单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性致病菌，该菌在自然界分布广泛，易对熟肉制品、乳制品、海产品和蔬菜等食品造成污染。摄入被Lm污染的食品可引起李斯特菌病(Listeriosis)的爆发和流行^[1]。老人、孕妇、新生儿以及免疫力低下者是李斯特菌病的易感人群，临床症状主要表现为败血症、脑膜炎、孕妇流产等^[2]。李斯特菌病在全球范围内的发病率较低，但是其致死率却高达25.9%^[3]，严重威胁人类的健康。为了防止食品被致病菌污染，食品企业通常使用消毒剂来抑制或杀灭食品加工环境中的微生物。苯扎氯铵(Benzalkonium chloride，BC)属于季铵盐类消毒剂，被广泛应用于食品工业领域。BC的长期使用可能会促使耐药菌株的出现，影响其消毒效果。

许多文献报道，从食品加工环境和市售食品中分离的Lm菌株对BC敏感性下降^[4-6]。目前研究者普遍认为外排泵是介导Lm对BC耐受的主要机制。外排泵属于膜转运蛋白，在细菌中广泛存在。除了参与细胞的正常物质运输和代谢，外排泵还能够去除细菌细胞和胞膜中的有害物质，帮助细菌抵御外界不良环境的影响^[7]。研究报道，一些外排泵可将抗生素、消毒剂、重金属等作为底物排出菌体外使细菌产生耐药性^[8]。我们先前的研究发现，主要易化子超家族(Major facilitator superfamily，MFS)外排泵MdrL在Lm对BC耐受中起作用。根据Lm全基因组序列可知，ladR基因反向位于mdrL外排泵基因的上游，编码的LadR蛋白由176个氨基酸分子组成，属于PadR转录负调控蛋白家族。Huillet等^[9]推测，mdrL基因的启动子区域可能存在调控蛋白LadR的结合位点，但这一推测并没有被进一步证实。本研究以Lm标准菌株EGD-e为研究对象，利用同源重组技术^[10]构建ladR基因缺失菌株ΔladR，通过实时荧光定量PCR(Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR)、凝胶阻滞试验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)等调查LadR蛋白对外排泵MdrL的调控作用及调控方式。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒

Lm标准菌株EGD-e由华中师范大学罗勤教授惠赠；穿梭质粒pMAD和表达载体pET32a由本实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.1.2 培养基及主要试剂

脑心浸液培养基(Brain Heart Infusion，BHI)，购自北京陆桥生物技术有限公司；苯扎氯铵，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和质粒小提试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶，购自美国Thermo Fisher；Taq DNA聚合酶和dNTP，购自大连宝生物工程有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5×)，购自碧云天生物技术研究所；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 仪器与设备

DH360型电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡器，金坛天竟实验仪器厂；TGL-16B型离心机，上海安亭科学仪器厂；ETC811型基因扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；LightCycler^@96实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche；UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝胶成像分析系统、Gene PulserXcell^TM电转仪，美国Bio-Rad。

1.2 方法 1.2.1 ladR基因缺失突变株的构建与分子鉴定

以EGD-e基因组DNA为模板，分别用1408-1/1408-2和1408-3/1408-4两对引物扩增ladR基因的上下游同源臂，引物序列见表 1。利用重叠延伸PCR(Splicing by Overlap Extension，SOE-PCR)技术^[11]融合上下游同源臂，融合片段经切胶回收后与穿梭载体pMAD分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ进行同步双酶切。酶切产物经纯化后进行连接反应，将构建好的重组质粒pMAD-ΔladR转化至大肠杆菌DH5α中，将阳性转化株送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序。

采用青霉素G法制备EGD-e感受态细胞^[12]。将测序正确的重组质粒pMAD-ΔladR与EGD-e感受态细胞混匀，电击后立刻加入500 μL BHI培养基于30℃培养3 h。将菌液均匀涂布于含红霉素(5 μg/mL)、和X-gal的BHI平板上，30℃培养48 h。挑取蓝色单菌落于含红霉素(5 μg/mL)的BHI液体培养基，39℃培养24 h。稀释菌液选择合适梯度的稀释液涂布于含红霉素(5 μg/mL)和X-gal的BHI平板上，39℃培养48 h。挑取蓝色单菌落于BHI液体培养基，30℃培养24 h。将菌液转接至新鲜的BHI，39℃培养。稀释菌液选择合适梯度的稀释液涂布于含X-gal的BHI平板上，39℃培养48 h。挑取白色单菌落用引物1408-1和1408-4进行PCR扩增检测缺失条带，最终获得ΔladR突变株。

1.2.2 mdrL基因转录水平检测

将野生株EGD-e和突变株ΔladR分别接种至BHI中(各6管)，37℃振荡培养至OD_{600 nm}≈0.6。将菌株平均分为两组，第一组为不加任何药物(作为对照组)，第二组为加入BC(2 μg/mL)，37℃继续培养30 min。立即加入10%的反应终止液(苯酚：无水乙醇=1：9)^[13]，冰上放置10 min。

按照细菌RNA提取试剂盒的使用说明提取细菌总RNA，测定RNA的浓度和纯度后用于后续试验。利用cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。根据GenBank的基因序列设计靶基因mdrL和参照基因16S rRNA的引物(表2)。以cDNA作为模板，使用RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒进行qRT-PCR。采用ΔΔC_T法^[14]进行目的基因表达量的分析。

1.2.3 ladR基因的克隆

以EGD-e的基因组DNA作为扩增模板，用引物ladR-q1和ladR-q2(表 1)扩增ladR全基因序列。ladR扩增产物与表达载体pET32a分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行同步双酶切，酶切后的产物经纯化后进行连接反应，将构建好的重组表达载体pET32a-ladR转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性转化株送至北京博迈德公司测序。

1.2.4 LadR蛋白的表达与纯化

将LadR蛋白表达菌株接种于5 mL含Amp(100 μg/mL)的LB液体培养基，37℃过夜培养。过夜培养物按1：100分别接种至50 mL含Amp(100 μg/mL)的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD_{600 nm}≈0.6。将菌液分两组，一组不做任何处理，另一组加入终浓度为0.5 mmol/L^[15]的IPTG，37℃继续培养8 h。离心(4 000×g，5 min)收集细胞。按照His标签蛋白纯化试剂盒的步骤提取纯化重组蛋白His₆-LadR。取10 μL纯化蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)^[16]。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白His₆-LadR的浓度。

1.2.5 凝胶阻滞试验

利用引物pmdrL-F/pmdrL-R扩增mdrL的启动子区域，同时随机挑选一段编码区DNA(recA)作为阴性对照。将纯化后的DNA(200 ng)与纯化后的重组蛋白His₆-LadR在EMSA/Gel-Shift结合缓冲液中混合，室温放置20 min。利用6%非变性PAGE电泳进行结合活性检测^[17]。

2 结果 2.1 ladR基因缺失菌株的构建与分子鉴定

用引物1408-1/1408-2扩增得到ladR基因上游同源臂480 bp，用引物1408-3/1408-4扩增ladR下游同源臂168 bp。通过SOE-PCR得到648 bp的上、下游同源臂融合片段ΔladR，条带均与预期结果一致(图 1-A)。融合片段ΔladR与穿梭质粒pMAD连接获得重组质粒pMAD-ΔladR。双酶切验证结果如图 1-B。

测序正确的重组质粒pMAD-ΔladR电转至EGD-e感受态。筛选得到的阳性菌株用检测引物1408-1/1408-4只能扩增出648 bp的片段(图 1-C)。测序结果表明已成功缺失ladR基因，获得ΔladR突变株。

2.2 mdrL基因转录水平分析

由图 2可明显看出，与野生株相比，突变株ΔladR的mdrL基因的转录水平提高约51倍。BC胁迫下，野生株EGD-e的mdrL基因转录水平提高约1.6倍，突变株ΔladR的mdrL基因的转录水平约1.4倍。该结果表明LadR对mdrL基因有负调控作用。

2.3 ladR基因的克隆

以EGD-e基因组DNA为模板扩增得到长度为525 bp的ladR全基因片段(图 3)；构建得到的重组质粒pET32a-ladR经双酶切验证及测序，验证结果一致表明已成功获得表达菌BL21(DE3)-ladR。

2.4 LadR蛋白的表达及纯化

IPTG诱导后，表达宿主菌在35 kD附近出现一条明显的蛋白条带，与预期的蛋白分子量大小(36.5 kD)十分相近(图 4)，表明目的蛋白在宿主菌已得到成功表达。利用His标签蛋白纯化试剂盒处理后可以得到高纯度的His₆-LadR蛋白；经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定可知其浓度为1 mg/mL。

2.5 凝胶阻滞试验

EMSA结果(图 5-A)显示，LadR蛋白可与mdrL基因启动子区域结合，并且该结合作用在一定范围内随LadR蛋白浓度升高而增强；而在所有蛋白浓度下，阴性对照recA基因均未出现阻滞条带(图 5-B)。结果表明，LadR蛋白可与mdrL启动子序列发生特异性结合作用。

3 讨论

Tamburro等^[18]研究报道，BC胁迫下mdrL基因出现明显过表达现象，推测MdrL外排泵在Lm对BC耐受中起作用。Romanov等^[19-20]通过检测不同Lm菌株中mdrL基因的表达量发现，BC胁迫下mdrL基因的转录水平升高4-20倍，该结果表明在BC刺激下不同菌株的mdrL基因表达量呈现差异性。我们先前的研究结果显示，与野生株EGD-e相比，mdrL基因缺失突变株∆mdrL在亚致死浓度BC胁迫下的生长迟滞期延长、平均最大生长率和平均最大光密度值均降低；在致死浓度BC作用下的存活率降低2个log值，表明MdrL外排泵在Lm对BC耐受中起作用。本研究结果显示，BC作用下，mdrL基因在野生株EGD-e中的转录水平提高约1.6倍，表明BC能够诱导mdrL基因的表达。不过，与前人的研究结果相比，本研究中mdrL基因转录水平升高的倍数较低。其原因可能有三点：一是菌株自身的差异性；二是BC刺激的时期不同；三是BC作用的浓度不同。

Huillet等^[9]利用Northern blot技术检测mdrL基因的表达水平，结果发现LadR蛋白对mdrL基因具有负调控作用，并推测在正常生长条件下(BHI培养基)，LadR与mdrL基因的启动子区域结合，从而抑制mdrL外排泵基因的转录。本论文在前人研究的基础上，深入调查LadR蛋白对MdrL外排泵的调控机制。qRT-PCR结果显示，无BC刺激时，mdrL基因在ladR基因缺失突变株中的转录水平比野生株EGD-e高51倍，表明LadR蛋白可能负调控mdrL基因的转录；BC作用下，mdrL基因在突变株中的转录水平比EGD-e高1.4倍，我们推测在BC胁迫下，除了LadR蛋白可能还存在其他的调控蛋白参与mdrL的调控。EMSA试验^[21]结果显示，LadR蛋白能够与mdrL基因启动子区域结合，并且其结合活性随蛋白浓度的增加而增强，当蛋白浓度大于0.4 mg/mL时，结合活性没有明显变化。LadR蛋白与recA基因的编码区没有发生结合作用，表明LadR与mdrL基因启动子区域的结合具有特异性。

4 结论

本研究以Lm标准菌株EGD-e为研究对象，深入调查LadR对MdrL外排泵的调控作用及其调控方式。结果表明，BC能够诱导mdrL基因的表达。LadR蛋白负调控mdrL基因的表达；在正常生长条件下，LadR与mdrL基因的启动子区域结合，抑制外排泵基因mdrL的表达。