.3 试剂盒提取法真菌DNA具体提取方法参照Omega真菌DNA提取试剂盒说明书(产品编号：D3390-02)。
1.2.2 构建文库、测序取1 µg DNA利用超声仪(Fisher)打断，切胶回收180 bp的片段，随后纯化DNA片段用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit-Set A(Illumina，美国)制备文库，并利用TruSeq PE Cluster Kit(Illumina，美国)进行扩增，最后在Illumina机器上进行测序反应。
1.2.3 数据装配与分析使用Velvet(V1.2.03)软件进行组装，再使用ABySS分析基因组数据的杂合率、重复度和GC含量等。
2 结果 2.1 稻曲病菌基因组DNA制备采用CTAB法、SDS法和真菌DNA试剂盒法3种方法提取稻曲病菌基因组DNA，进行电泳，成像。可以看出采用CTAB提取稻曲病菌DNA(图 1-A)的效果优于SDS和真菌DNA试剂盒(图 1-B和1-C)。用分光光度计测OD值，CTAB法和试剂盒法的OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明没有杂质污染；而SDS法的OD260/OD280 < 1.6，表明有蛋白质、糖类等杂质污染。对样品浓度进行计算，其中CTAD法DNA浓度最大，浓度达到750 ng/µL；其次为SDS法，DNA浓度达350 ng/µL；最小为试剂盒法DNA浓度，只有100-120 ng/µL。
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| 图 1 稻曲病菌基因组DNA提取 A：CTAB提取法；B：SDS提取法；C：真菌DNA试剂盒提取法(1-3：DNA；M：DNA marker) |
用Solexa测序PE(pair end)库，一共得到18 187 350碱基对序列，总碱基数为3.6 G。在测序的碱基识别(Base calling)过程中，碱基的正确识别率是98.59%即Q20为98.59%(图 2)。
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| 图 2 稻曲病菌UV-cd2碱基质量分布 |
采用velvet(V1.2.03)软件进行组装，组装结果如表 1所示。稻曲病菌UV-cd2基因组180 bp文库的contig总数为21 970个，Scaffold的总数为17 908；Contig的平均长度为1 334 bp，Scaffold的平均长度为1 639 bp；Contig的N50长度为4 766 bp，Scaffold的N50为11 662；Contig的N90长度为373 bp，Scaffold的N90为385 bp；Contig的最长碱基数为60 180 bp，Scaffold的最长碱基数为104 433 bp；Contig最短长度为52 bp，Scaffold的最短长度为200 bp；总的碱基GC含量为49.79%(图 3)。
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| 图 3 稻曲病菌UV-cd2总的碱基GC含量 |
曾有研究报道，不同方法提取的真菌基因组DNA效果不一样，如CTAB法对小麦条锈菌[15]、水稻纹枯病[19]、木霉[20]等真菌的提取效果好，而SDS法对部分镰刀菌的基因组DNA提取效果好[17]。用于文库构建的真菌基因组DNA需要高纯度、高浓度、片段在30-50 kb之间的DNA片段。在进行提取基因组DNA的过程中，所有操作器具都要经过灭菌处理。本实验采用CTAB法、SDS法和真菌DNA试剂盒法3种提取方法提取稻曲病菌基因组DNA，结果表明CTAB法能获得浓度达到750 ng/µL、OD260 / OD280在1.8-2.0之间的高质量DNA。真菌DNA试剂盒提取法也能获得纯度较高的DNA，但是获得的DNA量远远低于CTAB，这是因为试剂盒提取DNA时需要的菌丝量较少。因此，试剂盒提取法适用于需要较少量的基因组DNA提取。SDS提取的DNA有大量的杂质污染，这可能是因为SDS是阴离子去污剂，对多糖等杂质没有较好的去除效果，而CTAB是阳离子去污剂，可以很好地去除多糖等杂质。稻曲病菌在进行液体培养时，菌丝体本身会产生大量的次生代谢产物，菌丝体黏稠且呈黄绿色，因此在收集菌丝体时要用无菌水洗涤几次，以保证稻曲病菌菌丝体洁净。在稻曲病菌基因组DNA提取过程中，最常见的问题就是蛋白质和多糖的污染，因此在提取时，选择CTAB提取液能有效地去除多糖的污染，同时要加入5 mol/L KAC和蛋白酶K进行处理去除蛋白质，在提取DNA过程的最后，还要加入RNA酶，去除RNA的污染，以保证提取的稻曲病菌基因组DNA纯净。
高质量的DNA是构建基因组文库的保障。本实验成功构建了稻曲病菌UV-cd2基因组180 bp小文库。文库总碱基数为3.6 G，碱基的正确识别率Q20为98.59%，接近于正常的Q20值(99%)，表明本研究构建的基因组文库质量不错。文库组装分析得出总的碱基的GC含量为49.79%，这与Zhang等[8]报道相似。从稻曲菌基因组DNA小文库构建数据分析可得出稻曲病菌的杂合率和重复度较高，这就预示着在稻曲病菌的全基因组或染色体组装比较困难。该文库的成功构建，将为稻曲病菌基因组gap的填补和致病相关基因的鉴定提供数据，促进稻曲病菌基因组学研究。
4 结论本研究筛选出稻曲病菌基因组DNA最佳的提取方法是CTAB提取法，并构建了基因组小文库，小文库测序组装共得29 350 288碱基(bp)和17 908 Scaffold，总碱基的GC含量为49.79%，碱基的正确识别率是98.59%。
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