由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花黄萎病是我国棉花生产上的重要病害，严重影响棉花的产量，成为棉花可持续生产的主要障碍之一^[1]。棉花黄萎病是一种土传性的维管束真菌病害，防治难度较大。选育和种植抗性品种是目前防治棉花黄萎病的主要措施，但是存在选育周期长及抗性不稳定的缺点。市场上也存在抗棉花黄萎病的农药或混配杀菌剂，虽然可以在一定程度上有效防治棉花黄萎病，但是化学农药的大量使用会污染环境并危害人类健康。此外，化学农药的使用也会增强病菌的抗药性，并对田间其它有益微生物产生抑制作用^[2]。为缓解农药残留带来的环境污染，满足无公害农产品生产的需要，生物农药的研究与开发已成为我国病虫害防治研究的热点之一^[3]。目前国内已有少量利用中药或植物提取物来防治棉花黄萎病的报道^[4-6]，主要集中在抑制菌丝生长、毒素分泌、孢子萌发和孢子产量等方面的研究。

本研究采用56种中药提取物，通过生长速率测定、茎秆切片观察及防治效果分析，初步确定部分中药提取物既可直接有效抑制大丽轮枝菌菌丝生长又能提高棉花黄萎病的防治效果，旨为进一步研发防治棉花黄萎病的新型生物农药提供线索和依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试中药提取物

供试中药材来自于云南省药材公司，药材品名和对应植物部位均为《中华人民共和国药典》2015版规定药材。取样0.5-1.0 kg药材，按药材特性和比重，用1-2 L的玻璃层析柱进行分离。洗脱溶剂体积为柱床体积的3倍，并将溶剂提取段按馏分顺序分为前段、中段和后段，各为1倍柱床体积。洗脱液经旋转蒸发器浓缩待用。

1.1.2 植物病原菌及植物材料

棉花黄萎病病原菌(大丽轮枝菌)为新疆农垦科学院分子农业技术育种中心鉴定的132T菌株。供试棉花品种为TM-1。

1.2 方法 1.2.1 中药提取物抑菌活性测定

采用生长速率法测定中药提取物对菌丝的生长抑制作用。将56种中药提取物用甲醇的水溶液溶解或悬浮成悬浊液，按比例加至PDA平板，使其终浓度分别为1 g/L、10 g/L和20 g/L 3个梯度的质量浓度。以添加水或等量百分比的甲醇水溶液的PDA培养基平板为对照。

将液态培养的大丽轮枝菌过滤并离心收集孢子，制成浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬浮液。吸取5 μL孢子溶液接种于PDA培养基中央，于28℃暗培养7 d。每个处理重复2次。采用十字交叉法测定菌落直径，并计算抑菌率。

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100。

1.2.2 中药提取物对棉花黄萎病防治效果调查

中药提取物用DMSO溶解，再用0.1%的吐温-80℃溶液稀释到3 g/L质量浓度。选取二叶一心期棉苗12株，将3 g/L的中药提取物溶液喷雾到棉苗叶片表面，至叶面全部喷湿。叶面喷施5 mmol/L水杨酸作为阳性对照^[7]，喷施含DMSO的0.1%土温-80作为阴性对照。中药提取物喷施后第3天进行棉苗蘸根接菌，孢子悬浮液浓度为5×10⁶个/mL。接菌2周后进行病情指数统计及防治效果分析。上述实验重复3次。发病程度划分为六级:1级(级值为0):植株健康，叶片无发病症状; 2级(级值为1):子叶发病或脱落; 3级(级值为2):1片真叶发病或脱落; 4级(级值为3):2片真叶发病或脱落; 5级(级值为4):3片真叶发病或脱落; 6级(级值为5):4片以上真叶发病或脱落以及整株萎蔫或顶心枯死。计算公式分别为:

病情指数＝∑(各级植株数×对应级值)/(植株总数×最高级值);

防治效果＝[(负对照病情指数-处理病情指数)/负对照病情指数]×100%。

2 结果 2.1 中药提取物对大丽轮枝菌的抑制活性筛选

采用生长速率法，对56种提取物在质量浓度分别为1、10和20 g/L下进行抑菌作用测定。如表 1所示，在1 g/L浓度下抑菌率达到50%的中药提取物有3种，分别为红花木莲氯仿段(50%，4号)，华盖木石油醚部分(57.1%，42号)和黄苞大戟正丁醇部位(53.6%，46号)。在10 g/L浓度下抑菌率达到50%以上的有26种，其中5种提取物的抑菌率达到了100%，分别为24、45、46、47和56号。在20 g/L浓度下抑菌率达到100%的提取物有18种，主要集中于五味子、铁箍散、华盖木、黄苞大戟、中平树、大果大戟、尾叶血桐、栽秧花和盾叶木等植物提取物中。其中以五味子最为突出，铁箍散和黄苞大戟次之。

2.2 中药提取物对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制作用

测定抑菌率时发现，在不同提取物不同浓度下，PDA培养基上大丽轮枝菌的菌丝生长均受到不同程度的影响(图 1)，可归纳为以下5种类型:(1)在1 g/L浓度下已经能够明显抑制菌生长，但随着浓度的提高抑菌活性变化并不大(如4号); (2)在1 g/L浓度下抑菌作用明显，但在10 g/L浓度下抑菌率达到100%(如46号); (3)在1 g/L浓度下抑菌作用较弱，但在10 g/L浓度下抑菌率达到100%(如24号); (4)浓度增加到20 g/L时表现出良好的抑菌效果(如7号、37号、49号、51号和54号); (5)在所有浓度下都没有明显抑菌效果，菌丝生长正常(如48号)。

2.3 中药提取物对棉花黄萎病的防治效果鉴定

从2.2中分类的5种类型中，随机选取了13种中药提取物对其防治效果进行进一步鉴定。用3 g/L中药提取物处理棉花植株，统计棉花黄萎病病情指数。由于不同批次实验条件的差异，病情指数不能直接用于比较，因此以每一批次的阴性对照病情指数为基准计算防治效果进行比较评价。实验中发现部分中药提取物对棉花本身存在一定的毒害作用，处理后植株表现出非病态的伤害表型，因此对其结果不做统计。如表 2所示，在3 g/L的中药提取物浓度下，2号、3号、12号和13号提取物防治效果较好且重复性良好，表明这些提取物对棉花黄萎病有明显的防治效果。而其它提取物的防治效果较差(有的甚至为负值)或重复性差，说明这些提取物虽然抑菌活性强，但对黄萎病的防治效果并不明显。而黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段(13号)提取物的抑菌率在10 g/L和20 g/L浓度下分别为71.4%和100%，明显高于黑龙江产五味子氯仿:丙酮=10:1段(16号)和红花木莲氯仿:丙酮=40:1段(3号)提取物(表 1)。这说明黑龙江产五味子的氯仿:丙酮=3:2段提取物不仅可以有效地抑制大丽轮枝菌的菌丝生长，而且可以提高棉花黄萎病的防治效果。

2.4 黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段提取物对棉花黄萎病的抑制作用

为进一步揭示黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段提取物对棉花黄萎病的抑制作用，采用质量浓度为3 g/L的提取物处理二叶一心期棉花幼苗，并在接菌后2周进行棉花茎秆切片观察。如图 2-A所示，在对照植株中，大丽轮枝菌侵染导致明显的维管束褐化。而在提取物处理的植株茎秆中，由病原菌引起的棉花维管束褐变程度得到有效缓解。观察整体植株发现，提取物处理可以明显缓解黄萎病引起的落叶症状(图 2-B)。以上结果表明，黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段提取物可能通过抑制病菌侵染维管束来提高棉花对于黄萎病的抗性作用。

3 讨论 3.1 中药提取物对大丽轮枝菌的菌丝生长有强烈的抑制作用

已有报道称部分中药提取物可以有效抑制大丽轮枝菌的菌丝生长，并且对马铃薯晚疫病、果蔬致腐真菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌等具有较好的抑制效果^[8-10]。本实验中发现26种中药提取物对大丽轮枝菌有不同程度的抑制效果，其中五味子氯仿:丙酮的不同比例提取段均具有良好的抑菌效果，在质量浓度为10 g/L时抑菌率即可达到50%以上，而黑龙江产五味子(又称北五味子)效果最好。铁箍散属于五味子科五味子属植物，该植物以根及叶入药，可用于治疗风湿麻木、跌打损伤、胃痛和脉管炎等疾病^[11]。在本实验中，铁箍散的乙酸乙酯部位和氯仿:丙酮=1:1段的两种不同提取物对大丽轮枝菌菌丝生长有较明显的抑制作用。质量浓度为10 g/L时，抑菌率分别为78.6%和82.1%。黄苞大戟作为一种植物药材，主要用于肾炎水肿、腹胀、便秘、疟疾、风湿和黄疸等疾病治疗^[12]。杨大松等^[13]对黄苞大戟的化学成分进行研究后发现，其主要含有二萜、三萜和甾体等成分。本实验结果证明，黄苞大戟的乙酸乙酯和正丁醇部位的中药提取物在10g/L的浓度下，对大丽轮枝菌的抑菌率即可达到100%。这为黄苞大戟作为植物源提取物的抗病机理的研究提供了实验依据。

3.2 同一种中药提取物中可能存在多种对大丽轮枝菌有抑制作用的活性成分

本研究中，在中药提取物质量浓度为10 g/L时，辽宁产五味子氯仿:丙酮=3:2段、辽宁产五味子氯仿:丙酮=1:1段和辽宁产五味子氯仿:丙酮=9:1后段对大丽轮枝菌的菌丝生长抑制率分别为82.1%、78.1%和64.3%。黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段和黑龙江产五味子氯仿:丙酮=10:1段的菌丝生长抑制率分别为71.4%和57.1%。表明在同一植物中存在多种对大丽轮枝菌有活性抑制的成分，而且同一种中药的不同产地也会影响抑菌效果。

3.3 黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段提取物对棉花黄萎病有较好的防治效果

实验中有26种中药提取物对大丽轮枝菌的菌丝生长表现出良好的抑制作用，但是在进行病情指数和防治效果测定中发现，其对大丽轮枝菌的菌丝生长抑制作用与防治效果并不一致。辽宁产五味子氯仿:丙酮=3:2段在10 g/L质量浓度下菌丝生长抑制率为82.1%，而防治效果为-109%，说明该提取物虽然可以有效抑制大丽轮枝菌的菌丝生长，但是在黄萎病防治效果方面较差。而黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段在10 g/L质量浓度下菌丝生长抑制率为71.4%，平均防治效果为68.5%。表明该提取物不仅可以有效抑制大丽轮枝菌的菌丝生长，而且对棉花黄萎病有较好的防治效果。造成这种防治效果不同的原因或许是由于不同产地的五味子药效成分的差异^[14]，如南、北五味子其实不是同一种植物。

大丽轮枝菌侵染植物根部后，在适宜的环境下开始侵染维管束，随着病原菌的不断积累和扩展，感病植株开始出现一系列发病症状，包括萎蔫、褪绿、黄化、组织坏死、生长迟缓和维管束褐化^[15-18]。通常认为维管束变色说明大丽轮枝菌已经侵入植株，产生落叶症状的植株维管束褐化程度更高^[19-20]。通过茎切片观察发现，质量浓度为3 g/L的黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段可以有效抑制黄萎病引起的维管束褐化，并且落叶症状得到明显抑制。说明该提取物可以诱导植株产生抗黄萎病效果。本实验结果为研究和开发防治棉花黄萎病的新型生物农药提供了线索和依据。

4 结论

依据抑菌率、病情指数和防治效果的测定结果，黑龙江产五味子氯仿:丙酮=3:2段中药提取物，不仅可以有效抑制大丽轮枝菌的菌丝生长，而且可以诱导植物产生对黄萎病的抗性作用。