植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizoba-cteria，简称PGPR）指自由生活于土壤或定植在植物体内具有固氮、解磷释钾、产生植物激素、分泌抗生素和促进植物生长的一类有益微生物^[1]。自1978年Burr等首先在马铃薯上报道PGPR以来，国内外学者对水稻、玉米、小麦、苜蓿、披碱草、杉木和马尾松等植物的PGPR进行了广泛深入的研究^[2-4]，发现假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、固氮菌属（Azotobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、产碱菌属（Alcaligens）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等20多个种属的根际微生物具有防病促生潜能，并对其固氮、溶磷、产生植物激素、抑病机理以及作为新型肥料的菌源在农业生产中的开发利用等方面进行了有益的探索^[5]。

野大豆（Glycine soja）是一年生草本植物，为栽培大豆近缘祖先种，具有高蛋白、抗逆性强、繁殖系数大、适应性广等优点，因其为栽培大豆种质创制的重要物质基础和栽培大豆生产可持续发展的重要战略资源而成为研究的热点^[6-9]。自然环境条件下生长的野大豆植株不仅具有栽培大豆所不含的丰富遗传物质和功能基因，而且其原始生境复杂，种群多样性丰富，其根际促生菌的丰富度和多样性都较其他物种更为优越。对野大豆根瘤及根际土壤微生物进行筛选研究，极有可能挖掘到具有潜在应用价值的多功能根际促生菌株，但相关研究却鲜有报道。本研究从野大豆根瘤和根际土壤中筛选出12株细菌，分别对其固氮基因、解磷、合成生长素能力、产ACC脱氨酶活性以及盆栽促生效果作用进行测定，旨在筛选优质、独特、高效的多功能根际促生菌，为野大豆根际促生菌种质资源的基础研究和开发应用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试根瘤和土样

2016年9月采自于沈阳市沈北新区蒲河沿岸生长的健康野大豆（Glycine soja Sieb.et Zucc）根瘤和根际土。将采集样品分别装入无菌纸袋中，于24 h内分离，或于4℃冰箱保存，48 h内进行分离。

1.1.2 主要培养基及试剂

Hoagland营养液：取1.26 g Hoagland营养液（粉末）加入0.845 g硝酸钙，定容至1 000 mL，115℃灭菌20 min。

Ashby培养基：甘露醇10 g，NaCl 0.2 g，MgSO₄ 0.2 g，CaCO₃ 1 g，CaSO₄ 0.2 g，K₂HPO₄ 0.2 g，pH7.0-7.2。

蒙金娜无机磷（PKO）培养基：葡萄糖10 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.003 g，MnSO₄·4H₂O 0.003 g，MgSO₄· 7H₂O 0.3 g，Ca₃（PO₄）₂ 5 g，pH7.2。

有机磷卵黄培养基：葡萄糖10 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂0 0.03 g，MnS0₄·4H₂O 0.03 g，蛋黄卵磷脂0.2 g，CaCO₃ 5 g，酵母膏0.4 g，琼脂18 g，pH 7.0-7.5。

King培养基（g/L）^[10]：蛋白胨20.0 g，甘油15 mL，K₂HPO₄ 1.5 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，色氨酸0.1 g，pH7.2（用KOH调pH）。

TSB液体培养基^[11]：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H₂O 1 000 mL，pH7.2。

DF培养液：KH₂PO₄ 4 g，Na₂HPO₄ 6 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸钠2 g，柠檬酸2 g，（NH₄）₂SO₄ 2 g，组分1和组分2溶液各0.1 mg。（组分1：H₃BO₃ 10 mg，MnSO₄·H₂O 11.19 mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6 mg，CuSO₄·5H₂O 78.22 mg，MoO₃ 10 mg，溶于100 mL灭菌蒸馏水中，-4℃保存；组分2：FeSO₄·7H₂O 100 mg溶于10 mL灭菌蒸馏水中，-4℃保存），H₂O 1 000 mL，pH7.2。

ADF培养基：以3 mmol/LACC代替DF中的（NH₄）₂SO₄，为唯一氮源。

Spot比色液：吸取0.5 mol/L FeCl₃ 1 m L溶于50 m L蒸馏水，加入浓H₂SO₄ 30 m L，冷却后定容至100 mL。

S2比色液：准确称取FeCl₃ 4.5 g，溶于10.8 mol/L H₂SO₄中，冷却后定容至1 L。

1.2 方法 1.2.1 PGPR菌株的分离纯化 1.2.1.1 根瘤菌的组织分离法

取新鲜、饱满的野大豆根瘤用自来水洗净，并用无菌纸吸干，无菌水冲洗3-4次，75%的酒精消毒，无菌水冲洗3-5次，无菌纸吸干备用。将根瘤用研钵加无菌水进行研磨，用涂布法将研磨后的少量根瘤组织液涂布于Ashby平板上，28℃培养，采用稀释平板划线法进行菌种纯化，纯化后的菌种接斜面，4℃保存备用。吸取最后一次无菌洗涤水在Ashby平板上涂布，28℃培养，作为空白对照。

1.2.1.2 土壤根际菌的平板涂布法

取野大豆根际土壤10.0 g，放入带玻璃珠并装有90 mL 0.85%生理盐水的250 mL三角瓶中充分振荡30 min后静置，取上清液稀释涂布于Ashby平板，28℃培养，分别挑取形态不同菌落进行纯化，纯化后转至斜面，4℃保存备用。

1.2.2 PGPR菌株的鉴定 1.2.2.1 形态学鉴定

于光镜下观察菌体细胞形态，如细胞形态大小、荚膜、鞭毛、芽孢等；将菌种涂布在Ashby平板上，25℃培养，观察菌落形态。

1.2.2.2 生理生化指标鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法对分离得到的菌株进行部分生理生化鉴定。

1.2.2.3 分子生物学鉴定

采用菌落PCR方法扩增16S rDNA。扩增产物测序送由生物工程（上海）股份有限公司完成，通过NCBI数据库在线比对测序结果，构建系统发育树。

1.2.3 固氮酶nifH基因扩增

提取菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用第一轮引物FGPH19：5'-TACGGCAARGGTGGNATHG-3'和POLR：5' -ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3'扩增nifH基因片段。反应体系：Premix Taq 25 μL（TaKaRa），引物（10 µmol/L）1 µL，模板1 μL，用ddH₂O补足50 μL。反应体系：Premix Taq 25 μL（TaKaRa），引物（10 µmol/L）1 µL，模板1 μL，用ddH₂O补足50 μL。反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。第二轮引物：AQER：5'-GACGATGTAGATYTCCTG-3'和POLF：5'-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3'。

反应体系：Premix Taq 25 μL（TaKaRa），引物1 µL，模板1 μL第一轮扩增产物，充分混匀稍加离心。反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 菌株解磷能力测定 1.2.4.1

解有机磷测定（透明圈法）将待测菌点接至有机磷卵黄平板，每组5次重复，28℃培养14 d，测定解磷透明圈的直径D与菌落直径d，并计算其比值D/d。

1.2.4.2 解无机磷测定

采用钼锑法测定可溶性磷标准曲线^[12]。参照Rodriguez和Fraga的方法^[13]。将待测菌接种于PKO培养基中，28℃，160 r/min培养7 d，8 000 r/min离心l5 min，取上清测定OD₇₀₀值，计算溶磷量，每组5次重复。以不接菌的PKO培养基作为空白对照。

1.2.5 产激素能力测定 1.2.5.1 IAA测定

标准曲线的制作，分别测定各浓度3-吲哚乙酸标准液OD₅₃₀值，绘制IAA标准曲线；将菌株培养液10 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液5 mL加5 mL S2比色液，在黑暗下静置30 min后，迅速测定待测液的OD₅₃₀值，并在标准曲线上查出待测液的IAA浓度^[10]。

1.2.5.2 ACC脱氨酶活性测定

绘制α-丁酮酸含量标准曲线；采用Bradford法测定细胞提取液中的总蛋白含量，以牛血清白蛋白为标准蛋白。待平板长出单菌落后，挑取单菌落接种至DF和ADF培养液中，30℃，170 r/min培养24 h。酶活性的测定方法参见文献^[11]。ACC脱氨酶活力以反应体系中每毫克菌体蛋白每小时催化ACC生成α-丁酮酸的µmol量表示。酶活性测定设置空白对照。测定结果为3次重复值。

1.2.6 PGPR菌株的盆栽促生试验 1.2.6.1 发酵液的制备和大豆种子催芽

将分离得到的纯培养物分别接种到50 mL Ashby液体培养基中，28℃、150 r/min发酵48 h，备用。取健康饱满的大豆种子经75%酒精浸泡30 s，10% H₂O₂表面消毒，无菌水冲洗5-6次，将种子平铺于湿润的滤纸上，并用4层湿润纱布覆盖，28℃，催芽36-48 h，待胚根长至2 mm左右时备用。

1.2.6.2 实验分组处理及大豆幼苗的培养

设实验和对照两组。以灭菌蛭石为栽培基质进行盆栽，将已催芽的大豆种子胚根向下栽种于花盆内，分别在各实验组中的根际加入菌株1 mL发酵液，而对照组则加入不含菌的培养液，每组3个重复。在幼苗培养期间，适时补充Hoagland营养液，并不断交换摆放位置，以保证每盆植物生长条件基本一致^[14]。

1.2.6.3 促生指标的测定

随机抽取处理后培养40 d的大豆幼苗，测量其茎长、根长。分离地上部分与地下部分，测量其茎鲜重、根鲜重，80℃烘干至恒重，分别测量茎干重、根干重。用SPSS和Excel软件处理数据并分析。

2 结果 2.1 PGPR菌株的分离筛选

从野大豆根瘤及其根际土壤分离得到124株细菌，经进一步筛选，最终获得12株固氮菌，其菌株编号分别为GD9、GD11、GD17、GD30、GD51、GD58、N1、N2、N3、N4、N5、P1。

2.2 PGPR菌株的鉴定 2.2.1 形态学及生理生化指标鉴定

12株菌的形态学特征及部分生理生化指标的鉴定结果分别见表 1、图 1和表 2。

2.2.2 分子生物学鉴定

对分离筛选得到的12个野大豆PGPR菌株的16S rDNA序列通过NCBI数据库完成BLAST比对，完成分子生物学鉴定。结果（表 3）显示，12株菌分别与其模式菌的基因同源相似度为99%或100%，分别归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、根瘤菌属（Rhizobium）、詹森氏菌属（Janthinobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、根癌农杆菌属（Agrobacterium）用MEGA6.0构建菌株的系统进化树见图 2。

2.3 固氮酶nifH结构基因的扩增

采用Touch-Up PCR（上升PCR）的方法从分离筛选的12株野大豆PGPR菌株中扩增到目的条带，nifH基因的PCR产物电泳图见图 3。

2.4 野大豆PGPR菌株解磷能力 2.4.1 解有机磷能力

对12株野大豆PGPR菌的解有机磷实验测定结果（图 4）表明，菌株GD9和P1具有解有机磷能力，可以在有机磷卵黄平板上形成透明圈，其2株菌的D/d值分别为2.14和1.42（表 4）。

2.4.2 解无机磷能力

12株野大豆PGPR菌的解无机磷测定结果（表 4）表明，除菌株GD58外，其余11株菌均可解无机磷，其中P1菌株的解无机磷能力最强，达57.31 mg/L；解磷能力在30%左右的有7株。

2.5 激素产生测定结果 2.5.1 产生IAA测定结果

对12株野大豆PGPR菌株的IAA测定结果（表 5）表明，菌株GD17、GD58、N4均具有产生IAA能力，其中GD58菌株产IAA能力最强（71.05 μg/mL），其次是N4（8.46 μg/mL），GD17最小（4.51 μg/mL）。

2.5.2 ACC脱氨酶活性测定结果

12株PGPR菌的ACC脱氨酶活性测定结果（表 5）显示，GD9、GD17、GD58、N4、P1菌株有ACC酶活性，但酶活性均不高，各菌株酶活力有一定差异，其中菌株GD17酶活性最高[0.59 μmol/（mg·h）]，其次为GD-58[0.283 μmol/（mg·h）]和N4[0.334 μmol/（mg·h）]，分泌能力较弱的为GD11[0.194 μmol/（mg·h）]和P1[0.058 μmol/（mg·h）]。

2.6 野大豆PGPR菌株对盆栽大豆促生影响

由表 6可知，分别接种6株筛选出的PGPR菌处理组与对照处理相比，大豆幼苗的鲜重、干重、植株长检测指标均优于对照组，菌株GD11、GD17、GD58对大豆的整体鲜重、干重提高能力较强；6株菌中有GD17和GD58菌株可显著提高幼苗的株高，菌株GD58提高能力最强；菌株GD9、GD11、GD17、GD30、GD58均可不同程度的提高大豆幼苗的根长。综合以上指标可以看出，菌株GD17、GD58的促生效果最为明显。

3 讨论

以往的大量研究表明植物根际促生菌以细菌分布最为广泛，具体来说这类微生物通过生物固氮或者生物溶磷作用为植物提供氮素及磷素营养，有些还可分泌抗生素、植物激素等代谢产物以及产生铁载体等。一直以来国内外研究学者致力于研究生物菌剂或微生物肥料，目的在于PGPR在植物根际的有效定殖可调节植物根际微生态的变化，有益菌群在植物根际成功定殖，可形成优势菌落，促进作物生长^[10]。目前，已在水稻^[15]、玉米^[16]、小麦^[17]、马铃薯^[18]、棉花^[19]等重要粮棉作物，以及大豆^[20]、花生^[21]、豌豆^[22]等豆科作物上成功应用。在不同生长条件下的植物，存在着许多与之相对应的对其生长有利的PGPR。韩丽珍等^[23]从茶树根际土壤中分离筛选出6株PGPR，有2株具有固氮能力，有1株菌株均具有产IAA能力，有4株具有ACC脱氨酶活性。代金霞等^[24]从荒漠植物柠条分离产ACC脱氨酶菌株5株，5株菌株全部具有固氮、产IAA和产铁载活性，但不同菌株间产生的量有一定的差异，菌株接种试验表明，所分离根际促生菌菌株对柠条幼苗生长具有明显的促进作用，尤其促进了根系的发育。

本试验以大豆幼苗植株的株高、根长、地上部分干鲜重、地下部分干鲜重为依据讨论了6株根际促生菌株代谢产物的促生活性，测量这些生长参数能够直观反应大豆幼苗的生长状况。研究发现，经过菌株GD58、GD17菌株胞外发酵物处理的大豆幼苗生长状况明显优于对照组^[25]，说明GD58、GD17菌株对大豆幼苗具有一定的促生长作用。

研究菌株的生物学特性、功能特性、促生特性及相关机理，以期为研制微生物肥料收集优良PGPR菌株资源，为可持续发展战略和生态环境的保护与建设探索一条生态、环保的建设道路奠定基础^[26-28]。

4 结论

本试验从沈阳沈北新区蒲河沿岸生长的野大豆根瘤及根际土壤中分离筛选出12株PGPR菌，通过形态学特征和生理生化试验及16S rRNA序列对比鉴定分别归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、根瘤菌属（Rhizobium）、詹森氏菌属（Janthinobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、根癌农杆菌属（Agrobac-terium）；其中2株可解有机磷，11株可解无机磷，3株具分泌IAA能力，5株具ACC脱氨酶活性。大豆盆栽试验表明：菌株GD17、GD58接种处理的植株幼苗鲜重、干重、株高均显著高于未接种的对照，可见其能够显著促进大豆幼苗的生长。