2000年，日本学者Notomi发明了一种新型等温核酸扩增方法——环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）^[1]，经近20年研究积累，该方法灵敏度高、特异性强、易于操作等优点已被广泛接受，LAMP亦被认为是一种可有效规避PCR检测对仪器设备的依赖、行之有效的现场快速筛查技术，并开始应用于病原微生物及物种鉴定、疫病现场检测、临床诊疗等领域。本文结合LAMP技术优势，对其发展及应用现状进行了综述，并对其目前存在的不足、技术群的发展需求和趋势进行了分析，希望有助于LAMP技术的进一步推广应用。

1 LAMP技术检测及应用现状

LAMP方法与常规的核酸扩增法相比具备其独特优点：恒温扩增、高效快速、灵敏度高、特异性强、结果判定简单，使得LAMP技术成为继PCR技术后受研究人员青睐的核酸检测方法之一。

LAMP在细菌检测方面的研究和应用较广泛，目前本技术已应用于结核杆菌、肺炎链球菌、副溶血性弧菌等多种常见致病菌的检测，主要原因在于：一方面，细菌的核酸抽提简单易行，可采用直接煮沸法等方式进行；同时，细菌基因组较为保守，借助LAMP的高效扩增优势，有助于疫病的快速确诊。如Ahmad等^[2]建立了一种检测水中大肠杆菌及检测水中肠球菌的LAMP检测方法；Dou等^[3]建立了一种检测脑膜炎的多重芯片LAMP检测法；Lee等^[4]建立了一种检测血液及乳液中细菌的多重LAMP检测方法，这些方法均无需复杂的核酸抽提程序，待检样品可直接加入LAMP反应试剂中进行扩增，整个检测过程快速、简单，非常适用于临床。相比而言，应用LAMP技术对病毒进行检测目前多局限于实验室内研究，缺乏现场应用的主要原因为样品中病毒含量相对较低且基因易于突变、RNA病毒还极不稳定，现场核酸抽提的得率及纯度难以满足病毒基因检测需求，但这并不影响LAMP成为PCR技术之后的一种新型的病毒实验室诊断技术，相关的研究涉及了流感病毒^[5]、埃博拉病毒^[6]、西尼罗河病毒^[7]等人类易感病原，口蹄疫病毒^[8]、犬细小病毒^[9]、非洲猪瘟病毒^[10]等动物病原和玉米萎黄病毒^[11]、菜豆花叶坏死病毒^[12]等植物病原。此外，LAMP技术还被应用于转基因大豆^[13]等的品系研究，以及中药人参成分鉴定^[14]、奶牛胚胎早期性别鉴定^[15]等领域。

2 LAMP技术群研究进展 2.1 核酸物质的快速抽提

核酸抽提是基因检测的基础，是分子生物学最关键的技术工具之一^[16]。LAMP在疫病快速初筛领域的发展，要求配套建立简单快速且适用于临床环境的提取方法。目前，常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、异硫氰酸盐裂解法及离心柱提取法等，多为商品化试剂盒，成本较高，且操作流程繁冗、耗时或需要专业的实验室设备，并不适合现场检测。Camp等^[17]建立了检测两种正布尼亚病毒的LAMP检测方法，为提高方法的临床适用性，尝试跳过核酸纯化步骤直接进行LAMP扩增，结果灵敏度下降了100倍，不能满足高灵敏检测需求。冯娜等^[18]将磁珠法核酸提取与LAMP技术结合，建立了鼠疫杆菌快速检测方法，其通过“裂解-吸附-洗涤-洗脱”四步骤进行核酸提取，省却了离心机，操作更为简单快速。近年来，借助磁分离原理，一些半自动化、自动化核酸提取仪被陆续开发出来，如半自动核酸提取仪（MCB1200，美国思博明）、移液法核酸提取仪（Magtration@12GC，日本PSS）以及高通量磁珠纯化仪（KingFisher Flex 96，美国赛默飞）等，实现了核酸提取的自动化、高通量化，节省了人力、时间，已被广泛应于专业分析实验室中。Liu等^[19]借助FTA（Flinders technology associates）卡，建立了一种快速检测HIV病毒的RT-LAMP检测方法，灵敏度可达10²个病毒颗粒，FTA卡可快速破裂样品细胞，紧密结合其释放的核酸物质，通过洗涤可有效去除样品中抑制因子，并不会对LAMP扩增效率产生明显影响，目前亦有相关研究将其应用于分枝杆菌、鼠疫杆菌、疟原虫及真菌等^[20-22]LAMP检测方法中。2007年，日本荣研公司（Eiken Chemical）建立了一种简单快速的结核分枝杆菌LAMP检测技术^[23]，该技术采用了管式DNA快速提取法。待检样本经过裂解管内的加热裂解、吸附管内的核酸吸附、LAMP管内的扩增及紫外灯下判定等过程。所需的裂解液、反应液等均预置于各管中，无需额外添加，通过手动挤压实现液体在各管间的传递，大大减少了污染的可能。日本荣研公司配套研发了专门的一体化仪器，集成了加热裂解、等温扩增及紫外观察等模块，使检测更加方便快捷。WHO已正式推荐该方法用于肺结核的临床诊断中。

然而，直接扩增法会导致灵敏度的下降；磁珠法操作较复杂且提取成本较高；FTA卡仅适用于血液、口腔细胞等细胞水平的样品，且提取RNA仅可保存7周，日本荣研公司研发的快速核酸提取技术也仅局限于唾液、血清、鼻咽拭子等液体样品的DNA快速萃取及检测。因此，探索一种简单、快速、经济、适用于现场及多种样品类型、可同时用于DNA及RNA抽提的核酸提取技术平台是目前需求所在。笔者建议从以下几方面进行改进：一是配套快速裂解液的研发，目前常用的裂解液多种多样，包括胍盐裂解液、碱性裂解液、酚裂解液等，这些裂解液均可实现核酸物质与蛋白质的迅速分离，有研究对几种常见核酸裂解液进行了比对，结果显示胍盐法及酚氯仿抽提的效果最佳^[24]。二是现场快速核酸抽提技术的研发，常规的核酸抽提步骤为裂解、分离、洗涤及洗脱等步骤，多是借助离心机或者磁珠吸附进行的，难以为现场核酸提取使用。亟需研发便携的现场核酸抽提方法。

2.2 LAMP检测体系的优化完善

在口岸检疫、动物疫病监测等工作中，针对单一指标的检测方法并不利于快速通关或疫情预警，而同时对多重靶标进行检测分析可有效提升工作效率、降低成本、减少工作量，是一种理想的检测手段，因此，多重检测将是LAMP发展的必然趋势^[25]。然而，有研究显示BST聚合酶具非特异扩增、线性DNA片段多聚体化等特殊活性^[26-28]，使LAMP易出现产物量大、分子量高或仍呈现梯形分布的非特异扩增产物^[29-30]，导致反应产物众多，影响检测特异性。王彩霞等^[31]通过引物设计及筛选，优化建立了一种同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法，在设计的两套LAMP引物中引入限制性内切酶位点，通过酶切实现了2种寄生虫的鉴别诊断。

分析表明，在60-65℃ LAMP反应条件下，核苷酸链处于解链和退火的动态平衡状态，无需外引物的置换作用亦可启动引物退火。为避免引物数量过多产生的抑制作用，研究者将扩增效率较高的一组或两组引物的外引物去除，获得了较好的扩增结果。石素婷^[32]针对几种水生动物疫病建立了一系列LAMP检测方法，在此基础上去除外引物，组建了锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒双重LAMP检测法及流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒三重LAMP检测法。

Kasahara等^[33]发现在相同条件下，与单重扩增相比，多重扩增时引物扩增速度明显变慢，推测为引物间的相互抑制作用导致。目前，NEB等生物公司已陆续开发出Bst 2.0、Bst 3.0等通过电脑设计合成的新型Bst聚合酶，相比野生型Bst聚合酶或其大片段，具更强扩增力，有研究表明Bst2.0或Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶扩增速度比野生型快50%左右^[34]，可大大缩短反应时间，并且可在一定扩增抑制剂存在情况下或不纯样本中进行扩增，使得LAMP技术更适用于现场快检。

随着微流控技术的发展，可通过建立微型芯片，配置多个单独的反应池来完成多重体系的组建。博奥晶典生物技术有限公司研制出一种圆形的碟式芯片^[35]，可实现对同一样品中24个不同基因靶标的同时检测，该方法大大降低了时间、人员及试剂耗材投入；24个微室内的反应单独进行，不会造成相互干扰；无需进行开管操作，不会产生核酸物质污染。类似的设计理念同样被用来检测脑膜炎^[3]、肠道致病菌^[36]等。

2.3 LAMP结果的判定

LAMP扩增结果的判定途径多样，除常规电泳法外，还可借助沉淀法、染料法进行，其中，沉淀法利用了DNA合成过程中产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀作为反应标识物，而染料法则利用了染料与核酸的螯合作用，两种方法均可实现反应结果的可视化判定。

基于防污染的考虑，闭管的判定方式将更适合现场诊断。虽然沉淀法和染料法均可进行肉眼观察，但存在个体差异导致的视觉误差，如何放大阴阳性之间差异，是准确判定的前提。染料法有自然光下和紫外光下判定两种方式，紫外光下，阳性会发射明显荧光，阴性不发光，大大增加了阴阳性差异，判定更快、更准，紫外法利用一盏手持紫外灯即可实现。另外，袁向芬^[37]等对LAMP常用的几种染料进行了比较筛选，发现目前常用的染料如钙黄绿素等对LAMP反应具有一定抑制作用，作者筛选到一种核酸染料Dye63，抑制作用更小，并通过多功能酶标仪对反应结果荧光强度进行了读取，阴阳性荧光强度存在显著差异，可利用终点法进行准确判定。

横向流动装置（Lateral flow device，LFD），即免疫层析试纸条技术亦开始应用于现场可视化快速检测研究中，该方法所使用的胶体金材料对反应结果具放大作用，使结果观察更加直观。Nimitphak等^[38]建立了检测对虾肝胰腺细小病毒的LAMP-LFD法，可在75 min内完成检测。研究显示，LAMP-LFD方法简单、快速，敏感性接近荧光PCR方法，是一种非常具有潜力的现场诊断技术。LFD法的不足在于无法有效区分非特异性扩增，且需开管检测，易导致核酸气溶胶污染。

可见，闭管判定的目视法似乎更适用于临床初筛，目前，筛选抑制作用更小的核酸染料，设计可准确获取荧光数据的便携仪器是该领域的发展方向之一。

2.4 LAMP假阳性结果的规避

LAMP检测易产生气溶胶污染导致假阳性结果的问题为其应用中的主要阻碍，也是众多研究者操作过程中遇到最棘手的问题。实验室分区操作是大家普遍使用的应对方式，但“治标不治本”，如何从根本上控制污染的产生，是解决这一问题的关键。

刘威等^[39]使用了一种封闭剂，于反应前加入反应液中，反应过程中封闭剂由固态熔化为液态并封闭于液面之上，减少了气溶胶挥发。Wang等^[40]在引物5'端标记了自避分子识别系统（Self-avoiding molecular recognition systems，SAMRS），可杜绝大多数由引物引起的非特异性扩增，并利用热敏性尿嘧啶-DNA糖苷酶（AUDG）将预混液中包含的遗留性污染模板去除，建立的锥虫SAMRS- AUDG-LAMP检测法反应时长较标准LAMP延长30 min，但并未对反应灵敏度造成影响。

以上方法虽为假阳性问题的解决提供了宝贵经验，但封闭剂的使用原则上相当于闭管操作，限制了对反应液的进一步分析；而SAMRS- AUDG-LAMP检测法增加了引物设计及筛选的难度，且一定程度上降低了反应速度。NEB产品说明书中介绍其生产的Bst 2.0 DNA聚合酶完全兼容AUDG法，并不会对扩增速度产生影响，笔者建议可借此来降低交叉污染发生几率。

2.5 LAMP结果的确诊

目前，LAMP结果的确诊通常借助限制性内切酶鉴定法进行，可在扩增子内部寻找其特异性酶切位点，或在LAMP内引物内部引入外源性酶切位点，以实现结果的实验室确诊。但酶切鉴定需对反应液进行开盖操作，这会大大增加气溶胶污染几率，另外，该操作需一定实验室环境，在临床检测工作中并不适用。基于这一点，Tone等^[41]建立了利用溶解曲线法进行四种病原分析鉴别的LAMP扩增法。其原理在于通过溶解曲线的形状及峰值对反应产物进行特异性判定。理论上，相同的扩增产物应该具备相同的溶解曲线，序列上微小的不同亦会表现在溶解曲线形状或峰值的不同上，由此即可确定是否存在非特异性扩增。当然，该方法的实际应用亦须配合现场化的便携仪器进行。

2.6 LAMP现场诊断一体化平台

LAMP技术本身及其周边技术群目前已有了长足发展，然而相关研究广而杂，各成一家，如何将其有机结合，构建一体化基因快速筛查平台，实现监测数据及成果共享并对实际工作产生指导作用，这将成为LAMP推广应用最关键的一步。

一体化设计要求我们构建核酸快速抽提、LAMP快速扩增、结果准确判定及数据实时上传的LAMP快筛平台，实现LAMP诊断系统化、便携化、科技化。已有研究成功将LAMP扩增、电泳及后续分析整合在芯片上^[42]，运用该芯片可在15 min内完成浓度为23 fg/μL的核酸样品的LAMP扩增、电泳及判定，其不足在于缺少核酸快速抽提的解决方案，同时存在气溶胶污染风险；另外，本文涉及的将LAMP技术与各种新技术结合，如防污染法、横向流动试纸条装置、新型核酸染料的研发、便携仪器的开发等，这些技术的综合应用方能“互补其短，实现共赢”；同时，我们应意识到基因现场快速检测的目的在于指导进一步工作，因此数据汇总分析及实时上传也将成为一体化设计的一部分，要求仪器同时具备数据远程传输终端功能，目前，这种终端机的研究与应用也较为广泛，如用于气候、水质、疫情的监测及数据汇总等，LAMP现场快速筛查结果亦可通过这种手持终端机进行实时上传，实现对大数据的综合汇总分析，并准确指导一系列相关工作。

一体化平台的构建将为临床基因检测工作提供一个高效运转机制，大大节省人员、时间及物质成本，具有长远的经济及社会效益。

3 展望

本文将LAMP技术定位于一种现场基因快检技术，是因其具备高效、快速、操作简单等特点，目前，涉及基因现场快速诊断的监测技术平台仍不完善，是我们亟须解决的一个难题，但可以确定的是LAMP技术等新型核酸扩增技术将成为这种基因快速初筛平台的关键技术。

纵观LAMP技术发明至今，相关检测技术已经涉及医药、环境、卫生等方方面面，其不断发展的过程伴随着不断与各种新技术的组合优化过程，免疫层析试纸条技术、微流控技术及测序技术等目前较热的新型技术均可与LAMP技术相辅相成应用于临床基因诊断中，它的下一步发展仍需要研究者不断的探索与创新，真正建立现场基因诊断一体化平台，使其应用不再受时间、地点、操作人员等条件的限制，任重而道远！