2. 内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021
2. School of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021
DbpA是依赖ATP的3'-5'RNA解旋酶，分子量为49.188 kD，主要在核糖体50S亚基形成的晚期发挥作用[1-2]。DbpA有一个DEAD盒，这是依赖RNA的ATP酶/解旋酶的特征[3]。DbpA特异地与23S rRNA的92号发夹结合，并表现出依赖RNA的ATP酶（ATPase）活性，水解一分子ATP可以解开8 bp的双链RNA[4]。除了大肠杆菌外，dbpA基因也存在于许多其他细菌中，这表明DbpA可能在某些情况下，比如缺失其他某一个核糖体成熟因子时，对核糖体的组装至关重要[5]。研究发现R331A点突变的DbpA缺失了其ATPase活性后，引起45S（50S核糖体亚基的前体）不完整颗粒的聚集，45S不完整颗粒可以激活野生型DbpA的ATP酶活性来完成50S核糖体的组装[2]。如果细菌内也缺乏野生型DbpA蛋白，那么过度表达R331A点突变的DbpA会导致各种核糖体颗粒的累积，但最终可以转化为有功能的50S大亚基[6]。
dbpA作为核糖体成熟因子，促进50S大亚基的组装，但它对大肠杆菌DNA复制起始过程的影响还没有报道。本研究通过观察dbpA缺失突变体（ΔdbpA）的DNA复制式样、倍增时间、细胞大小等表型变化来探讨dbpA基因对大肠杆菌DNA复制起始的影响，并探讨其作用机制。
大肠杆菌的细胞周期分为B期、C期和D期，并且也受到精细的调控。与真核细胞不同的是，大肠杆菌可以在上一次细胞周期还未完成时，开始下一次的细胞周期，使大肠杆菌的DNA在复制完成之前可以启动新一轮的DNA复制，所以大肠杆菌细胞内可以有多条染色体。大肠杆菌的染色体DNA复制起始于复制原点oriC，主要参与蛋白有DnaA、DnaB和DnaC等。DnaA蛋白是复制起始蛋白，特异地与oriC位点结合，然后DnaC蛋白协助DnaB蛋白（解旋酶）进入起始位点，逐渐形成复制引发体（Primosome）并开始复制。由于细胞内DnaA蛋白的数量和浓度与复制起始的发生率呈正比关系[7]。因此，我们检测ΔdbpA细胞内总蛋白和DnaA蛋白的量，并与野生型细胞比较，探究作为核糖体成熟因子的DbpA是否通过影响核糖体的组装或功能状态影响细胞内蛋白质的合成，改变细胞内总蛋白，包括DnaA蛋白的含量，从而影响DNA复制起始的机理。
DbpA也可能通过与DNA复制起始相关蛋白DnaA、DnaB或DnaC相互作用影响细菌DNA复制起始，因此我们采用温度敏感实验来验证它们之间是否有相互作用。dnaA46、dnaB252和dnaC2都是DNA复制起始缺陷的温度敏感突变体，它们在30℃时可以生长，但在42℃时无法生长[8-10]。我们分别将dnaA46、dnaB252和dnaC2的等位基因通过P1转导ΔdbpA构建双突变体，通过观察双突变体在30℃、37℃和42℃的生长情况，即温度敏感性的改变，来探讨DbpA是否与DnaA、DnaB或DnaC蛋白有相互作用。
细菌的细胞大小受多种因素的影响，如培养基的营养条件、pH和离子浓度，以及细胞内部环境等。我们通过测量ΔdbpA突变体的细胞大小，探讨dbpA基因是否影响细菌的细胞大小。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株野生型大肠杆菌BW25113由本实验室保存。∆dbpA菌株由Baba提供，它是BW25113的dbpA基因通过同源重组被卡那霉素（kan）基因替换而构建[11]。
1.1.2 试剂与仪器BCA试剂盒购自Pierce公司，Western blotting用的鼠DnaA单克隆一抗和山羊抗鼠IgG-HRP多克隆二抗购自全式金公司，Hoechst33258 DNA染色液购自MedChemExpress公司。蔡司荧光显微镜Axio Imager A2购自Carl Zeiss公司，BD LSRFortessa流式细胞仪购自BD公司。
1.1.3 培养基和条件细菌的培养基为LB或ABTGcasa（AB基础培养基添加10 μg/mL维生素B1、0.2%的葡萄糖、0.5%的Casamino Acids）[12]，LB的营养高于ABTGcasa培养基，培养温度为37℃。进行细菌选择时添加终浓度为50 μg/mL的卡那霉素（Kan）和30 μg/mL的氯霉素（Cap）。
1.2 方法 1.2.1 ∆dbpA菌株的鉴定PCR验证dbpA基因是否删除及kan基因是否插入。引物由上海生工生物工程公司合成。dbpA基因的上游和下游引物分别为：5'-GATGACCACGAGAATAGATTGTG-3'；5'-GATACACAACGTTGCCATTTCTG-3'。PCR模板为野生型BW25113和∆dbpA菌株，扩增条件为：94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。kan基因的上游和下游引物分别为：5'-TGCTCGACGTTGTCACTGAAG-3'；5'-CACCATGATATTCGGCAAGCAG-3'。扩增条件为：94℃变性45 s，53℃退火30 s，72℃延伸120 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。
1.2.2 计算细菌的倍增时间过夜复苏的细菌按1：5 000比例接种至LB或ABTGcasa培养基中，检测和记录细菌在对数生长阶段从OD600（LB）或OD450（ABTGcasa）为0.05-0.5时的吸光度值。吸光度值先进行Log2计算，以得数作为横坐标，间隔时间作为纵坐标绘制线性关系图，最后计算出细胞倍增时间。实验重复3次，计算平均值和标准差。
1.2.3 测量细胞大小在LB或ABTGcasa培养基中的细菌以指数形式生长至OD600/450= 0.15时取1 mL菌液，离心收集菌体，先用TE缓冲液洗涤一次，然后用70%的乙醇固定。使用蔡司显微镜观察细胞，测量并记录100个以上细胞长轴的长度，取平均值并计算标准差。
1.2.4 流式细胞技术分析LB或ABTGcasa培养基中对数生长期的细胞，在OD600或OD450= 0.15取1 mL菌液，加入终浓度为10 μg/mL的先锋霉素（CPX）和300 μg/mL的利福平（RFP）处理3-5个细胞周期。先锋霉素可抑制细胞分裂；利福平通过抑制DNA复制起始所需的转录而阻止新的DNA复制的启动，但允许已经开始的并正在进行的复制完成[13-14]。所以药物处理后的细胞其染色体数目为整数，并代表添加药物时细胞内的复制原点数目[13]。药物处理后的细胞固定在70%乙醇中。使用流式细胞仪检测时，细胞经Hoechst33258 DNA染色液染色30 min，然后使用流式细胞仪进行分析。
1.2.5 温度敏感实验温度敏感突变体dnaA46（Ts）∷tet、dnaB52（Ts）∷tet和dnaC2（Ts）∷tet的等位基因通过P1转导至ΔdbpA突变体构建ΔdbpA dnaA46、ΔdbpA dnaB252和ΔdbpA dnaC2共3个双突变体[15]。涂板并过夜培养后，从ΔdbpA、DnaA46、DnaB252、DnaC2单突变体和构建的3个双突变体琼脂平板上分别挑取8个单菌落，每个单菌落分别涂布在3个LB琼脂平板上，3个琼脂平板分别置于30℃、37℃和42℃的培养箱中过夜培养，观察并记录每个突变体的8个单菌落在每种温度下生长的数量。
1.2.6 测定单个细胞的总蛋白ABTGcasa培养基中的细菌生长至OD450= 0.15时，取9 mL菌液，4℃ 12 000 r/min离心2 min收集菌体，用1 mL TE缓冲液洗涤一次，再用200 μL含有1% SDS和甘油的TE缓冲液重悬，煮沸5 min。使用BCA比色法测定9 mL菌液的总蛋白量[16]。为了检测某一体积菌液中细胞的数量，即菌体密度，再取10 μL菌液用培养液稀释104和105倍，然后涂布在含有相应抗生素的LB琼脂平板上，在37℃过夜培养至出现单菌落。计数单菌落的数量，计算菌体密度并计算出9 mL菌液中细菌数量。使用9 mL菌液中细菌细胞内的蛋白量除以9 mL菌液中细菌数量计算出每个细胞内的总蛋白质含量。实验重复3次，计算平均值和标准差。
1.2.7 测定单个细胞的DnaA蛋白上面提到的细胞提取液还使用Western blot来测定单个细菌内DnaA蛋白的含量。先设定每种菌株细胞内的总蛋白质的量相等，然后根据计算出的单个细胞内的总蛋白质含量，计算每种细胞提取液的使用量。样品使用12.5%的凝胶进行SDS-PAGE后，经半干式印迹将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，先后使用鼠DnaA的单克隆抗体（一抗）和山羊抗鼠的IgG-HRP（二抗）与膜孵育，接着进行显色和显影，根据条带颜色深浅确定DnaA蛋白的量[17]。实验重复3次，计算平均值和标准差。
2 结果 2.1 ∆dbpA菌株的鉴定dbpA基因PCR扩增的电泳结果（图 1）显示野生型BW25113菌株在约1 200 bp处出现条带，与扩增的dbpA基因片段长度（1 181 bp）相仿；而∆dbpA菌株未扩增出dbpA基因条带，说明∆dbpA菌株中的dbpA基因缺失。kan基因PCR扩增的电泳结果（图 2）显示∆dbpA菌株在约350 bp处出现条带，与扩增的kan基因片段长度（356 bp）相仿；而野生型BW25113菌株未扩增出kan基因条带，说明kan基因插入∆dbpA菌株中，并替换了dbpA基因，即Baba提供的∆dbpA菌株构建成功。
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| 图 1 PCR鉴定ΔdbpA菌株的dbpA基因是否删除 M：分子量标准；1：野生型BW25113；2：ΔdbpA |
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| 图 2 PCR鉴定ΔdbpA菌株的kan基因是否插入 M：分子量标准；1：野生型BW25113；2：ΔdbpA |
流式细胞技术检测结果（图 3，表 1）显示，在ABTGcasa培养基中，野生型BW25113细菌有2、4或8个染色体复制原点，细胞数目所占比例分别为10%、63%和17%，平均复制原点数目（AO）为4.4，倍增时间（Doubling time，Dt）是33 min。ΔdbpA含有2、4或8个染色体复制原点的细胞比例分别为18%、62%和10%，A.O.减少到4.2，倍增时间延长至35 min。在LB培养基中，野生型细胞有4、8或16个染色体复制原点，细胞所占比例分别为1%、58%和29%，A.O.是9.4，倍增时间是21 min。而ΔdbpA含有4、8或16个染色体复制原点的细胞比例分别为6%、66%和14%，A.O.减少到9.0，倍增时间延长至25 min。表明缺失dbpA基因使细菌DNA复制起始出现轻度延迟，生长速度也轻度减慢，并且培养基的营养越高，减慢也越多。
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| 图 3 缺失dbpA基因导致细菌DNA复制起始发生轻度延迟 |
为了探讨dbpA基因是否影响细胞大小，我们使用显微镜测量野生型BW25113、ΔdbpA在ABTGcasa和LB培养基中的细胞大小。在ABTGcasa培养基中，野生型BW25113、ΔdbpA细胞的平均长度分别为2.69 μm和2.62 μm（图 4和表 2）；在LB培养基中的平均长度分别为3.87 μm和3.49 μm（图 4和表 2），即分别减小3%和10%。上述结果表明缺失dbpA基因导致使细胞体积轻度减少，并且培养基的营养越高，减小程度也越大。
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| 图 4 dbpA基因缺失导致细菌体积轻度减小 |
为了研究DbpA蛋白对DNA复制起始的影响是否通过与复制起始相关蛋白DnaA、DnaB或DnaC相互作用而导致的，我们使用温度敏感突变体dnaA46（Ts）、dnaB252（Ts）和dnaC2（Ts）构建ΔdbpA dnaA46、ΔdbpA dnaB252和ΔdbpA dnaC2共3种双突变体。我们发现dnaA46、dnaB252和dnaC2每种温度敏感突变体的8个单菌落在30℃时都能生长，37℃时绝大多数能生长，而42℃时都不能生长。ΔdbpA突变体的8个单菌落在30℃、37℃和42℃时都可以生长。3种双突变体的8个单菌落在30℃时都可以生长，37℃时绝大多数能生长，但42℃时都不能增长，即双突变体的dnaA46、dnaB252和dnaC2的温度敏感性都没有改变。表明DbpA影响DNA复制起始不是通过与DnaA、DnaB或DnaC蛋白相互作用导致的（表 3）。
DnaA蛋白是DNA复制的起始蛋白，并且细胞内DnaA蛋白的数量与染色体DNA复制的起始发生频率呈正相关。dbpA基因可能通过改变细胞内DnaA的数量影响细菌复制的起始。为了检测这个可能性，我们比较ΔdbpA和野生型BW25113单个细胞内的总蛋白和DnaA蛋白的含量。结果发现与较野生型细胞相比，在ABTGcasa培养基中，ΔdbpA单个细胞内的总蛋白和DnaA蛋白含量分别减少了8%和6%、（图 5-A）；而在LB培养基中，分别减少17%和18%（图 5-B）。表明删除dbpA基因使细胞内的总蛋白和DnaA蛋白的量都轻度下降。并且培养基的营养越高，下降程度也越大。
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| 图 5 缺失dbpA基因降低ABTGcasa（A）和LB（B）培养基中单个细胞的总蛋白 |
大肠杆菌核糖体的组装是非常快速和高效的，且有多种装配途径，在2-3 min内（37℃）就能完成有功能的50S核糖体大亚基的组装[18]。大肠杆菌有5种DEAD蛋白，分别是CsdA、DbpA、RhlB、RhlE和SrmB，它们作用的底物都是RNA。DbpA作为依赖ATP的RNA解旋酶，特异地与23S rRNA结合，参与50S大亚基的装配，而它特异结合的23S rRNA的92号发夹还参与核糖体肽基转移酶中心（Peptidyltransferase center，PTC）的构成[2]。
对于dbpA是否影响细胞表型，不同的实验得出的结果也有很大差别。Iost等和Peil等[19-20]发现dbpA删除突变体的生长速度和核糖体轮廓在37℃和低温20℃或25℃时都没有变化。可能的原因：（1）突变或删除导致细菌缺失有功能的DbpA后，可以由其他核糖体成熟因子完成50S亚基组装所需的RNA异构化步骤。（2）在核糖体组装过程中缺少DbpA的作用，虽然出现了错误组装的中间粒子（45S），并累积到某一程度时，细菌通过其他机制纠正错误组装而形成有功能的50S大亚基。
Elles等[21]发现dbpA在R331A的定点突变导致其解旋酶活性和ATP酶活性降低；细菌还表现出明显的生长缓慢和冷敏感的表型。她们分别将含有野生型、K53A和R331A点突变dbpA基因的重组质粒转入TunerTM（DE3）pLacI RecA-菌株后，发现转入K53A和R331A点突变dbpA重组质粒的菌株生长速度在37℃时比野生型慢；在22℃低温时，它们的倍增时间分别为113 min、134 min和251 min；即R331A点突变的倍增时间在37℃是野生型的1.6倍，在22℃时是2.2倍，并且还发现细菌从生长缓慢期到对数生长期的用时也较长。说明dbpA突变使细菌在37℃和低温22℃时的生长速度都减慢。可能原因：（1）DpbA作为核糖体成熟因子参与50S大亚基的装配和成熟，缺失DpbA的功能导致45S颗粒聚集，50S核糖体无法形成或形成速度减慢，细胞内有功能的核糖体数量减少，降低翻译效率。（2）缺失DpbA的功能导致细胞内形成错误组装的、无功能的核糖体，降低翻译活性。（3）DbpA不仅与50S核糖体亚基组装有关，还与翻译活性有关，因为与它结合的23S核糖体的92号发夹还参与肽基转移酶中心（PTC）的组成，并且成熟核糖体的92号发夹被埋藏在PTC内。缺失DpbA的功能可能影响PTC的形成，进而影响翻译过程的进行。
本实验结果与Elles等[21]的结果相同，即与野生型BW25113比较，ΔdhpA的倍增时间在ABTGcasa培养基中增加6%，在LB培养基中增加19%左右。表明dbpA缺失的突变体在两种培养基中的生长速度均减慢，且培养基营养越高，生长速度减慢越多。出现这种现象的原因可能是培养基的营养越高，细菌生长速度越快，蛋白质的合成速度也越快，需要的核糖体也越多。但dbpA的缺失导致核糖体无法组装、组装速度慢及组装的核糖体无功能等原因，使细胞内有功能的核糖体数量下降，翻译活性降低，导致细胞内蛋白质合成减少。此外，缺失dpbA还可能影响PTC的形成，影响翻译过程，并导致细胞内蛋白质合成减少。以上因素引起细胞内总蛋白量降低，包括DnaA蛋白，并导致细菌代谢、生长和繁殖速度减慢，出现DNA复制起始延迟、倍增时间延长、细胞体积减小等表型变化。
4 结论dbpA影响大肠杆菌染色体复制的起始，缺失dbpA导致细菌出现DNA复制的延迟启动，生长速度的减慢及细胞体积的减小等变化，并且培养基的营养越高，变化程度也越大。主要原因可能是dbpA的缺失导致核糖体组装缺陷及无法形成，降低了细菌蛋白质的合成，包括DnaA蛋白，出现DNA复制延迟等表型变化。
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