木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科热带和亚热带地区重要的薯类作物，具有高产、高淀粉和耐贫瘠等特点，在现代工业和农业中起着非常重要的作用。木薯具有发达的根系，可以忍受长达4-6个月的干旱胁迫[1]。然而，在这种长时间(或较为严重)的干旱胁迫条件下，木薯的生长和发育受到显著了的影响，最终导致其块根产量减少[2]。作为典型的热带块根作物，木薯主要种植在南北纬30°之间的热带和亚热带地区。木薯对温度非常敏感，低于14℃时木薯生长会明显变缓，低于10℃时木薯将停止生长。更为严重的是，在极端的低温天气下木薯块根产量会急剧下降甚至绝收[3]。因此，提高木薯抵御干旱和低温等胁迫的抗性，对减少木薯在不良生长环境下的产量损失具有重要指导意义。
脯氨酸是重要的渗透调节物质，在植物体内起着调节细胞渗透平衡、维持细胞结构稳定和清除活性氧等作用[4]。在干旱、低温、高盐等胁迫条件下，植物体内脯氨酸含量会显著增加[5-6]，其含量和植物的抗逆性呈正相关[7]。植物脯氨酸合成途径可以分为两种：鸟氨酸途径和谷氨酸途径。有趣地是，这两种途径的最后一步反应相同，均由吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)催化完成，可见P5CR是脯氨酸生物合成途径的关键酶，由其催化的反应对植物生长可能至关重要，例如在拟南芥中敲除P5CR后可引起植株胚胎致死[8]。此外，在植物中超表达P5CR后，转基因植株在胁迫条件下脯氨酸含量显著增加，其抗逆性显著增强[9]。
大多数植物中P5CR仅由1个基因编码，它们在进化过程中比较保守，属于看家基因(House-keeping genes)[10]。P5CR的表达在不同组织中存在显著差异。例如，拟南芥中AtP5CR在根中表达量最高，其次是果荚、花和叶，而茎中的表达量最低[11]。P5CR的表达还受到干旱、低温、盐和ABA等的诱导。例如，拟南芥AtP5CR的表达量受到低温、高温和盐胁迫的诱导[12-13]；黑麦草LpP5CR的表达受到盐、PEG(Polyethylene glycol)、低温和ABA(Ab-scisic acid)处理的诱导[14]；而小麦TaP5CR的表达则受到盐、PEG和ABA处理的诱导[9]。这些研究成果为在其他植物中挖掘和鉴定P5CR的功能奠定了重要基础。
迄今为止，在木薯中已经克隆了一个P5CR，其表达在转录水平受到渗透胁迫的调控[6]。然而，在木薯中是否还存在其他的P5CR，它们和其他植物中P5CR的进化关系如何以及它们是否参与了木薯干旱、低温等胁迫响应，仍不清楚。本研究拟采用生物信息学的方法从已完成基因组测序的植物中鉴定P5CR，并对其序列特征和进化模式进行分析；之后主要针对木薯MeP5CR，分析其在不同组织以及干旱、低温等胁迫条件下的表达模式，旨在为进一步研究MeP5CR在木薯非生物胁迫中的功能奠定基础，同时也为其他植物中P5CR的功能研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料试验所用木薯材料为主推广品种Ku50，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。
1.2 方法 1.2.1 材料种植与处理参照丁泽红等[15]方法进行木薯种植：将具有3-4个芽眼且粗细匀称的木薯茎段(长度约15 cm)扦插于塑料盆(高×上直径×下直径= 18.8 cm×18.5 cm×14.8 cm)中，每盆1个茎段。基质采用蛭石与营养土按照1﹕1的体积比进行混合。木薯种植约10 d后进行间苗，每盆保留1棵苗。
木薯种植60 d后，选取长势一致植株分别进行(1)干旱处理：采用20%的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，在处理0、3和24 h后，分别收集老叶、第一片完全展开叶、未展开叶和根的样品，-80℃保存待用；(2)低温处理：采用4℃进行低温胁迫处理，在0、6和24 h后分别收集第一片完全展开叶、未展开叶和根的样品，-80℃保存待用。
为考察MeP5CR在不同组织中的表达变化，收集正常种植条件下木薯Ku50的叶片、叶柄、茎、须根和储藏根的样本，进行qRT-PCR分析。
1.2.2 RNA提取与qRT-PCR用天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒提取木薯总RNA。用Fermentas公司反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，-20℃保存待用。用Primer 6.0设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表 1)。qRT-PCR在Mx 3005P荧光定量PCR仪(Stratagene，美国)上进行，每个样品3次生物学重复，按照2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量[6]。
以拟南芥[16]、水稻[17]中P5CR的蛋白质序列为参考，用BLASTP搜索Phytozome数据库获取其他物种的P5CR同源序列。在去除冗余序列之后，用NCBI-CDD数据库进行保守结构域分析，确保每条序列都含有P5CR保守结构域。之后，用ClustalX进行序列比对；用MEGA5.2构建Neighbor-Joining系统进化树；用ExPASy ProtParam分析蛋白质的分子量和等电点。
2 结果 2.1 P5CR在不同物种中的分布以拟南芥和水稻中P5CR为查询序列，搜索Phytozome数据库，在45个物种中共找到54条P5CR序列，其中苹果P5CR数目最多，为3个，其次是柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亚麻、大豆，为2个，在主要单子叶植物(如水稻、玉米、小米、高粱等)和双子叶植物(如拟南芥及其近缘种鼠耳芥等)中有且仅有1个P5CR(图 1和表 2)。木薯与杞柳、毛果杨亲缘关系较近，它们仅有1个P5CR。除此之外，在许多低等生物如团藻、莱菌衣藻、盐生杜氏藻、小立碗藓和泥炭藓中也只有1个P5CR(图 1)。
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| 图 1 P5CR基因在不同物种中的分布 |
序列特征分析表明，P5CR平均氨基酸长度为282.6，最大值为347，最小值为208；平均外显子数目为7.2，最大值为9，最小值为6(表 2)。P5CR的分子量和等电点在不同物种之间的差别不大。相比之下，P5CR长度的最大值为9 797 bp，最小值为1 174 bp，两者相差9倍之多(表 2)。可见，P5CR在基因长度上差别较大，且这种差异主要是由内含子长度上的差异造成的。
2.2 P5CR进化分析将54条P5CR氨基酸序列进行比对、聚类后发现，它们可以分成12个主要组群(图 2)。其中，木薯与巨桉中P5CR的亲缘关系较近，聚类在一起(图 2-K)。可以清楚的看到，各物种中P5CR的亲缘关系与物种之间的进化关系呈现很好的一致性：低等藻类和藓类植物(如团藻、莱菌衣藻、泥炭藓和小立碗藓等)都聚类在A组，单子叶植物(如水稻、高粱、玉米和二穗短柄草等)都聚类在B组，双子叶植物(如拟南芥、琴叶拟南芥和鼠耳芥等)都聚类在D组，豆科植物(如大豆、菜豆和蒺藜苜蓿等)都聚类在L组，且大多数植物中都只有1个P5CR(图 2)。不同组群之间P5CR长度的统计结果显示，除了个别组群中P5CR的长度要显著的低于或高于其他组群，如D组(双子叶植物)中P5CR长度最小(~1 600 bp)、F组(茄科植物)和J组(可可和雷蒙德氏棉)中P5CR长度最大(＞6 000 bp)，大多数组群中P5CR的长度都保持在4 000 bp左右，差异不显著(图 3)。结果表明，P5CR在各物种之间非常保守，且是单基因起源的。
在少数物种中P5CR仍发生了2-3次重复，并可以将它们归纳成3种进化模式。模式Ⅰ：种内进化模式，即只在两近缘物种中的某一物种发生重复。例如，大豆和菜豆都属于豆科植物，亲缘关系较近，大豆中有2个P5CR(GmP5CR1和GmP5CR2)，而菜豆中只有1个P5CR(PvP5CR)，且它们聚类在一起(图 2-L)；模式Ⅱ：种间进化模式，即在两近缘物种中均发生重复。例如，卷心菜和白菜型油菜都属于芸苔属植物，亲缘关系较近，卷心菜和白菜型油菜中均有2个P5CR，且卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2分别和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2聚类在一起(图 2-D)；模式Ⅲ：种间与种内进化模式共存。巴旦木和苹果亲缘关系较近，本研究发现巴旦木PpeP5CR1和苹果MdP5CR1、MdP5CR3聚类在一起(图 2-C)，而巴旦木PpeP5CR2和苹果MdP5CR2聚类在一起(图 2-H)。以上结果表明，P5CR呈现多样性的进化模式。
2.3 MeP5CR在不同组织中的表达情况采用qRT-PCR方法检测MeP5CR在木薯不同组织中的表达情况。结果(图 4)表明，MeP5CR在叶片、须根和储藏根中表达量最高，且三者之间的表达量无显著差异；MeP5CR在叶柄和茎中的表达量最低，仅是叶片中表达量的48%和51%。说明MeP5CR主要是在木薯叶片、须根和储藏根中起作用。
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| 图 4 MeP5CR在不同组织中的表达 数据用“均值±标准差”表示，不同小写字母表示不同组织之间差异显著(P < 0.05) |
采用qRT-PCR方法在木薯不同叶片(如第一片完全展开叶、未展开叶及老叶)和根中，分别检测MeP5CR对干旱(PEG模拟)和低温胁迫的响应情况。在PEG胁迫条件下，在老叶中MeP5CR呈现先不变后下降的变化趋势，在24 h其表达量显著下降约36%；在第一片完全展开叶MeP5CR呈现先下降后上升的变化趋势，在3 h和24 h其表达量分别下降20%和提高1.3倍；在未展开叶和根中，MeP5CR呈现持续下降的变化趋势，在24 h其表达量分别下降23%和9%(图 5-A)。
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| 图 5 MeP5CR对干旱和低温胁迫的响应 A：干旱处理；B：低温处理。BL：老叶；FEL：第一片完全展开叶；FL：未展开叶；RT：根。00、03、06、和24分别代表胁迫处理0、3、6和24 h。数据用“均值±标准差”表示，不同小写字母表示相同处理下不同时间点之间差异显著(P < 0.05) |
在低温胁迫条件下，在未展开叶中MeP5CR的表达量呈现先上升后下降的变化趋势，在6 h其表达量提高3.7倍，在24 h其表达量又回复到初始水平；在根中MeP5CR的表达量也呈现先上升后下降的变化趋势，在6 h和24 h其表达量分别提高1.9倍和下降59%；在第一片完全展开叶中，MeP5CR的表达量呈现持续上升的变化趋势，在6和24 h其表达量分别提高3.4倍和5.9倍(图 5-B)。
综上所述，MeP5CR在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫响应。
3 讨论P5CR属于看家基因，在大多数植物中有且仅有1个拷贝[10]。尽管目前已陆续从拟南芥、水稻、黑麦草、木薯等植物中克隆了P5CR[6, 14, 17]，但这些研究仅关注于少数几个物种的P5CR亲缘关系，无法全面系统地了解P5CR的进化历史。本研究采用生物信息学方法，从已经完成基因组测序的45个植物中共鉴定出54条P5CR序列，并考察了它们在不同植物中的分布情况(图 1)。结果表明，在主要农作物(水稻、玉米、小米、高粱)和模式植物拟南芥中都仅有1个P5CR，与前人研究结果一致[10]。在木薯中也只有1个P5CR成员。与前人报道不同的是，本研究发现至少在8种植物(包括苹果、柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亚麻、大豆)中存在2-3个P5CR(图 1)，暗示P5CR在这些植物中存在不一样的进化过程。序列特征分析表明，各植物中P5CR的氨基酸长度、分子量大小、和外显子数目相差不大，但基因长度的变化幅度非常大。进一步分析表明，基因长度的变化主要是由内含子长度的变化引起的，且这种变化与物种进化的关系非常密切(图 3)。
聚类分析表明，各物种中P5CR的亲缘关系与物种之间的进化关系呈现很好的一致性。而且，无论是在低等藻类藓类植物中，还是在高等单子叶和双子叶植物中，大多数物种有且仅有1个P5CR，与前人研究结果一致[10]。说明P5CR是单基因起源的，且在各物种之间非常保守。尽管如此，仍有少数物种中的P5CR发生了2-3次重复：这些重复或只发生在某一物种内部，如P5CR基因在大豆(GmP5CR1和GmP5CR2)中发生了一次重复，但在菜豆中没有发生重复；或发生在某两近缘物种分化之前，并在分化之后继续保留在两近缘物种中，如卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2；或以上2种情况同时发生，如巴旦木和苹果中的P5CR基因(图 2)：产生这种结果的最大可能性是，在巴旦木和苹果分化之前，P5CR基因发生一次重复，使得巴旦木和苹果中分别保留有2个P5CR基因(PpeP5CR1和PpeP5CR2，和MdP5CR1和MdP5CR2)；在巴旦木和苹果分化之后，巴旦木中的P5CR基因维持不变，而苹果中的P5CR基因再次发生一次重复(如MdP5CR1发生重复获得MdP5CR3)。这一推测从基因组结构分析上也得到了验证：PpeP5CR1和PpeP5CR2、MdP5CR1和MdP5CR2在染色体上分别成串联重复排列，且相互之间具有共线性。值得强调的是，本研究并没有发现在某一植物不存在P5CR，这可能是因为P5CR丢失后会引起植株致死[8]。以上结果比较系统地阐述了P5CR在植物中的进化方式，为进一步研究其在不同物种中的功能奠定基础。
P5CR在不同植物中非常保守，暗示它们可能具有相同的功能，在基因表达水平上通常表现为相同的表达模式。拟南芥中AtP5CR在茎中的表达量最低，而在根中表达量最高[11]；木薯中MeP5CR也表现出相同的表达模式，支持“根是脯氨酸生物合成的主要场所，而茎则主要是负责脯氨酸的运输”的结论[11]。研究表明，P5CR的表达还受到干旱、低温、盐和ABA等处理的诱导。例如，在低温胁迫条件下，AtP5CR的表达量上升了约3倍[12]；在盐、PEG、低温和ABA处理条件下，LpP5CR的表达量被诱导了约2-4倍[14]。本研究发现，在低温胁迫条件下，MeP5CR的表达量在未展开叶、第一片完全展开叶、和根中分别上升了3.7倍、5.9倍和1.9倍；然而，在干旱条件下，MeP5CR的表达量却被显著的抑制了，暗示不同植物中P5CR对同一胁迫的响应可能是不一样的。本研究结果将有助于深入了解P5CR在不同植物中的进化模式，同时也为进一步研究MeP5CR在木薯干旱和低温等逆境胁迫中的功能奠定基础。
4 结论在不同植物中，P5CR内含子长度差别较大，而在氨基酸长度、外显子数目、等电点和分子量方面差别不大。在大多数植物(如木薯)中，P5CR有且仅有1个拷贝，在进化上比较保守；而在某些植物(如大豆、苹果等)中有2-3个拷贝，并将其进化方式归纳为3种模式。木薯MeP5CR在叶片、须根和储藏根中表达量最高，而在叶柄和茎中的表达量最低。此外，MeP5CR表达量受到低温胁迫诱导、但被干旱胁迫抑制。
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