随着环境污染的日益加剧和化石能源的日益枯竭,可再生清洁能源生物乙醇的开发和利用受到了广泛关注。木质纤维素是世界上最丰富的生物物质资源,利用木质纤维素生产燃料乙醇具有重大的经济价值和社会意义[1]。预处理是利用木质纤维素类生物质的首要环节,迄今为止国内外研究开发了包括物理法、化学法、生物法等在内的多种预处理技术[2]。在预处理过程中会产生一些毒副产物(抑制剂),影响到微生物的正常生长和随后的发酵过程[3]。虽然预处理的方法不同,产生的抑制剂种类和含量也有一些变化,但是主要为呋喃醛类化合物、酚类化合物和弱酸3大类[4]。以下综述了各类抑制剂的形成及其作用机制,并讨论了对于抑制剂的应对措施,旨为该领域研究人员提供方法的参考。
1 抑制剂的形成及其作用机制 1.1 呋喃醛类化合物呋喃醛类化合物主要包括糠醛和羟甲基糠醛(HMF),分别由戊糖和己糖脱水形成[4-5],其中,糠醛的毒性大于HMF,两者具有相似的抑制作用和作用机制,抑制菌体生长,使延滞期增长,降低乙醇得率和产量,其中对菌体生长的抑制作用要强于对乙醇生成的抑制作用[6]。本文作者通过实验证实,糠醛在0.5-1.5 g/L范围内对菌体生长有抑制作用,但使乙醇得率提高[7]。此外,糠醛和HMF对微生物的抑制还存在着协同效应,两者共同存在时对微生物发酵的抑制效果更加明显[8]。
呋喃醛类化合物可能的抑制机制有:(1)以糠醛和HMF为代表的呋喃醛类化合物会直接抑制微生物代谢过程中一些关键酶(如乙醇脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和醛脱氢酶等)的生物学活性[9-10],从而影响微生物对糖的代谢及乙醇的生成过程。(2)两者都可被酵母的醛还原酶转化为相应的毒性较低的醇,转化过程需要消耗ATP和NAD(P)H。糠醛的转化需要辅酶NADH,NADH的减少以及糠醛对乙醇脱氢酶的直接抑制造成了乙醛在胞内积累,从而使菌体生长受到抑制,乙醇生成延迟[6]。HMF的转化偏好NADPH,而氨基酸与核酸的合成需要NADPH,HMF的转化与生物物质的合成和细胞生长相竞争。因此,糠醛和HMF存在,会与微生物代谢过程中的酶争夺NAD(P)H,使得代谢活动被抑制或延迟。(3)糠醛和HMF会降解DNA,阻碍mRNA的翻译和蛋白质合成的过程,Iwaki[11]等研究证实糠醛和HMF会诱导信使RNP颗粒的形成和衰减酿酒酵母内的翻译活动,使得酵母细胞生理状态退化。(4)近些年来的研究证实糠醛还会诱导酿酒酵母中活性氧(ROS)的积累,引起细胞损伤,细胞暴露在高浓度糠醛下,会导致细胞膜破坏,核染色质和肌动蛋白破坏,甚至死亡[12]。Allen等[12]通过实验发现当酵母在糠醛浓度25 mmol/L的培养基中培养时,经过一段延滞期之后可恢复生长,而当糠醛浓度50 mmol/L时则严重抑制了菌体的生长。在一定浓度范围内,酵母可通过将抑制因子转化为低毒的醇而具有一定的耐受性,转化即在生长延滞期进行,这时乙醇的产生以及相应的酶都被抑制,当抑制因子减少,生长便会重新开始,前提是细胞必须能够在毒性作用下幸存并修复产生的损伤。与50 mmol/L糠醛相比,25 mmol/L糠醛引起的细胞损伤减少,因此酵母在延滞期后能恢复生长。
1.2 弱酸木质纤维素水解液中的弱酸包括乙酸、甲酸和乙酰丙酸。乙酸是由两种方式形成的:在预处理的过程中,半纤维素在高温水解等作用下脱乙酰基生成[2];发酵过程中形成的副产物。甲酸由糠醛和HMF分解形成;乙酰丙酸由HMF分解形成[4-5]。
弱酸造成了胞内环境的酸化,必须通过消耗ATP将多余的质子泵出以维持胞内的中性环境,影响了细胞正常的能量供给[13]。在一定浓度范围内,弱酸对乙醇生成有促进作用,所消耗的糖更多的转化为乙醇,而在高于这一浓度时,乙醇得率则会降低[14-15]。这一现象可能是由于在弱酸存在下,需要额外的ATP产生,于是以减少生物量的生成为代价,强迫细胞通过代谢糖生成酒精来产生ATP。酒精生成受两方面的影响,生物量及ATP高需求的影响,弱酸浓度较低时,以ATP高需求因素为主,因此对酒精生成有促进作用,所消耗的糖更多的转化为酒精,而菌体生长受到一定的抑制,胞内阴离子的积聚及与酸的直接接触也都有可能影响到菌的生长,当弱酸浓度增高时,则导致细胞膜破坏,细胞活性下降甚至死亡[16]。作者通过研究甲酸、乙酸对酵母发酵的影响,证实甲酸和乙酸对菌体生长的抑制强于对乙醇生成的抑制,且甲酸的抑制程度远大于乙酸[7]。此外,有研究表明,当pH5-6的发酵液中乙酸浓度达到7.5 g/L(125 mmol/L),菌体生长就被明显抑制,且发酵环境的pH值对甲酸和乙酸的抑制作用有重要影响,较高的pH环境有利于减弱其抑制作用[17]。
1.3 酚类化合物酚类化合物主要由木质素在高温酸解等预处理过程中分解产生[2, 4-5],可分为3大类:以4-羟基苯甲醛等为代表的p-羟苯基化合物;以丁香醛等为代表的丁香族化合物;以愈创木酚、香草醛等为代表的愈创木酚族化合物[18]。关于酚类化合物的研究相对较少,其抑制机理到目前还不是很清楚,通常认为其毒性较大,可以造成细胞膜部分或整体的破坏,从而影响细胞生长和糖的利用[4]。另有研究表明,高浓度的香草醛会抑制翻译过程,影响蛋白质的合成[18]。
Yi等[19]分别选取4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草醛作为p-羟苯基化合物、丁香族化合物、愈创木酚族化合物的代表,研究3种化合物对Zymomonas mobilis ZM4生长及发酵产乙醇的影响,结果表明,在分别添加5 mmol/L的4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草醛的情况下,最大细胞密度依次降低了5倍、1.4倍和3.1倍,葡萄糖消耗和酒精生成分别延迟了12、16、24 h,酒精体积生产率由0.73分别降至0.24、0.70和0.61 g/L/h。以上3种化合物中,分子量最低的4-羟基苯甲醛的毒性最大;并体现了取代基位置对抑制作用的影响;实验中还发现3种化合物都可以被Zymomonas mobilis ZM4降解为相应的醇。这些结论与先前对于酵母的研究具有类似性[4],可为酚类化合物抑制机理的深入研究提供依据。
这些抑制剂的存在对乙醇发酵的影响,已成为木质纤维素乙醇生物加工过程的主要瓶颈之一。为减少抑制剂影响,可采取以下几种策略:(1)防止在预处理中形成抑制剂;(2)发酵前进行脱毒;(3)筛选耐受性微生物或对微生物进行耐受性改造等。
2 预处理方式及脱毒措施减少抑制剂浓度近些年来,围绕着减少抑制剂的产生,发展了多种预处理方法。研究发现,温和的热水预处理(未添加酸催化剂)[20]、瞬间弹射蒸汽爆破(ICSE)技术[21]、60Coγ辐照的方法[22],均在不同程度上降低了某些抑制剂的浓度。此外,研究人员通过在预处理过程中加入催化剂,或将两个或多个预处理技术结合使用有效减少了抑制剂的产生。Jacquet等[23]在水稻、甘蔗渣和芒草的蒸汽预处理过程中使用二氧化碳或二氧化硫等催化剂,有效降低了抑制剂的浓度。Zhu等[24]研究了用微波与NaOH和H2SO4协同处理芒草,与单一的预处理方法相比,不但使抑制剂浓度降低,还使糖的浓度升高,大大缩短了预处理的时间。
采用不同的预处理工艺可在源头上控制抑制剂的产生。但是,选用预处理方法时不仅要考虑产生的抑制剂浓度,更重要的是要综合考虑高纤维素和随后的高糖产量等预处理效果,以及技术、经济等因素,以满足工业需求。因此,实际选取的最适预处理方法有时无法满足低抑制剂浓度的要求。在积极探索降低抑制剂浓度的预处理方法的同时,发展合适的脱毒方法,是减少发酵抑制物的又一有效措施。
近几十年来,人们尝试了多种方法对木质纤维素水解液进行发酵前的脱毒处理,包括生物方法、物理方法、化学方法以及多种方法联用,脱毒方法各有优缺点,且不同的方法对各种不同抑制物的去除效果也有较大差异[25-26]。利用微生物脱毒的效果显著,Cao等[27]使用C. ligniaria NRRL30616对玉米秸秆水解液进行脱毒处理,去除了 > 95%的乙酸和 > 50%的糠醛、HMF以及酚类化合物。煤油霉菌Amorphotheca resinae ZN1[28]是目前比较理想的用于脱毒的微生物,能够快速降解乙酸、糠醛、HMF,且脱毒过程不使用任何耗水和耗能的操作[29],具有工业实用价值。脱毒虽然是减少抑制物的有效的方法,但是多数脱毒过程会造成糖的损失和生产成本的增加。目前,随着大量的微生物被发现具有“脱毒”的功能,人们将研究的重点放在了菌株上,选育那些能够对抑制物原位脱毒的高耐受性菌株,对生物质乙醇转化工业的发展有着很重要的实际应用价值。
3 耐受抑制剂的菌株的选育近些年来,针对耐受性微生物,尤其是对酵母菌在抑制剂存在下的响应及分子水平上的适应性进行了大量研究,已经获得了酵母细胞对抑制物响应的许多基础信息[30],这些为耐受性菌株的改造提供了依据。目前,人们已通过筛选、诱变、驯化、代谢工程改造等方法以及这些方法的联合应用,获得了一些较为理想的用于木质纤维素乙醇转化的菌种。
3.1 通过筛选、诱变获得耐性菌株从自然界中直接分离耐抑制剂菌株是一种经济实用的方法。在自然界的长期进化过程中,有些菌株体现出了在耐抑制剂能力方面的特性和稳定性。通过研究发现,S. cerevisiae ATCC 4124、S.cerevisiae TMB3000、S. cerevisiae KF-7等均表现出了较强的抑制物耐受性[31-32, 15]。Mattam等[33]从土壤中筛选出菌株Candida tropicalis MTCC 25057,不但有较强的抑制物耐受性,还具有在32-42℃产纤维素酶和木聚糖酶的能力,可用于糖化-发酵联合生物工艺(CBP)[34-35]中。此外,用木质纤维素水解液或是混合抑制物模拟水解液从自然界尤其是富含木质纤维素原料的地点有目的的进行筛选是一种更加快速、有效的方式[36]。
诱变筛选是微生物菌种改良常用的技术,一般可采取紫外线(UV)、X射线等物理诱变方法或利用烷化剂甲基磺酸乙酯(EMS)等化学诱变方法。研究表明,通过紫外线诱变得到的突变株,对抑制物的耐受性提高,发酵性能提高[37-39]。Srisuda等[40]对Scheffersomyces shehatae进行紫外照射,采用TTC方法初筛后,依次用杜汉发酵管、限氧条件培养筛选出突变株TTC79,对抑制剂的耐受性提高,且与野生菌株相比,木糖代谢增多,乙醇的生成增多,在对甘蔗渣水解液的发酵中,乙醇的得率、体积生产率及理论收率分别为0.46 g/g、0.20 g/L/h和90.61%,高于野生型的对应值0.20 g/g、0.04 g/L/h和39.20%。此外,研究证明诱变往往会带来菌株多种性能的提高或改变,不仅会提高其对抑制物的耐受性,而且有很大的概率会提高其对高糖、酒精以及高温的耐受性能。Kumari等[41]通过甲基磺酸乙酯、n-甲基-n-硝基-n-亚硝基胍、近和远紫外线照射依次连续对葡萄糖-木糖共发酵的混合酵母菌RPR39进行诱变,获得的突变体RPRT90不但对糠醛、乙酸等抑制剂的耐受性提高,对乙醇、高温等胁迫的耐受性也显著提高,发酵生成的乙醇量相对原始菌株明显提高。可见,诱变是改造菌种的有效方式,可通过不断的摸索尝试,开发新方法,得到优良的耐受抑制剂的菌株。
自然筛选和诱变筛选具有一定的随机性,但是方法简单易行,得到的这些菌株除了可以直接用于发酵外,也可作为菌种驯化或代谢工程技术改造的出发菌株。
3.2 通过进化工程驯化提高菌株的耐受性进化工程驯化是让细胞长期处于某一环境中,提高菌株对环境的适应力。在抑制剂存在的条件下,不断进行细胞传代筛选可逐渐富集并得到对抑制剂耐受性增强的菌株。目前,驯化手段已经成功的用于提高酵母对抑制物环境的耐受性。最初的研究集中在提高菌株对某种抑制剂的耐受性,近年来更多使用复合抑制剂环境或水解液环境对菌株进行长期驯化,使其能够在多种抑制物存在下生长和发酵产乙醇。Pereira等[42]在连续反应器中流加未脱毒的硬木亚硫酸盐水解液,使其浓度逐渐升高20%-60%(V/V)驯化Scheffersomyces stipitis,经过382代后,在含有60%未脱毒水解液的固体培养基上筛选出最先生长的10个菌株,为了保证它们的稳定性,用非选择性平板培养基连续转接十次,之后在含有60%未脱毒水解液的液体培养基中测试其发酵性能,从中筛选出优势菌株。Koppram等[43]用在12种抑制剂存在的情况下在摇瓶中进行重复批次培养,以及在云杉水解液中进行恒化培养两种方式驯化经过紫外诱变处理后的重组木糖代谢菌株Saccharomyces cerevisiae TMB3400,分别驯化了429代和97代,得到相应的菌株RK60-5、RKU90-3和KE1-17,它们在水解液中的生长及乙醇生成比原菌株均有显著提高。值得一提的是,重复批次驯化得到的菌株(RK60-5和RKU90-3)在厌氧条件下无法代谢木糖,而在恒化器中驯化的菌株KE1-17具有与原菌株TMB3400相似的木糖代谢速率,且对糠醛和HMF的转化速率分别增加了3.5倍和4倍。可见经不同形式的驯化后,菌株的发酵性能显示出较大的差异。初期的驯化研究主要是采用摇瓶的形式,其为进一步的驯化研究奠定了基础,但是由于摇瓶发酵的氧气、pH等条件不确定,因此,稳定的连续培养驯化是更为有效的形式。
在驯化过程中,微生物通过基因水平上的随机突变的积累不断适应环境的变化,其机理有待于进一步研究。Almario等[44]用玉米秸秆稀酸水解液驯化Saccharomyces cerevisiae,研究发现,有些驯化后的突变体反而对单个抑制剂的耐受性减弱,尽管它们对于组合抑制剂的耐受性是增强的。可见驯化过程中菌株对抑制剂适应性变化的复杂性。
近几年来,通过实时追踪进化过程(VERT)、利用代谢组学、转录组学、单基因敲除和微阵列分析等技术研究驯化后的菌株耐受抑制剂的分子机制,取得了一些研究成果,不但可用来解释菌株的耐受机制,同时也为代谢工程改造菌株提供了依据和目标[42-46]。
3.3 通过代谢工程手段提高菌株耐受性代谢工程作为菌体改造的手段,相比筛选、驯化等菌株改良方式,具有更加集中的定向性和针对性。目前,关于酿酒酵母对于单个抑制剂的响应研究已经比较成熟,在此研究的基础上,通过在酵母内超表达相应的基因,已经定向设计出了一些针对某种抑制剂的高耐受性菌株[47]。
近几年来,逐步开展了耐受菌株对于多抑制剂共存时的响应研究,Wang等[45]研究了耐受菌株对乙酸、糠醛、苯酚混合抑制物的响应,通过代谢组学分析及单基因敲除,表明驯化后的耐受性菌株的代谢活动增强,并确定了在多抑制剂耐受中起关键作用的基因。Thompson等[46]通过比较转录组学得出了在13种抑制剂同时存在下的52种可能与胁迫相应的基因,并通过荧光显微镜观察发现,在抑制剂的胁迫作用下,原始菌株的线粒体形态发生破坏,而驯化后的菌株基本没有被破坏,且呈现了线粒体基因的高表达,作者提出,线粒体及其相关基因对菌株抗抑制剂能力起着重要的作用,且可修复抑制剂引起的损伤,是将来的重点研究方向。Pereira等[48]考查了酿酒酵母在麦秸水解液中对抑制剂的应答,通过全基因组扫描,确定了200余种相关基因,且它们同时在维生素代谢、线粒体活动等生物学功能中起作用。这些研究成果均为代谢工程改造菌种提供了依据和作用靶标,同时,从以上研究中能够看出通过代谢工程改造菌株使其耐受多种抑制剂的复杂性。因此,有学者认为针对抑制剂的代谢工程改造在工业上并不实用,因为抑制剂种类、浓度范围很宽,不可能确定所有抑制剂转化和耐受的相关基因以及它们之间复杂的关系[49]。
此外,有报道提出通过代谢工程改造酿酒酵母,使其能够在胁迫下产生亚精胺,从而增强对乙酸和呋喃类化合物的耐受性[50]。由于有机酸对细胞膜组成和功能的影响,通过调控一个或多个与细胞膜生成有关的基因,可减轻其毒害作用[50]。针对高浓度抑制物对翻译过程的抑制,Ishida等[18]用ALD7作为启动子有效促进了ALD6的表达,研究表明以ALD7作为启动子可克服由香草醛、糠醛、HMF引起的mRNA翻译的抑制,同时也为培育优良的菌种提供了一种新的基因工程方法。通过多种代谢工程手段提高菌株对抑制物的耐受性具有很大的发展潜力,是近些年来的研究热点。
筛选、诱变、驯化、代谢工程改造等方法各有其优势。目前,开始联合使用几种方法来提高菌株的抑制剂耐受性。如进化工程驯化与基因组重排相结合,筛选、γ射线辐射诱变与驯化联用均有效提高了Saccharomyces cerevisiae的抑制剂耐受性[49, 51]。本实验室采用紫外诱变、驯化相结合的方法对工业酿酒酵母Sc4126[52]进行改造,筛选获得一株对复合抑制剂(2 g/L糠醛、5 g/L乙酸、1 g/L香草醛)耐受性有所提高的菌株Sc4126-1。
4 总结利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇具有深远的意义,预处理产生的抑制剂是限制其发展的因素之一。在木质纤维素乙醇生物加工过程中,要针对不同的体系并综合考虑后续的纤维素酶处理和发酵过程,探索最适的预处理方式、脱毒方法,以及菌株的改良方法等。此外,发酵过程中的控制也可以有效减少抑制物的毒害作用,如Zhu等[53]将SSCF过程应用于高固体物料量的发酵过程中发现,使用该策略可有效避免抑制剂对发酵菌株的毒害作用,郝学密等[54]在发酵过程中采用氧化还原电位(Oxidation potential,ORP)调控,提高了酿酒酵母细胞对抑制剂的耐受性。
在这些应对措施中,对微生物进行代谢工程改造目前被认为是克服抑制剂对乙醇发酵影响的最有前途的方法[55-56]。随着基因组学、蛋白质组学等系统生物学方法的应用,微生物耐受抑制剂的分子机制逐渐被揭示,并确定了若干与抑制剂耐受相关的基因[45-48],利用合成生物学方法[57-58]人工设计和构建耐受微生物是未来的研究方向。解决抑制剂对于乙醇发酵的影响这一主要技术瓶颈,木质纤维素大规模生产乙醇定会取得较大进展。
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