高粱（Sorghum bicolor L. Moench）是继小麦、水稻、玉米和大麦之后的全球第五大谷类作物，具有极强光合作用效率和抗逆能力，耐高温、耐旱、耐涝、耐盐碱、耐贫瘠、耐干热风，素有“作物中的骆驼”之称^[1]。高粱产品用途广泛，经济价值高，是食品、饲料和加工业的重要原料^[1]。在干旱和半干旱地区，尤其是非洲和亚洲某些地区，高粱是主要的粮食作物，为全世界超过30个国家约5亿人口提供膳食来源^[2]。近年来，能源危机和环境问题日益突出，生物质能以其独特的优点在解决能源和环境矛盾中受到世界各国的高度重视^[3]。高粱尤其是甜高粱，其秸秆中含有大量的可溶性糖分，可直接用于发酵生产燃料乙醇，秸秆中大量的纤维素是生产纤维素乙醇的重要原料^[1]。因此，甜高粱是目前公认的最有应用前景的再生能源作物之一^[4]。但现有高粱品种存在不少缺陷：其一，易感染病虫害^[5-6]；其二，营养价值、产量及其他相关农艺性状有待改良。植物基因工程育种是现代生物技术的重要组成部分，其在水稻^[7]、棉花^[8]、大豆^[9]等作物中的应用已有广泛的报道，并取得良好的效果。这为高粱的种质资源改良提供了一条思路。在植物基因工程育种中，植物组织培养技术起着重要的基础作用。高效的植物组培再生体系是成功进行遗传转化的先决条件^[10]。然而，大量的研究表明，高粱通过组织培养再生比较困难，这是制约高粱遗传转化的一个技术瓶颈。

长期以来，高粱植物组织培养面临着三大困难：有害色素的释放，再生频率低，愈伤组织再生能力维持时间短^[11]。这些问题直接制约着高粱遗传转化技术的发展。虽然，目前已有研究者建立了高效的遗传转化体系，如Liu等^[12]获得了高达20.7%的转化率，Wu等^[13]获得了33%的转化率，Do等^[14]利用标准双元载体，也获得超过14%的转化率，但这都是集中在个别所谓的模式品种（Tx430和P898012）中实现的，其他高粱品种依然面临着转化率低的问题^[15]。Li等^[16]报道了一种高粱遗传转化体系，采用农杆菌侵染有创伤的成熟种子，试图通过种子萌发获得转基因植株，该方法巧妙避开了组织培养过程，基因型依赖性弱，然而最终转化率却只有4%。Lowe等^[17]利用玉米形态发生调控因子Bbm和Wus2来促进单子叶植物遗传转化，虽然Bbm和Wus2在包括玉米、高粱在内的单子叶植物中显示了一定的效果，提高了某些品种的转化率，然而该方法并不能完全摆脱基因型和外植体的限制。因此，这个问题的解决仍然要回归到高效再生体系的建立上。随着农业生物技术的发展，高粱组织培养技术也取得一定进展。本文对近年来高粱组织培养研究成果进行总结，重点讨论基因型、外植体、培养基和植物激素对高粱组织培养的影响，并结合笔者的研究提出一些看法，以期为高粱组织培养技术研究提供参考。

1 基因型对高粱再生的影响

在高粱组织培养过程中，不同基因型的高粱往往表现出极大的差异。Cai等^[18]利用幼穗诱导高粱胚性愈伤时，系统比较了8种高丹宁含量的高粱品种在色素产生、胚性愈伤形成、芽分化和分化能力的维持等方面的差异，结果表明：（1）丹宁含量高的基因型，其培养物通常会产生大量的酚类物质，但不同基因型的培养物产生的色素的颜色、密度不同，培养物对有毒色素的耐受力也不同，IS3150产生的色素为紫色，培养物坏死程度较轻，而IS4225产生色素为棕色，培养物坏死较为严重；（2）不同基因型培养物产生胚性愈伤的时间不同，IS3150在诱导培养后期即可见白色胚性愈伤，而IS6881直到继代培养阶段才出现胚性愈伤，此外，各基因型胚性愈伤诱导率（8%-70%）和分化率（1%-73%）差异较大；（3）继代培养过程中，褐化和生长活力丧失是胚性愈伤维持分化能力的障碍，不同基因型培养物，其分化能力维持差异较大。例如，IS3150胚性愈伤培养40-160 d，可以产生900株幼苗，培养到220-310 d，仅产生15株幼苗，分化能力严重下降；而IS8260胚性愈伤培养40-160 d，可以产生154株幼苗，培养到220-310 d，可产生282株幼苗。Assem等^[19]对10种不同基因型高粱的体细胞胚形成和植株再生能力进行研究，以幼胚为外植体，结果显示，在胚性愈伤组织诱导过程中，LG3在各培养基上表现最好，平均胚性愈伤诱导率为（47.5±6.0）%，而SPP462却只有（13.4±3.3）%；在分化过程中，不同基因型高粱也表现出较大的差异，分化率为0-22.1%，这表明胚性愈伤组织的形成和植株再生高度依赖于基因型。

2 外植体对高粱再生的影响 2.1 幼胚

幼胚是最为常用的一种外植体。Gamborg等^[20]首次利用高粱幼胚作外植体，并观察到愈伤形态发生和植株再生过程。显微观察表明，由幼胚再生植株存在两种途径：器官发生途径和体细胞胚发生途径^[21]。此外，高粱幼胚再生过程中，会出现体细胞变异现象^[22]，这对于维持品系的稳定是不利的。用幼胚作外植体时，取材时期、幼胚大小及幼胚放置方式对愈伤组织的诱导及分化培养有重要的影响。马鸿图等^[23]研究了幼胚胚龄与诱发率间的关系，发现授粉后9-12 d的幼胚呈透明状，接种到培养基上后，小盾片一直保持活力，诱导出的愈伤由小盾片产生，能够正常分化出芽，而授粉后15-18 d的幼胚呈白色，接种到培养基上后，胚根和胚芽迅速伸长，小盾片则死亡，愈伤从胚根和芽鞘节出产生，这种愈伤通常只能分化出根，很难分化出芽。从幼胚大小上看，大小为0.7-1.0 mm的幼胚适合作外植体^[23]，胚太小则不宜接种，太大则芽萌发太快^[24]。幼胚的放置方式对愈伤组织的诱导也有重要的影响，盾片朝上，有利于诱导盾片愈伤组织；而盾片朝下，幼胚容易直接萌芽，不利于胚性愈伤的产生。

2.2 幼穗

幼穗也是一种比较理想的外植体。Brettell等^[25]首次报道了高粱幼穗通过体细胞胚途径再生植株的过程，其研究表明，幼穗的大小对胚状体的诱导率有极大的影响，大小在10-20 mm时，诱导率最高；对于较大的幼穗，可以通过增加2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）的浓度来提高诱导率，但这会抑制分化培养时芽的形成。在供试的几个基因型中，G522表现最好，这说明采用幼穗做外植体通过体细胞胚途径再生也有一定的基因型依赖性；对于诱导能力差的基因型，通过采取更小的幼穗，并增加2，4-D浓度，能够提高体细胞胚的诱导率。Jogeswar等^[26]利用幼穗在三种重要的高粱品种中建立了一种高效的体胚发生和植株再生体系。在体胚发生阶段，在MS培养基（Murashige and Skoog medium^[27]）中添加2 mg/L 2，4-D就能高效的诱导出体胚，添加0.5 mg/L6-糠氨基嘌呤（6-Furfurylaminopurine，KT）后，能更进一步的促进每个外植体上体胚的形成；植株再生时，在MS培养基中添加1.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）和1.0 mg/L KT对体胚的成熟和萌发最有效。此外，有研究表明，与幼胚相比，采用幼穗作外植体能够在一定程度上的克服基因型对植株再生的限制^[28]。

2.3 其他外植体

幼胚和幼穗在高粱再生体系建立中有一定的优越性，因此被大多数研究者采用。然而，幼胚和幼穗取材都有严格的时间限制，并且在自然条件下种植，受季节的影响，这给其应用带来诸多不便。高粱成熟种子可以长期储存，从这点看，成熟种子也是一种较好的外植体。徐丹等^[29]利用成熟种子在甜高粱中建立了一种再生体系，虽然分化率不高，但其愈伤诱导率高达77.26%，组织学观察发现，其再生过程中除了体胚发生途径外，还伴随着器官发生途径。赵利铭^[30]利用甜高粱成熟种子，从遗传背景入手，选择了适合进行组织培养的品种M-81E，并对其再生条件进行优化，使得愈伤诱导率高达87%，分化率也达到38.4%。这表明，在合适的培养条件下，利用成熟种子可以获得较高的再生率。此外，其他外植体如成熟胚^[31]、幼叶^[32-34]、花药^[35]、茎尖^[36-38]及根^[39]等（表 1）在高粱组织培养中也有研究。其中，茎尖是一种比较好的外植体，并逐渐被应用到禾谷类作物的遗传转化中^[40]。刘宣雨等^[38]以高粱成熟种子萌发3-7 d的幼苗顶端分生组织为外植体，建立了一种高频高效的再生体系，该体系在供试的3个高粱品种中均获得较高的再生频率。

3 培养基成分对高粱再生的影响 3.1 基本培养基

在植物组织培养中，培养基为培养材料提供各种养分，包括碳水化合物、矿质营养、维生素和氨基酸等，以满足离体植物材料生长发育的需要。MS培养基矿质营养比较均衡，广泛地适用于各种植物的组织培养。因此，在高粱组织培养早期研究中，多数研究者采用MS培养基。也有研究者采用其他培养基，如Maekinnon等^[41]报道采用LS培养基（Linsmaier and skoog medium^[42]）建立了一种甜高粱体细胞胚再生体系。Goh等^[43]研究了MS、N6^[44]和B5^[45]培养基对高粱愈伤诱导的影响，在11个高粱品种中，有10个品种能够在B5培养基上很好地诱导出愈伤，且愈伤诱导率均在70%以上，分化培养和生根培养在MS培养基上表现较好。这表明高粱在组织培养的不同阶段，对各种营养成分的需求量有所不同。Elkonin等^[46]研究了氮和磷对高粱愈伤诱导的影响，表明增加硝酸盐（NO₃^-）、铵盐（NH₄⁺）和磷酸盐（PO₄^3-）有利于胚性愈伤的诱导和生长，并能提高其分化能力，同时也报道了两种比较适合高粱组织培养的培养基M2和M11。其中，M11培养基能减少高粱培养物释放酚类物质，促进高质量胚性愈伤产生^[47]。Liu等^[11]以M11培养基为基本培养基，成功的建立一种高粱再生体系。该体系在3个高粱品种中均实现了较高的再生率。这表明M11培养基有利于高粱组织培养物的生长发育。

3.2 硫酸铜

铜作为一种植物必需的微量元素，是各种培养基的基本成分。在MS培养基中，硫酸铜（CuSO₄）含量只有0.1 μmol/L。Purnhauser^[48]发现提高CuSO₄含量至5-1 000倍能有效的促进小麦愈伤组织分化形成芽和根。此后，这一发现在很多植物组织培养中得到证实。培养基中添加0.1-100 μmol/L CuSO₄能显著的促进小麦、小黑麦愈伤形成以及马铃薯叶盘再生^[49]；提高MS培养基中CuSO₄含量能够促进大麦愈伤组织再生^[50]。Nirwan等^[51]率先研究了CuSO₄在高粱组织培养中的作用，表明较高浓度的CuSO₄能够促进高粱胚性愈伤的诱导和植株再生，其中，在MS培养基中添加2 μmol/L CuSO₄效果最好。也有研究者认为在MS培养基中添加1 μmol/L CuSO₄即可^{[11, 12]}。Wu等^[13]在优化高粱遗传转化体系时，研究了CuSO₄的作用，表明在恢复培养基和选择培养基中添加5 μmol/L CuSO₄能够促进质量好、生长快、有分化能力的转基因愈伤的形成，从而提高转化率。Liu等^[52]研究CuSO₄在高粱幼苗生根培养中的作用，表明在含生长素的培养基中添加1 μmol/L CuSO₄能够有效的促进幼苗生根。总之，CuSO₄在高粱愈伤诱导、芽分化及幼苗生根过程中均有重要促进作用。

虽然，CuSO₄在高粱组织培养中的积极作用被越来越多的研究证明，然而其促进组织再生的机制并不十分清楚。目前，存在两种观点：Lidon等^[53]认为铜离子（Cu²⁺）的作用同银离子（Ag⁺）一样，在植物组织培养中，是一种很好的乙烯抑制剂，能够抑制乙烯前体氨基环丙烷羧酸（ACC）的形成，从而促进植物组织再生；Purnhauser等^[49]则认为Cu²⁺是许多重要酶的辅因子，这些酶在电子传递、叶绿素、蛋白质和碳水化合物生物合成以及多酚代谢方面起着重要作用，因而能够促进再生。

3.3 氨基酸

氨基酸是合成蛋白质的原料，是一种良好的有机氮源，可以直接被植物细胞吸收利用。在植物组织培养中，常用的氨基酸有甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬酰胺、色氨酸等，还有各种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白等。Rao等^[54]研究天冬酰胺和脯氨酸在高粱再生中的作用，200 mg/L的天冬酰胺和脯氨酸能促进胚性愈伤的产生和再生，并能延迟愈伤再生能力的丧失。Elkonin等^[55]也研究了天冬酰胺和脯氨酸在高粱再生中的作用，表明其能促进松散易碎的胚性愈伤的形成，同时能减少高粱组织培养中有害色素的产生。Hagio^[56]在建立高粱不定芽再生体系时，研究了脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸对愈伤诱导和不定芽再生的影响，表明脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺在1 g/L的浓度时，能显著的促进不定芽的再生，甘氨酸在2 mg/L浓度时，促进作用显著，而丝氨酸、赖氨酸和色氨酸在高粱不定芽再生中有消极作用。可见，在培养基中加入合适的氨基酸，可有效的促进高粱愈伤组织的诱导及芽的分化。

3.4 抗褐化剂

褐化是植物组织培养中的三大难题之一。在高粱植物组织培养中，褐化现象非常严重，通常将培养基染成黑褐色，甚至导致培养材料死亡。解决褐化最简单的办法就是经常转接，但这常常造成培养基原料极大的浪费，往往培养基中的养分还没消耗多少，就因褐化而不得不更换新鲜的培养基。向培养基中加入抗褐化剂能有效的防止材料褐变，常用的抗褐化剂有活性炭、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP）和交联聚乙烯吡咯烷酮（Crosslinking polyvingypyrrolidone，PVPP）等。活性炭是一种良好的吸附剂，但其吸附无选择性，在高粱组织培养中使用较少，此外，有研究表明，在愈伤诱导培养基中加入活性炭虽然能够减少幼胚向培养基中释放的黑色色素，但却严重抑制幼胚产生愈伤组织^[57]。维生素C是一种抗氧化剂，10-20 mg/L就能够有效的减轻培养材料褐化的褐化程度^[13-14]。聚乙烯吡咯烷酮和交联聚乙烯吡咯烷酮是酚类物质吸附剂，其在高粱组织培养中最为常用，Hagio^[56]认为培养基中加入1 g/L PVP即可促进芽再生，Liu等^[11]在分化培养基中加入1 g/L PVP，芽分化能力从56.3 per IE提升到65.3 per IE。Lu等^[58]在高粱遗传转化各阶段中加入10 g/L PVPP，有效的缓解了培养材料的褐化，提高了转化率，并认为PVPP在防止培养物褐化上优于PVP。

4 植物激素对高粱再生的影响

植物激素在植物组织培养中起着重要的调控作用，诱导愈伤组织的形成、芽分化和幼苗生根。2，4-D在高粱愈伤诱导中非常有效，M11APC1培养基^[11]中，1 mg/L 2，4-D即可诱导幼胚产生胚性愈伤组织。Do等^[14]在建立高粱遗传转化体系时，优化了愈伤诱导培养基中2，4-D的浓度，认为1.5 mg/L 2，4-D能提高胚性愈伤的诱导率。在分化培养时，1 mg/L吲哚乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA）和1 mg/L 6-BA即可诱导愈伤再生芽^{[11, 14]}。0.1 μmol/L脱落酸（Abscisic acid，ABA）的加入有利于体胚的成熟，0.1 μmol/L噻笨隆（Thidiazuron，TDZ）的加入能够更进一步提高芽分化率^[13]。然而，通过不定芽再生时，幼胚在添加2 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT或6-BA的培养基上诱导出的愈伤，在不加任何植物激素的MS培养基上分化率较高，细胞分裂素的加入反而会使不定芽诱导率降低^[56]。在高粱生根培养中，1 mg/L吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA）即可诱导根系的发生^[14]，Liu等^[52]用NAA、IBA和IAA三种生长素在1 mg/L的浓度并添加1 μmol/L CuSO₄，不仅根系发育完整，而且芽的增殖数也有所提高。综上所述，在组织培养的不同阶段，植物激素起着不同的作用，其种类、浓度是培养材料正常生长发育的关键。

5 展望

高粱组织培养受基因型、外植体、培养基和植物激素等因素的影响。其中，基因型对离体培养材料的再生有重要的影响，再生的各个阶段，均有相应的基因参与；不同外植体的再生能力也往往表现出巨大的差异，这可能与其自身的生理状态有关；培养基为离体培养材料的生长和发育提供物质基础，其组成成分对培养物的形态建成具有重要影响；植物激素调控着离体培养材料的脱分化和再分化过程，影响培养物的发育进程。在高粱组织培养中，对外植体和植物激素已经有较为清晰的认识。虽然，取材受季节的影响，相比之下，高粱幼胚仍然是最为理想的外植体，使用幼胚作外植体，已成功在Tx430中建立了高的效组织培养体系和遗传转化体系，并应用CRISPR/Cas9对其进行了基因编辑^[59]。在高粱愈伤诱导时，通常使用2，4-D，其浓度一般为1-2 mg/L，愈伤组织的分化采用6-BA或KT，并配合低浓度的IAA或NAA，组培苗的生根采用1 mg/L IBA即可。但关于基因型和培养基的研究，目前并不十分明确，只比较了各基因型再生能力的差异，并不了解其遗传机制；只研究了培养基中添加物对培养材料生长及分化的影响，并不了解其生理生化机制。

因此，解决高粱再生困难的问题，可以从以下两点着手。其一，植物组织或细胞再生涉及一系列生理生化、细胞和分子水平的变化^[60]，深入研究其调控机理，解析植物再生的遗传及表观遗传基础，将有助于解决基因型对高粱再生的限制；其二，虽然，高粱组织培养基因型依赖性强，但培养基的优化使得某些再生能力比较差的品种获得了较高的再生率，这表明基因型和培养基存在一定的互作关系，根据各基因型的代谢特点，进一步探索高粱组织培养条件，尤其是培养基成分，也能在一定程度上克服基因型对高粱再生的影响。