转录因子是植物应对各种逆境的重要调控手段，通过与目标基因启动子区的顺式作用元件结合，调控靶基因的转录水平[1]。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，其名称是矮牵牛(Petunia hybrida)的NAM基因、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ATAF1/2基因和CUC2基因的首字母缩写[2]。NAC转录因子典型的结构模型由两部分组成：存在于N端的高度保守的NAC结构域和存在于C端的高度多样的转录调控区[3]。N端的NAC结构域由150-160个氨基酸残基组成，分为A-E这5个亚结构域。其中，亚结构域C、D高度保守，含有核定位信号，与DNA结合[4]。C端的转录调控区由重复出现的简单氨基酸组成，并富含谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等，具有激活或抑制转录的功能[5]。
NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控，还在植物应对环境胁迫时发挥了重要的作用[6]。拟南芥ORE1(ANAC092)与叶绿体发育关键基因GLK1/2互作，加速了叶绿体退化，促使叶片衰老[7]。酵母双杂实验证实香蕉(Musa acuminata)MaNAC1/2与乙烯信号组件的MaEIL5蛋白互作，推测MaNAC1/2基因通过乙烯信号通路参与香蕉果实的成熟调控[8]。拟南芥nac019突变体对高温敏感，而过表达该基因增强了植物对高温的抗性[9]。RhNAC3通过ABA依赖型途径参与了月季(Rosa hybrida)对干旱胁迫的响应[10]。小麦(Triticum aestivum)的基因表达谱显示TaNAC2响应干旱、盐害、冷害和ABA处理，在拟南芥中过表达TaNAC2提高了植株对干旱、盐和冷胁迫的耐受力[11]。
青杄(Picea wilsonii Mast.)为松科(Pinaceae)云杉属(Picea)常绿乔木，是我国特有的木本针叶树种，对干旱等恶劣环境具有非常强的适应能力，是进行抗逆基因研究的理想树种。本文从转录组数据中获得PwNAC42基因的cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析，预测理化性质及其蛋白结构等。采用实时荧光定量PCR检测基因在青杄各组织中的表达量，以及在干旱、盐害、冷胁迫和脱落酸(Abscisic Acid，ABA)处理下的表达模式。以期为研究木本植物中NAC转录因子的功能提供理论基础，为林木遗传育种提供分子依据。
1 材料与方法 1.1 材料青杄球果、种子、花粉采集于中国科学院植物研究所和北京植物园，三年生青杄的根、茎和针叶用于组织特异性表达实验。青杄种子在4℃春化后，放置于湿润滤纸上，待其萌发后移植到营养土：蛭石：珍珠岩为2：1：1(V/V/V)的培养基质中培养。温室光周期为16 h日照，温度为21℃，相对湿度55%-65%，生长到8周的青杄幼苗用于逆境响应实验。植物材料采集后用液氮处理，保存于-80℃备用。
1.2 方法 1.2.1 青杄PwNAC42基因编码区的克隆青杄cDNA文库由Invitrogen(上海)公司利用Gateway技术构建[12]。以实验室前期构建的均一化cDNA文库为模板，设计引物NAC42-F和NAC42-R(表 1)扩增PwNAC42的编码区序列，胶回收后连接到pEASY-T1载体上，获得PwNAC42单克隆。
将PwNAC42的cDNA序列导入DNAMAN软件中，通过翻译功能获得其ORF序列及氨基酸序列。ProtParam在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)用于预测蛋白分子质量、等电点、分子式及不稳定指数。ProtScale工具(http://web.expasy.org/protscale/)用于分析蛋白亲/疏水性。NetPhos 3.1工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)用于预测蛋白可能存在的磷酸化位点。SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于预测蛋白是否存在信号肽结构域。TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)用于预测蛋白的跨膜区域。FoldUnfold工具(http://bioinfo.protres.ru/ogu/)用于预测蛋白无序化特征。GOR4在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)用于预测蛋白二级结构，SWISS-MODEL在线工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)用于预测蛋白三级结构。
通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST功能搜索PwNAC42氨基酸序列的同源序列，利用ClustalX软件进行多序列比对分析，并用MEGA5软件选择邻位相连法(Neighbour-joining)构建系统发育树(bootstap检测次数为1 000)。
1.2.3 组织特异性表达利用北京艾德莱(Aidlab)公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取青杄球果、种子、花粉、根、茎和针叶的RNA，通过天根生化科技(北京)有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录成单链cDNA。cDNA模版浓度调成一致之后通过天根公司的荧光定量PCR试剂盒(SYBR)在StepOnePlusTM Real-Time PCR System(ABI公司)上进行RT-qPCR实验，检测PwNAC42在不同组织中的相对表达量。用于荧光定量PCR的引物为NAC42-RT-F和NAC42-RT-R，以青杄EF1-α作为内参基因，序列见表 1[13]。试验设置3次重复。
1.2.4 逆境响应分析逆境响应试验的处理方法参考周燕妮等[14]，选取长势相对一致的八周大的青杄幼苗。幼苗置于4℃处理0、3、6、12 h；再置于吸水纸上处理0、3、6、12 h；用200 mmol/L NaCl溶液处理0、3、6、12 h；用100 μmol/L脱落酸处理0、3、6、12 h。对照组为正常生长的植株。试验设置3次重复，处理后的青杄幼苗液氮速冻，于-80℃备用。
2 结果 2.1 青杄PwNAC42全长cDNA的获得通过转录组数据获得PwNAC42的cDNA序列全长，通过DNAMAN软件推导其编码的蛋白序列。PwNAC42基因cDNA序列全长共1 749 bp，其中编码区1 140 bp，共编码379个氨基酸。在91 bp处为起始密码子ATG，1 228 bp处为终止密码子TGA，1 741 bp处为Poly(A)9尾巴(图 1)。
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| 图 1 PwNAC42全长cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列 |
用NCBI网站上的BLAST功能对PwNAC42蛋白进行功能域分析，结果(图 2-A)显示PwNAC42蛋白有典型NAM(No apical meristem)结构域。
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| 图 2 PwNAC42蛋白结构域及理化性质分析 A：蛋白结构域分析；B：蛋白疏水性分析；C：蛋白磷酸化位点分析；D：蛋白跨膜结构域分析；E：蛋白无序化分析 |
ProtParam预测结果显示，PwNAC42分子质量为42.92 kD，理论等电点为6.53，分子式为C1919H2934N522O582S9，其中丝氨酸(Ser)含量最高，为10.8%，其次为脯氨酸(Pro)，含量为9.0%，并带有负电残基(Asp+Glu)48个，带有正电氨基酸残基(Arg+ Lys)46个，预测其半衰期约为30 h，不稳定指数46.78，预测蛋白不稳定。
PwNAC42蛋白疏水性分析结果显示，76位精氨酸(Arg)分值最小，为-2.789，亲水性最强，41位缬氨酸(Val)分值最大，为1.978，亲水性最弱，预测蛋白为亲水性蛋白(图 2-B)。磷酸化位点预测结果显示，PwNAC42有31个丝氨酸磷酸化位点，有11个苏氨酸磷酸化位点，有5个酪氨酸磷酸化位点(图 2-C)。SignalP 4.1预测发现该蛋白没有信号肽结构域(结果未显示)。蛋白跨膜结构域预测结果显示，PwNAC42整条多肽链都位于细胞膜外，不存在跨膜结构域(图 2-D)。蛋白无序化特征预测结果显示，PwNAC42在1-12、76-87、168-229、295-318处的氨基酸处于无序化区域(图 2-E)。
2.2.3 蛋白质二级结构和三级结构PwNAC42蛋白的二级结构预测结果(图 3-A)发现，α-螺旋含量为16.89%，延伸链为12.14%，无β-转角结构，无规则卷曲结构含量达到70.98%。PwNAC42蛋白三级结构预测结果(图 3-B)显示，蛋白无规则卷曲结构较多。
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| 图 3 PwNAC42蛋白二级结构及三级结构分析 A：PwNAC42蛋白二级结构分析；B：蛋白三级结构分析 |
在NCBI网站上用BLAST功能对PwNAC42进行同源蛋白搜索，寻找到下列物种的同源蛋白：黑云杉(Picea mariana，PmNAC，AAC32123.1)、北美云杉(Picea sitchensis，PsNAC，ABK26029.1)、油棕(Elaeis guineensis，EgNAC，XP_010922868.1)、海枣(Phoenix dactylifera，PdNAC，XP_008792531.1)、凤梨(Ananas comosus，AcNAC，OAY70955.1)、石刁柏(Asparagus officinalis，AoNAC，XP_020254522.1)、莲(Nelumbo nucifera，NnNAC，XP_010257746.1)、水稻(Oryza sativa，OsNAC，BAA89798.1)、小果野蕉(Musa acuminata，MaNAC，XP_009394855.1)、小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris，PeNAC，XP_020578930.1)、铁皮石斛(Dendrobium catenatum，DcNAC，XP_020673301.1)、玉米(Zea mays，ZmNAC，ADK25055.1)、短花药野生稻(Oryza brachyantha，ObNAC，XP_015693359.1)、拟南芥(AtNAC，AT1G01720.1)。利用ClustalX工具进行多序列比对，发现PwNAC42与其它物种的NACs在N端相似性较高，在C端则仅与同为云杉属的黑云杉和北美云杉相似性较高(图 4-A)。用MEGA5邻接法构建系统进化树，结果(图 4-B)显示，PwNAC42与云杉属NACs聚为一类，拟南芥和其它植物则为另两类。
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| 图 4 PwNAC42蛋白多序列比对(A)及系统进化树分析(B) |
PwNAC42在各个组织器官中均有表达，但主要在球果中表达，球果中的表达量约为花粉中表达量的41倍(图 5)。PwNAC42对NaCl、干旱、4℃、ABA均有响应。200 mmol/L NaCl溶液处理下，PwNAC42表达量随着时间增加显著，在12 h时表达水平达到了对照组的88倍左右(图 6-A)。在干旱条件下，PwNAC42表达量变化显著，6 h前呈现上升的趋势，6 h和12 h的表达量则没有显著差异(图 6-B)。4℃处理下，PwNAC42表达量呈现上升的趋势，在处理12 h时基因的表达水平达到了对照组表达量的18倍(图 6-C)。ABA处理也显著提高了PwNAC42的表达量，表达量随时间持续上升，表达水平在12 h时约为对照组的14倍(图 6-D)。
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| 图 5 PwNAC42在青杄各组织中的表达量 不同小写字母代表各个组织中PwNAC42表达水平差异显著(P < 0.05) |
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| 图 6 PwNAC42在逆境处理下表达量的变化 不同小写字母代表各个处理时间之间PwNAC42表达水平差异显著(P < 0.05) |
NAC转录因子最早从矮牵牛中发现，被命名为NAM[15]，之后越来越多的NAC转录因子被分离鉴定出来。全基因组分析发现，在拟南芥、水稻、烟草(Nicotiana tabacum)、大豆(Glycine max)、杨树(Populus trichocarpa)和中国白菜(Brassica campestris)等植物中分别有至少117、151、152、152、163和188个NAC转录因子家族成员[16-17]。本试验从青杄中克隆得到PwNAC42基因，通过BLAST工具显示，PwNAC42的N端存在典型的NAM结构域。多序列比对发现，PwNAC42与其它物种的NACs在N端相似性较高，而C端序列仅与云杉属NACs的相似性较高，与其它草本、木本植物相似性较低(图 4)。从而推测PwNAC42的C端序列在进化上较为保守。
前人的研究表明，NAC转录因子参与了植物果实成熟的调控过程。香蕉中的MaNAC1/2通过与乙烯信号组件相互作用，可能参与了香蕉果实的成熟调控[8]。番茄(Solanum lycopersicum)SlNAC3基因在果实的绿熟期和破色期中表达量较高，而干涉该基因表达后，类胡萝卜素的合成受到抑制，果实成熟的进程明显延迟[18]。本研究的组织特异性表达试验发现，青杄PwNAC42主要在球果中表达，推测其可能与球果成熟有关，但具体调控植物果实成熟的途径仍有待研究。
以往的研究发现，NAC转录因子在模式植物拟南芥和小麦、水稻、玉米、番茄等作物类植物响应逆境胁迫中发挥了重要功能[9、11、19-21]。本研究结果显示，盐胁迫、冷胁迫及干旱胁迫处理后PwNAC42表达量随时间变化而明显上升(图 6)，推测其可能在植物响应这些逆境的过程中发挥了作用。ABA信号转导途径是植物响应逆境胁迫的重要途径之一，NAC转录因子既依赖于ABA途径发挥作用，也独立于ABA信号途径。Zhu等[21]研究了番茄中的SlNAC4基因，发现该基因的沉默能提高植物对盐和干旱的抗性，但基因的表达受到MeJA(Methyl Jasmonate)而不是ABA的诱导，从而推测SlNAC4可能通过不依赖ABA的途径参与植物对逆境的响应。前人对陆地棉(Gossypium hirsutum)中NACs进行了研究，发现GhNAC7响应乙烯、ABA、干旱、盐分、低温等多种处理，其启动子区存在ABREs(ABA response cis-element)元件，进而推断GhNAC7通过ABA信号通路参与了陆地棉对逆境的响应[22]。在本实验中，外源施加ABA时PwNAC42表达量显著上升，因此推测PwNAC42可能依赖于ABA信号通路响应环境胁迫，但具体的调控机制仍有待研究。
4 结论从青杄cDNA文库中克隆了一个NAC家族的转录因子PwNAC42。组织特异性表达结果表明PwNAC42主要在球果中表达。逆境响应实验结果发现，该基因响应多种非生物胁迫处理包括NaCl、干旱、低温及ABA，说明其参与了青杄对逆境胁迫的响应。
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