大豆(Glycine max L.)是重要的油料和粮食作物，市场需求巨大。目前大豆产量的制约因素主要是气候变化和病害^[1]。大豆疫霉(Phytophthora sojae)引发的大豆疫病，又称大豆疫霉根茎腐病，是大豆生产中的一种毁灭性病害，每年在全球范围内造成10-20亿美元的经济损失^[2]。生产中控制大豆疫病的主要方法是利用植物抗性进行抗病品种选育。为实现这一目标，在分子层面对大豆疫霉与大豆的相互作用进行深入的研究具有重要的理论价值和实践意义^[3]。目前对于大豆疫霉与大豆互作的研究主要集中在病原菌效应分子毒性作用、寄主抗性及两者之间的分子互作机制方面^[4]，本文重点剖析目前大豆抗性产生和丧失的原因，探讨了效应分子的反识别分子策略，以及利用疫霉菌保守分子靶标设计开发新型抗病资源的可能性。

1 大豆疫霉与大豆疫病

由疫霉菌引起的大豆疫病于20世纪50年代在北美被发现，并因此确立了一个病原菌新种即大豆疫霉^[5]。大豆疫霉是一类卵菌病原微生物，自然条件下仅能侵染大豆和羽扇豆^{[2, 6]}。大豆疫霉可为害大豆的整个生长期，包括出土前的烂种、幼苗烂苗及猝死、成株期根茎腐以及侵染叶片造成的黄化枯萎等^[3]。大豆疫霉是一种兼性病原菌，在亲和互作条件下侵染4 h后，侵入的菌丝不断在寄主细胞间扩展，并形成多个吸器，获取寄主的营养和水分^[2]。侵染15 h后，感病寄主开始出现坏疽症状，说明大豆疫霉已经由寄生阶段向死体营养阶段转变^[2]。

由于大豆疫霉侵染速度快，病程发展迅速，往往来不及施药进行化学防治，因此大豆疫病是大豆生产上造成损失最严重，也是最难防治的病害之一^[7]。大豆疫霉属于卵菌而不是真菌，对很多杀菌剂不敏感，极难通过化学农药对其进行有效防治^[2]。而且大豆疫霉及其代表的卵菌病原菌具有非常丰富的遗传多样性，在田间变异极其迅速，往往在很短的时间内即可使化学农药丧失效果^[8-9]。目前生产上防治大豆疫病主要依赖抗病育种^[4]。大豆与大豆疫霉的互作符合基因对基因假说，因此培育和种植抗病品种是最经济、安全、有效的防控策略。

大豆对大豆疫霉的小种专化性抗性是由抗病(Resistance to P.sojae，Rps)基因介导的免疫反应限制大豆疫霉的侵染来实现的，迄今已鉴定并定名了13个Rps基因^[2]。然而，田间大豆疫霉变异迅速，加之大多数品种抗源单一，在推广8-15年后就会丧失原有的抗性^[2]。以美国俄亥俄州为例，在1972年推广抗病品种之前田间只发现1号生理小种，而随后7年内就鉴定出7个新生理小种，到1998年则增加至55个，同时有78.9%的田块鉴定出有克服抗病基因的疫霉菌株^[10]。目前所有已知抗病基因均被大豆疫霉菌“击败”，因此迫切需要拓宽新的抗病资源。

同时在田间还存在耐病性的品种，即大豆品种可以忍受一定程度的发病而造成有限的产量损失。耐病性由多基因控制，也称部分抗性或数量抗性，对所有大豆疫霉的致病型均能够产生作用，抑制病斑的扩展，在田间一般产量损失较少^[10]。随着田间抗病品种的推广，病原菌的毒力型在选择压力下快速变异，造成质量抗性的使用寿命缩短，因此具有广谱抗性的耐病品种选育也越来越受到关注。

2 大豆与大豆疫霉相互识别的分子基础

识别(Recognition)是植物-病原菌直接互作的最初阶段^[11]。大豆与大豆疫霉的相互识别，一方面是病原菌通过识别寄主的化学、电位及物理特征，开启并控制侵染的过程；另一方面则是寄主通过识别病原菌相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和效应分子(Effectors)，触发一系列的免疫防卫反应^[11-14]。

2.1 大豆疫霉特异性识别大豆

研究显示，大豆疫霉游动孢子能被大豆或鹰嘴豆的根部分泌物如大豆异黄酮所吸引，这些分泌物即使被稀释到500倍，仍然对游动孢子具有极强的吸引力^[15-16]。Zhang等^[17-18]的研究表明，大豆疫霉G蛋白α亚基PsGPA1及下游的互作蛋白PsHint1共同参与调控游动孢子对异黄酮物质的趋化性，并且还控制附着胞形成、活性氧清除、效应分子的转录及激发子类似基因的表达等一系列侵染过程。对大豆疫霉的一个G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)蛋白PsGPR11的研究发现，其对游动孢子的游动时间、休止孢萌发及游动孢子致病性等都有显著影响^[19]。而对另外一个偶联磷脂酰肌醇磷酸激酶PIPK的大豆疫霉GPCR蛋白PsGK4的研究也发现，其控制着游动孢子的休止及休止孢萌发^[20]。这说明大豆疫霉的游动孢子在不断的通过感知外界特别是寄主化学物质的变化而调控自身的发育过程，包括休止和萌发。

游动孢子形成休止孢和随后休止孢的萌发受到一系列环境因素的影响，如水流的扰动、大豆异黄酮刺激、根部物理表面以及钙离子的或其它营养元素的接触^[21]。休止孢萌发后产生伸长的芽管，寻找到表皮细胞垂周壁之间的缝隙后开始侵入^[22]。至于芽管是如何精确地找到侵入位点还没有明确的研究结果，有一种可能性就是在垂周壁之间的结合处存在相对高浓度的某种化学物质而使芽管具有向触性^[23]。一旦寻找到这样一个侵入点，芽管就开始穿透寄主细胞壁，并在寄主细胞间形成侵染菌丝，通过菌丝的变态结构吸器获取水分和营养，进入病程快速发展的阶段^{[2, 23]}。至此，大豆疫霉将按照固定的程序转录调控各种效应分子，协同控制对寄主的侵染过程^[13]。

2.2 大豆特异性识别大豆疫霉

大豆与大豆疫霉的互作符合基因对基因假说，因此在育种上经常利用这种小种水平的专化抗性来培育抗病品种。无论在亲和互作还是在非亲和互作条件下，大豆疫霉均可完成从游动孢子到形成吸器的侵入过程，但在抗病品种上不能进一步扩展^[24]。植物防卫反应开启的前提条件就是在侵染过程中识别到入侵的病原微生物，识别病原微生物也是植物先天免疫反应中最基本和最重要的组成部分^[11]。现代分子植物病理学家提出了植物免疫系统理论，认为抗病植株通过识别PAMP或者效应分子，开启两种不同层面的抗病反应，即病原相关分子模式PAMP触发的免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应子effector触发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI)^[12]。

2.2.1 大豆识别大豆疫霉的PAMP触发PTI

病原相关分子模式PAMP是一类保守的病原分子，通常不能够通过进化而退化或去除^[12]。PAMP触发的免疫反应主要体现在植物的基础抗性和非寄主抗性上。植物利用类似受体的蛋白激酶(Receptor-like proteins or -kinases，RLP/Ks)来感知病原微生物保守的PAMP分子^[12]。疫霉菌的PAMP包括了很多蛋白、多糖及小分子物质，往往可以激发寄主和非寄主植物的防卫反应，因此也被称作激发子(Elicitor)^[25]。例如，在疫霉菌中存在着一类保守的小分子甾醇结合蛋白，这些蛋白只有98个氨基酸大小，但却是疫霉菌从植物中获取甾醇所必须的。这些疫霉菌特有的小蛋白能够激发模式植物烟草的防卫反应，并诱导产生对细菌、真菌和病毒的抗性，因此被称作Elicitins^[26]。

另外，大豆疫霉的细胞壁成分β-1，3-葡聚糖也可以成功触发大豆的防卫反应^{[25, 27]}。当休止孢萌发或遭遇到大豆外泌葡聚糖酶的时候，大豆疫霉细胞壁降解产生的碎片也会激发植物PTI^[28]。研究发现大豆疫霉细胞壁上的一个糖蛋白C端13个氨基酸(VWNQPVRGFKVYE，PEP-13)的短肽段即可成功触发植物PTI^[29]。疫霉菌细胞壁上的另一个糖蛋白(Cellulose-binding elicitor lectin，CBEL)也可以触发烟草的PTI，并诱导植物产生系统获得抗性^[30]。

除了这些来源于病原微生物本身的PAMPs，当病原微生物侵染植物时，破坏或降解植物组织而产生的一些代谢成分也能够被植物识别，触发植物的免疫反应^[31]。对于可以主动侵入寄主的真菌及卵菌来说，在侵染过程中会释放大量的细胞壁降解酶，来破坏寄主的细胞壁。一方面，这些酶类降解植物细胞壁产生的碎片或产物能触发寄主免疫反应；另一方面，这些酶蛋白本身也可作为病原相关的分子模式直接被植物识别^[31-33]。例如，大豆疫霉的外泌木葡聚糖酶PsXEG1，可以强烈的触发植物细胞死亡^[34]。研究表明，大豆对PsXEG1毒性的抑制依赖于GmGIP1(Glucanase inhibitor protein 1)蛋白与其直接互作^[14]。有趣的是，大豆疫霉为了逃避寄主对PsXEG1的识别，还分泌出一个与GmGIP1结合能力更强的蛋白PsXLP1(XEG1-like protein 1)来作为诱饵(Decoy)，保护PsXEG1的毒性作用^{[14, 35]}。虽然PsXLP1与PsXEG1在序列上高度同源，但从植物免疫系统的角度出发，可以将PsXEG1定义为大豆疫霉的PAMP，而将PsXLP1划分到胞外效应分子范畴。

2.2.2 大豆识别大豆疫霉的效应分子触发ETI

大豆疫霉基因组中有大量具有丰富多样性的毒性相关基因家族^{[6, 36]}。这些基因家族编码了蛋白水解酶、水解酶抑制蛋白、毒素蛋白等胞外效应分子以及两类庞大的胞内RXLR和Crinklers(CRN)效应分子家族^{[6, 36-37]}。

无论是在植物胞内还是胞外起作用的效应分子，都是具有功能模块的分泌蛋白，蛋白N端具有信号肽，而C端则是毒性功能域^[37]。而胞内效应分子一般还具有一个寄主锚定序列，负责将效应分子转运到植物细胞内。例如，RXLR效应分子家族就是以其寄主锚定序列精氨酸R-X-亮氨酸L-精氨酸R(X代表任意氨基酸)来命名的，这类效应分子家族的成员则多达350个^{[2, 37]}。

目前克隆的大豆疫霉无毒基因均属于RXLR效应分子家族^{[36, 38-47]}，说明大豆抗病蛋白是在胞内对这些无毒蛋白产生识别的。然而有趣的是，尽管研究者通过酵母双杂交、Co-IP等技术在持续寻找这些无毒蛋白的互作蛋白，却没能筛选到与之直接互作的抗病R蛋白。甚至已经被克隆的抗病蛋白Rps1k也已经验证不能直接和无毒蛋白Avr1k互作^[39]。这说明大豆对大豆疫霉RXLR效应分子的识别机制非常复杂，并非简单的通过直接互作来实现。

研究还发现，一些RXLR效应分子如Avh18、Avh25、Avh105、Avh147、Avh238和Avh241等都能被植物识别并引起大豆细胞的过敏性死亡^[13]。

Crinklers因其能引起烟草细胞皱缩坏死(Crinkle)而被命名，其蛋白也具有保守的寄主锚定序列LXLFLAK，预测其具有将CRN效应分子转运至植物细胞的功能。大豆疫霉中有200多个CRN效应分子，一些Crinkler能够被植物识别导致细胞死亡，如PsCRN63^[48]。

3 大豆疫霉逃避寄主识别的分子策略 3.1 大豆疫霉抑制寄主的PTI反应

由于PAMP分子的保守特性，疫霉菌和其它病原菌都采用泌出效应分子来干扰或者破坏植物的PTI反应，达到成功侵染的目的^[12]。研究表明，在大豆疫霉侵染前期上调表达的一系列效应分子具有抑制寄主PTI的功能^{[13, 34]}。例如，大豆疫霉RXLR效应分子Avh238，在侵染前12 h内上调了约120倍。研究发现Avh238能够抑制疫霉菌Elicitin(INF1)在烟草细胞中触发的超敏反应(Hypersensitive response，HR)，同时对PTI信号通路上的关键激酶NPK1和MKK1触发的HR反应具有抑制作用^[13]。而大豆疫霉PsXEG1作为一类保守的PAMP分子，其引发的植物免疫反应也能够被多个RXLR效应分子所抑制，如Avh52、Avh62、Avh94和Avh109等都能够抑制PsXEG1触发的活性氧迸发、HR反应以及PTI相关基因的表达^[34]。

3.2 大豆疫霉无毒基因的反识别机制

目前克隆的大豆疫霉无毒基因都属于RXLR效应分子家族，包括Avr1a、Avr1b、Avr1c、Avr1d、Avr1k、Avr3a/5、Avr3b、Avr3c和Avr4/6^{[36, 38-47]}。目前识别这些无毒基因并触发免疫反应的抗病基因在田间已经陆续被“攻克”。因此，了解无毒基因逃避寄主识别的分子机制，是了解品种抗性丧失、针对性开发新抗病资源的急切需求。

Avr1b是第一个被克隆的疫霉菌无毒基因，在无毒菌株P7064中有着高量的mRNA积累，而在毒性菌株P7373和P7074中则因为启动子区插入了一个3 kb的片段而丧失了mRNA的积累，在毒性菌株P6497中则完全沉默^[49]。类似基因沉默的策略在无毒基因Avr1a、Avr1c、Avr3a/5和Avr4/6中也存在^{[40, 46-47, 50]}。Avr1b在毒性菌株中还存在着多种序列多态性，如毒性菌株P7076的C末端存在着21个氨基酸的变异，如此剧烈的序列突变也使Avr1b^P7076成功逃避了抗病蛋白的识别^[51]。类似采用序列变异来逃避识别的还有无毒基因Avr3a/5、Avr3b和Avr3c^{[42-43, 45]}。对于无毒基因Avr1d来说，尽管其蛋白C末端也存在着剧烈的变异，但是没有对抗病蛋白Rps1d的识别造成影响^[41]。通过对无毒菌株和有毒菌株的基因组进行比较发现，在毒性菌株中缺失了Avr1d的序列，而采取类似的基因剔除策略的无毒基因还有Avr1a和Avr1c^{[40-41, 47]}。有的无毒基因如Avr3b和Avr1k则因为序列的插入和变异造成移码突变而使蛋白的翻译提前终止，却恰好逃避了无毒蛋白对其的识别^{[39, 43-44]}。

大豆疫霉无毒基因的这种遗传多样性，也反映出大豆抗病品种对其施加的选择压力。由于大豆疫霉进化速度快，某些突变造成的无毒性丧失会迅速形成新的优势小种，使得品种中由Rps基因控制的质量抗性失效变得感病，造成严重的损失。

3.3 大豆疫霉效应分子协同互作抑制ETI

对大豆疫霉4个菌株的基因组及转录组研究发现，RXLR效应分子的转录模式可以分为诱导表达和持续转录两种模型，并面临着不同的进化选择压力^[13]。对于诱导表达的效应分子来说，因为表达量较高通常会面临巨大的选择压力。如大豆疫霉的RXLR效应分子Avh238，在侵染前期剧烈上调表达，大豆、烟草和一些茄科作物都能够识别Avh238并产生ETI^[52]。然而在大豆疫霉中还存在多个效应分子能够抑制Avh238被植物识别所产生的ETI反应^[13]。这些抑制ETI的效应分子不仅包括了一些低表达量的RXLR效应分子，还包括了一些CRN效应分子^[48]。

对于无毒基因和抗病基因互作所触发的过敏性坏死反应，也能够被一些效应分子所抑制，如Avh172、Avh6都能够抑制致病疫霉无毒蛋白Avr3a和马铃薯抗病蛋白R3a之间的互作^[13]。而Avr1d也能够抑制Avr1b和Rps1b之间的互作^[41]。说明在大豆疫霉和大豆的协同进化过程中，大豆疫霉不断产生新的效应分子来抑制寄主的防卫反应，而对于大豆来说，由于自身进化和育种周期的限制，往往无法及时应对大豆疫霉进化产生的优势生理小种。

4 总结与展望

大豆疫霉造成的大豆疫病已经严重威胁到大豆产业的发展。在我国主要大豆产区，大豆疫病也呈现逐渐加重的趋势。在农业面源污染严重、倡导绿色农业的大环境下，推广使用抗病品种控制大豆疫病是减施农药、实现农药零增长的迫切要求。然而大豆疫霉在田间变异迅速，已经陆续攻克了所有目前已知的抗病基因。因此针对性的挖掘新型的抗病基因，拓宽抗病育种资源，通过传统育种技术与分子育种技术结合实现精准育种将是未来大豆抗病育种的发展方向。

从目前大豆疫霉和大豆的互作研究发现，寄主主要是通过识别保守的PAMP或者RXLR效应分子开启免疫防卫反应。因此，这两类大豆疫霉特有的病原分子是开发大豆新型抗病育种靶标的主要研究对象。

PAMP是非常保守、不易通过进化而除去的一类病原分子。目前研究者也在着力挖掘新的大豆疫霉PAMP，针对性地设计病害防控策略^{[11, 34]}。如大豆疫霉的木葡聚糖酶PsXEG1就是一类新发现的PAMP^[34]。研究发现这一类木葡聚糖酶家族蛋白在多种大豆根部病原菌如镰刀菌中都有保守序列存在，如果能找到植物中识别XEG1并诱导植物抗病性的免疫组件，并通过基因编辑使之更加特异地与大豆疫霉和镰刀菌的XEG1蛋白结合，则会极大地增强大豆抗根部病害能力，有助于构建持久抗病性作物。

而对于进化较快的胞内效应分子，研究者也在基于其进化和毒性的机制而开发新的抗病靶标^[53]。对于数量众多的RXLR效应分子来说，既然能够主动通过基因沉默或删除突变来逃避寄主的识别，说明其功能在一定程度上是冗余的^[54]。而对于一些具有时空表达特性和重要功能的效应分子如Avh238、Avh172来说，又是病原菌在侵染过程中不可或缺的一部分^[13]。因此，为了避免效应分子的快速进化而造成的抗性丢失，在选择RXLR效应分子作为靶标筛选抗源的时候要遵循3个基本原则:病原菌毒力所必需、在不同菌株中保守存在以及面临较低的选择压力。结合目前的基因组和转录组数据，可以将筛选的范围缩小至几十个甚至十几个RXLR效应分子的规模。然后再对这些效应分子进行基因沉默或者敲除等遗传操作，对转化子的毒力进行评估，即可筛选到合适的抗源靶标。根据俄勒冈州立大学基因组研究及生物计算中心的报道，有3个效应分子Avh16、Avh180和Avh240基本符合这个筛选规则。而在栽培大豆和野生大豆的多个株系中也获得了相应的抗源(未发表数据)。这些新颖的抗源材料，将有助于新一代抗病品种的育种开发和推广。

随着分子生物学技术的发展，农作物育种也正在从传统育种走向精确育种。针对病原菌的侵染特点，精准设计抗病策略，精确设计育种靶标，通过分子育种实现各类优良基因的聚合，培育“理想品种”，将是未来农作物育种的发展方向。

长期以来对大豆抗性的研究一直集中在抗病基因的鉴定上，育种和生产上也一直通过Rps基因介导的质量抗性对大豆疫病进行防治^[55]。然而大豆疫霉种群在抗性品种的选择压力下会迅速变异，毒力结构呈现越来越复杂的趋势，导致单基因控制的质量抗性丧失效果。为构筑大豆对疫霉菌的持久抗病性，在深入了解大豆疫霉逃避寄主免疫机制的前提下，统筹聚合新挖掘的单基因抗性和优质数量抗性资源，最终通过精准育种才能获得广谱抗病的理想大豆品种。