作为真核细胞内部最重要的细胞器之一，线粒体（mitochondrion）是细胞进行有氧呼吸的重要场所，承担着能量制造的主要任务。除此之外，线粒体还具有细胞周期的调节、细胞凋亡的调控^[1]、细胞内Ca²⁺动态平衡的维系^[2]等重要的功能。传统的共生学说认为线粒体最初来源于被吞噬的细菌，因此线粒体内含有环状闭合双链DNA组分，在遗传上具有一定的独立性，与核基因组DNA相比，线粒体DNA（mitochondrion DNA，mtDNA）使用的遗传密码表也略有差异。在不同的组织细胞中，线粒体的数量差异较大，从几个到几千个不等。线粒体DNA由于暴露在高浓度活性氧的环境中，自身缺乏蛋白的保护及损伤修复系统，因此更容易受到氧化损伤且突变率较高^[3]。因为mtDNA具有母系遗传且几乎不发生基因重组的特性，所以长期以来被当做是重要的分子标记，用于群体遗传学及演化生物学的研究，如现代人类进化谱系的构建及迁移路线的确立等。

生物的表观遗传现象是指在DNA的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的表达发生可遗传变化的情况。现有研究证明生物的表观遗传现象与多种机制相关，其中主要包括DNA的甲基化，组蛋白的修饰，染色体的失活以及非编码RNA的调控等。近些年来，表观遗传学的相关研究主要集中于细胞核DNA（nuclear DNA，nDNA）之上，并逐渐成为生物学研究的热点领域之一，而mtDNA则因为其序列短小、不与组蛋白结合且缺乏甲基化证据等原因，通常被认为不具备表观遗传学研究意义。2011年，研究发现线粒体中也存在有DNA甲基化酶（mtDNMT1），以及相当数量的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）与5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）^[4]。作为重要的表观遗传修饰形式，5mC与5hmC对于基因的表达调控具有重要意义，至此，线粒体的表观遗传学研究才开始受到多方的关注。与nDNA相比，线粒体DNA的甲基化状态同样具有明显的时空特征，环境中的许多因子都可对其产生一定的影响，本文将从mtDNA的甲基化特征、mtDNA的甲基化调控以mtDNA的其他表观遗传机制等方面进行综述，并对未来的研究方向作出展望。

1 线粒体DNA的甲基化特征 1.1 线粒体DNA的结构特征

真核生物线粒体基因组为环状DNA，其中外环DNA单链由于分子量较大而被称为重链（Heavy strand，H strand），内环DNA单链由于分子量较小而被称为轻链（Light strand，L strand）。mtDNA的两条链都有编码功能且基因排列紧密，除了一个包含有两个启动子、负责复制和转录起始的控制区（Displacement loop，D-loop）之外，基因间无内含子序列，部分基因还存在有重叠现象。这两条链被转录为较大的多顺反子转录前体，进而被加工成独立的功能单位，共含有37个基因，包括两个rRNA基因（16SrRNA，12SrRNA），22个tRNA基因以及13个疏水蛋白基因（细胞色素b，细胞色素c氧化酶亚基COⅠ，COⅡ和COⅢ，ATP合成酶亚基ATPase6和ATPase8，NADH脱氢酶亚基ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6）^[5]。其中L链仅编码ND6和7个tRNA基因，其余均由H链编码。

1.2 线粒体的DNA甲基化酶

在真核细胞中已发现有多种DNA甲基化酶的存在，其中DNMT3蛋白质家族负责甲基化核苷酸的初始合成（从头甲基化），DNMT1蛋白质家族负责复制过程中已有甲基化模式的维系（维持甲基化），而DNMT2蛋白质家族则负责tRNA的甲基化^[6]。在线粒体中，通常由DNMT1的同型mtDNMT1负责胞嘧啶5'位置甲基的添加。mtDNMT1虽然由核DNA编码，但是合成后被定位至线粒体内发挥作用。后来，在线粒体中又发现了甲基化酶DNMT3A^[7]和DNMT3B^[8]。研究证明了从头甲基化酶DNMT3A和DNMT3B不仅可以将胞嘧啶转化为5mC，还具有氧化还原依赖性的脱羟甲基化酶（dehydroxymethylase）活性，可以将5hmC转化为胞嘧啶，因此在基因的表达调控过程中起到了重要的作用^[9]。

1.3 线粒体的DNA甲基化模式

在真核生物nDNA中，绝大多数的甲基化位点是CpG二核苷酸序列之中的胞嘧啶，在mtDNA中也发现了类似的情况^[4]。在真核生物中，由于甲基化的胞嘧啶可以自发性地脱氨形成胸腺嘧啶，这一突变很难被DNA修复机制所识别纠正，随着时间的推移，基因组中的CpG含量会逐渐降低。以人类基因组为例，其中CpG含量约为1%，远远低于理论上4.4%的出现概率^[10]，其中70%-80%的CpG处于甲基化状态，非甲基化的CpG不是均匀分布在基因组上，而是成簇出现形成CpG密度较高的区域，即CpG岛^[11]。在mtDNA中CpG含量约为2.65%，缺乏CpG岛的存在，但整体的甲基化水平较低^[12]。

对人体mtDNA的分析表明，对不同的细胞和组织而言，线粒体内甲基化胞嘧啶的分布呈现出较为保守的分布模式，只有特定样本的部分区域出现了较大差异，显示出明显的时间和功能特征，如大脑和血液^[13]。对人类和小鼠血液细胞mtDNA的D-loop区的研究发现，DNA甲基化主要发生于重链的启动子区和保守序列区，其作用可能是调节线粒体DNA的复制或转录^[14]。令人意外的是，DNA甲基化的主要位点不是动物中常见的CpG二核苷酸，而是只有在植物和真菌中发现过的非CpG二核苷酸。在小鼠胚胎干细胞线粒体中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的失活将导致CpG序列的甲基化水平下降，但非CpG序列的甲基化水平则不受影响^[14]。

1.4 线粒体的DNA羟甲基化模式

虽然早在1972年就在哺乳动物nDNA中发现了5hmC的存在^[15]，但是其产生机制直到2009年才得以揭示。对小鼠脑组织的研究表明，TET（ten-eleven translocation）蛋白家族具有将5mC转化为5hmC的能力^[16]，其后5hmC将通过一系列途径被胞嘧啶取代，从而实现DNA的去甲基化过程。值得注意的是，5hmC的产生被认为是DNA氧化损伤的产物，与许多脑组织疾病的产生密切相关^[17]。对于线粒体而言，其DNA所处环境中活性氧自由基的含量较高，更易受到氧化损伤。对小鼠胚胎干细胞中的研究中发现，mtDNA中5hmC的密度要显著高于nDNA^[18]。在线粒体中，5hmC有可能作为5mC去甲基化过程的中间产物存在，从而和DNMT及TET蛋白一起，在基因表达调控过程中发挥重要作用^[14]。

2 线粒体DNA甲基化对于基因表达的调控 2.1 线粒体DNA的甲基化调控

在真核生物nDNA中，基因数目众多，表达状态复杂多变。对特定基因而言，可以通过改变启动子区CpG岛的甲基化状态来上调或下调其转录水平。而在mtDNA中，只有D-loop中含有启动子序列，其余绝大多数序列为编码序列，负责合成呼吸链的重要组分。因此，线粒体DNA的表达应与其甲基化状态密切相关，以应对细胞内部时刻变化的动力需求^[11]。除此之外，线粒体DNA甲基化模式的改变还将对重链和轻链的表达产生不同的影响。例如，mtDNMT1的过量表达将导致重链编码的ND1的表达上调，而与此同时轻链编码的ND6的表达则出现下调^[4]。

2.2 线粒体DNA甲基化的影响因素 2.2.1 营养

研究发现母体孕期低蛋白饮食将导致仔猪mtDNA的表观遗传改变，其中雄性仔猪mtDNA启动子区的胞嘧啶甲基化和羟甲基化水平下降，糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）与mtDNA启动子的结合能力上升，有趣的是，在雌性仔猪体内观察到了完全相反的结果，即mtDNA启动子区的胞嘧啶甲基化和羟甲基化水平上升，GR与mtDNA启动子的结合能力下降^[19]。因此，母体孕期的饮食情况可以通过GR对不同性别仔猪的氧化磷酸化基因产生不同影响。对于大黄鱼肝脏细胞mtDNA的研究也发现，橄榄油和紫苏油的摄入会对其甲基化状态产生影响，导致线粒体精氨酸tRNA及NADH脱氢酶亚基ND4L的甲基化水平上升^[20]。

2.2.2 环境污染物

研究发现金属离子会对成年男性白细胞层mtDNA的甲基化状态产生影响^[21]，镀铬工人体内较高的铬离子浓度也与其细胞mtDNA的甲基化水平出现明显的负相关^[22]，对从事特定工作的成年男性而言，工作环境空气中PM2.5水平与其血细胞中D-loop启动区的甲基化水平呈现正相关^[23]。对于围产期小鼠而言，环境中2，2'，4，4'-四溴联苯醚（BDE-47）的存在将对其后代脑细胞mtDNA的甲基化状态产生关联^[24]。对于妊娠期妇女而言，吸烟者的胎盘内相对mtDNA含量较低而mtDNA甲基化水平较高^[25]，而空气中PM2.5的含量也与妊娠期妇女胎盘中mtDNA含量成负相关而与mtDNA甲基化水平成正相关^[26]，因此环境因子对于孕期线粒体表观遗传状态会产生重要影响。

2.2.3 疾病

早有证据显示，mtDNA的甲基化状态与疾病的发生密切相关，这一现象在能量需求较高的器官如心脏和大脑中表现得尤为明显^[27]。有研究表明，在心血管疾病患者的血小板中出现了DNA甲基化水平升高的情况^[28]，也有研究发现，人脑内的mtDNA甲基化水平易受神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的影响^[29]。对耐胰岛素的肥胖患者^[30]及糖尿病视网膜病变患者^[31]的研究均发现，其体内线粒体D-loop区的甲基化水平出现了明显的升高，从而导致mtDNA转录水平的下调。对非酒精性脂肪性肝病患者的研究则发现，其肝脏的组织学损伤严重程度与mtDNA的D-loop区及COI编码区的甲基化水平呈现正相关^[32]。因此，线粒体的DNA甲基化状态可以发展为新一代的生物标记，用于特定疾病的检查和诊断工作^[33]。

2.2.4 衰老

在细胞衰老过程中，线粒体的数量和功能将发生明显改变，其中氧自由基对线粒体的损伤及mtDNA的突变有着重要的影响。在表观遗传调控方面，对4个月和24个月大的小鼠脑细胞mtDNA的研究表明，额叶皮层区域5hmC水平将随年龄的增长出现下降的趋势^[34]。另外，衰老还会影响到mtDNMT1及TET蛋白的合成。衰老过程中额叶皮层区域mtDNMT1的mRNA水平出现下降，而小脑区域TET2及TET3的mRNA含量出现上升，进而对5hmC的含量产生影响^[34]。人类衰老也会导致mtDNA中的D-loop^[8]及12S rRNA编码区^[35]的甲基化状态出现相应的改变。在哺乳动物的配子发育过程中，胚胎干细胞mtDNA通常表现为非甲基化状态而生殖细胞则出现了部分的甲基化^[36]。与卵母细胞相比，精子的线粒体中甲基化程度更高，对其中基因的表达起到了一定的抑制作用^[37]。

3 线粒体DNA的其他表观遗传机制 3.1 线粒体长链非编码RNA（Mitochondrial long noncoding RNA，mtlncRNA）

长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncR-NA）是一类长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码RNA。在真核生物中lncRNA的表达多数与发育过程密切相关，lncRNA可以通过与蛋白质特定位点或基因组中互补序列的结合来参与基因表达的表观调控^[38]。在线粒体中，也存在有mtDNA编码的lncRNA即mtlncRNA。研究发现，ND5、ND6和Cytb编码区的互补序列可以转录合成较高水平的lncRNA，这3种mtlncRNA可以与其互补的mRNA形成耐核糖核酸酶降解的双链结构，从而调控其表达水平^[39]。在不同的人体组织中，lncND5、lncND6和lncCytbRNA的丰度有明显不同。与位于相对链的mRNA相比，不同lncRNA的比值也不同^[39]。根据mtlncRNA的转录模板与临近的蛋白质编码基因之间的位置关系，可以将其分为正义线粒体非编码RNA（Sense mitochondrial noncoding RNA，Sncmt RNA）和反义线粒体非编码RNA（Antisense mitochondrial noncoding RNA，ASnc mtRNA）。研究发现，在不同来源的肿瘤细胞中，均出现了ASnc mtRNA表达下调的现象，而几个肿瘤细胞系中低拷贝的ASnc mtRNA的去除将会进一步导致细胞的凋亡^[40]。因此，线粒体基因表达的调控可能取决于特定细胞类型的需求，mtlncRNA可能在这一过程中起到了重要作用。

3.2 线粒体MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其主要作用是参与转录后的基因表达调控。在线粒体基质中，即存在有mtDNA编码的miRNA又存在有nDNA编码的miRNA。对于线粒体miRNA的生物信息学分析发现其靶序列与部分线粒体中的蛋白质编码序列相符，从而证明了其可能发挥的调控作用^[41]。一个尤为有趣的发现是在接受嗅觉辨别训练的小鼠的海马区域，一种由线粒体控制区的终止结合序列（Termination association sequence，TAS）负责编码的miRNA的丰度出现了明显的上升（超出对照组50倍）^[42]。由于TAS在DNA复制过程中的重要作用，因此这一过程中miRNA可能将小鼠的行为可塑性与线粒体的复制和蛋白质合成联系起来^[42]。目前，线粒体miRNA数据库的资料也在不断地积累过程中，据推测miRNA也可通过影响mtDNA转录物的活性来调节细胞生物能量的产生过程^[43]。

3.3 线粒体DNA结合蛋白

对于nDNA而言，组蛋白的翻译后修饰与染色体的重塑和功能状态密切相关，其中组蛋白的乙酰化与去乙酰化会对基因的活化与失活产生重要影响。在线粒体中，2011年发现了与DNA结合的蛋白质骨架的存在，其复合物的结构与功能类似于细菌的类核^[44]。有研究发现线粒体内同样存在有组蛋白去乙酰化酶SirT3，基因敲除SirT3，会导致线粒体内蛋白的高度乙酰化，进而影响线粒体的生物合成及氧化磷酸化进程^[45]。对于人类线粒体转录组的研究还表明，在线粒体基质中有DNA调控蛋白的存在^[46]。这些重要的发现表明线粒体中的基因表达存在复杂的调控机制，虽然目前相关研究还处于起步阶段，但mtDNA结合蛋白的修饰及其与mtDNA的相互作用也将成为表观遗传研究的重要组成部分。

4 展望 4.1 技术手段的完善

在mtDNA的相关研究中，技术上的难点之一是如何避免由nDNA的污染造成的实验结果偏差。因为在生物基因组的演化过程中，曾多次发生过线粒体基因转入细胞核的事件。这些基因片段在转入核后失去了功能，被命名为线粒体假基因（Nuclear mitochondrial sequences，Numts）^[47]。目前在许多基因组中已证实有Numts的插入，由于其失去了编码功能，因而整体呈现出比mtDNA更快的进化速率^[48]。由于传统实验方法很难将其与mtDNA区分，因此会使实验结果出现偏差。解决这一问题的方法包括：（1）选用含有线粒体但不含有细胞核的实验材料（如血小板）；（2）设计与mtDNA特异性结合的引物；（3）消除mtDNA提取物中nDNA的污染，但是这些方法要么限制了实验材料的来源，要么限制了PCR扩增的区域，要么对实验操作提出了极高的要求^[49]。目前有关细胞DNA提取物中纯mtDNA的提取方法还在不断地改良过程中，未来新方法应在降低实验难度、提高结果精确度等方面作出改善。

4.2 线粒体与细胞核之间的遗传调控关联

作为半自主遗传的细胞器，线粒体虽然具有独立转录和翻译的功能，但是却有超过1 000个线粒体蛋白质的编码基因在进化过程中被转移到了核基因组内^[50]，因此nDNA的遗传调控将对线粒体的基因表达产生较大的影响。另一方面，细胞内线粒体的移除也会使nDNA的甲基化状态发生极为显著的改变，这一改变是可逆性的，将线粒体重新导入细胞后又会发生甲基化状态的恢复^[51]。有研究发现，欧洲人群体的mtDNA可分为9个主要的单倍型（H、J、U、X、T、I、K、W和V），其中J型个体的nDNA甲基化水平要普遍高于非J型个体^[52]。种种迹象表明，mtDNA与nDNA的表观遗传调控机制之间存在复杂的联系，许多nDNA甲基化的影响因素如疾病、衰老及污染物等也在mtDNA中发挥作用。未来的研究将在mtDNA的表观调控机制及功能等方面作出进一步的探索，其与细胞核之间遗传调控的关联也将得到更深层次的揭示。