我国各类盐碱地面积约0.99亿hm², 盐渍化土壤面积约0.369亿hm², 残余盐渍化土壤面积约0.448亿hm², 潜在盐渍土化土壤为0.173亿hm^2[1]。利用盐生植物改良修复盐碱土具有投资少, 见效快的特点^[2]。但盐碱胁迫能造成植物体离子失衡和渗透胁迫, 研究植物耐盐机制, 筛选和培育抗盐植物品种, 提高植物本身的耐盐能力, 是改良和开发利用盐碱地经济而有效的方法^[3]。土壤中过高浓度的Na⁺会造成植物的生理干旱, 扰乱细胞的离子平衡, 导致膜功能失调和代谢活动的减弱, 从而抑制生长并最终导致细胞死亡^[4]。植物细胞抵御Na⁺毒害的主要策略有Na⁺外排和Na⁺区域化^[5], 其中Na⁺外排过程中, 质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白依靠质膜H⁺-ATPase形成的H⁺跨膜电化学势梯度为其提供驱动力, 将细胞质中过多的Na⁺外排, 从而减轻了Na⁺对细胞质内的各类代谢酶的伤害^[6][7]。

SOS(Salt overly sensitive)信号转导途径是植物耐盐性相关的重要信号转导途径之一。目前, 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)^[6]、互花米草(Spartina alterniflora)^[8]、胡杨(Populus euphratica)^[9]、海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)^[10]、獐茅(Aeluropus littoralis)^[11]、大叶补血草(Limonium gmelinii)^[12]、甘蔗(Saccharum hybrid)^[13]等植物上已成功克隆到SOS1基因, 并进行了耐盐功能分析。在拟南芥中, AtSOS1基因编码一个质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, C-末端为一长亲水性尾链, 位于胞质中, 作为感受器感知胞质中Na⁺浓度变化, 引发胞质Ca²⁺信号的产生, 随后Ca²⁺信号刺激SOS3-SOS2复合物激活SOS1, 将Na⁺排出胞外, 从而提高植物的耐盐性^[14-16]。拟南芥SOS1突变体对盐非常敏感, 过表达SOS1基因能提高其耐盐性, 盐胁迫下积累更少的Na^+[17], 表明SOS1基因在拟南芥耐盐性中发挥着重要作用。Yue等^[18]在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达拟南芥SOS1基因发现可提高耐盐性, 且转基因植株保持较高的K⁺/Na⁺。权庚等^[8]研究发现过表达互花米草SaSOS1基因的水稻(Oryza sativa)对盐胁迫具有较强的适应性, 表明转SaSOS1基因能提高水稻耐盐性。Wu等^[9]在胡杨中通过设计简并引物RACE技术克隆得到PeSOS1基因, PeSOS1在叶片中的表达明显受高盐胁迫(200 mmol/L NaCl)诱导, 并定位在细胞膜。但国内外尚未见黄花草木樨(Melilotus officinalis(L.)Lam.)MoSOS1基因的克隆和表达模式分析的报道。黄花草木樨为豆科草本植物具有抗旱、耐寒、耐盐碱、耐土壤贫瘠等的特性^[19], 适应性较广, 防风挡沙, 保持水土^{[20, 21]}, 还是一种优良牧草和优质绿肥^{[22, 23]}。本实验采用RT-PCR及RACE方法克隆黄花草木樨MoSOS1基因, 并分析其结构特征与表达模式, 为深入研究MoSOS1的功能特征奠定科学基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料

黄花草木樨种子由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。

1.1.2 主要试剂

TaKaRa MiniBEST Plant RNA提取试剂盒、Prime Script RTase第一链cDNA合成试剂盒、克隆载体pMD19-TVector、DNA marker、TaKaRa LA Taq试剂盒、大肠杆菌菌株Escherichia coli DH5α等购自大连宝生物工程有限公司, 其它生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 实验材料培养

用5% NaClO溶液将草木樨种子消毒5 min后, 于培养皿中发芽。待幼苗种子萌发后移至水培盒上, 于1×Hoagland营养液中生长, 间隔7 d更换一次Hoagland营养液, 光照周期为白天16 h/夜晚8 h, 昼夜温度分别为25℃和18℃, 光照强度为600 μmol·m^-2·s^-1空气相对湿度为60%左右。在人工气候箱中培育至6周龄后进行200 mmol/L NaCl盐胁迫处理。

1.1.4 引物设计和合成

使用Primer 5.0软件设计核心引物, DNAMAN 6.0软件进行3'及5'RACE引物设计、序列拼接和分析测序得到的基因序列, 引物由上海生工合成(表 1)。

1.2 方法 1.2.1 黄花草木樨MoSOS1基因的克隆

取6周龄的黄花草木樨幼苗, 用200 mmol/L NaCl溶液胁迫48 h, 诱导相关耐盐基因的表达, 采集植物鲜叶, 经无菌水冲洗数次至无盐分残留, 消毒滤纸吸干植物叶片表面水分, 称取100 mg装于1.5 mL RNase-free管中, 用宝生物MiniBEST RNA植物RNA提取试剂盒提取植物总RNA, 利用PrimeScriptTM RTase第一链cDNA试剂盒合成cDNA(大连TaKaRa公司)。

MoSOS1完整编码区的cDNA扩增, 先比较Gen Bank数据库中拟南芥SOS1基因序列(NM_126259.4)、大豆SOS1基因(NM_001258010.1) 及绿豆SOS1基因序列(KC855193.1) 同源保守序列, 根据保守同源序列设计简并引物：MoSOS1-F1/MoSOS1-R1。PCR扩增出MoSOS1的保守核心片段。扩增的保守核心片段cDNA插入到pMD19-T载体(大连TaKaRA公司), 由北京擎科生物技术公司进行测序。MoSOS1完整编码区cDNA的获得采用cDNA末端快速扩增法(Rapid amplification of cDNA ends, RACE), PCR扩增得到的目的基因片段, 通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 并用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver 4.0纯化试剂盒纯化回收DNA目的片段, 将回收产物连接到pMD19-T载体上后转化克隆并进行阳性菌株鉴定, 由北京擎科生物技术公司测序。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR

采用实时荧光定量PCR方法, 分析不同盐浓度(0、50、100和200 mmol/L NaCl)处理48 h后黄花草木樨地上部和根中MoSOS1基因的表达模式。盐处理下黄花草木樨地上部和根中的总RNA提取参照宝生物TaKaRa MiniBEST Plant RNA试剂盒说明书进行。cDNA第一链的合成按照Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行(宝生物工程有限公司)。黄花草木樨MoSOS1基因实时荧光定量RT-PCR引物SOS1F/SOS1R, PCR产物长度为168 bp, 其内参基因Actin实时荧光定量PCR引物ActinF2/ ActinR2, PCR产物长度为80 bp。

参照考宝生物SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书的方法, 在Step One Plus仪器上进行实时荧光定量PCR实验。反应体系：cDNA 1 µL, SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ 10 µL, ROX Reference Dye 0.4 µL, 正、反向引物分别为1 µL, 加水补至20 µL, 40个循环。采用2^-△△CT方法计算黄花草木樨基因MoSOS1在不同盐浓度胁迫下的相对表达量, 设置3次重复。

1.2.3 生物信息学分析

生物信息学分析方法如下。利用ORF finder在线软件, 对黄花草木樨MoSOS1基因进行开放阅读框分析并翻译；利用ExPASy中ProtParam pI/Mw(http://web.expasy.org/protparam/)在线工具对黄花草木樨MoSOS1基因所编码蛋白一级结构进行预测；利用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl)进行黄花草木樨MoSOS1二级结构预测；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/)进行黄花草木樨MoSOS1蛋白信号肽分析；用NCBI上Blast工具进行同源氨基酸序列查找, 并利用DNAMAN对所获得同源氨基酸序列以及鹰嘴豆SOS1、大豆SOS1等蛋白序列进行序列比对, 最后在MEGA6.0中采用NJ(Neighbor-Joining)法(Boot Strap 1000) 构建进化树。氨基酸序列跨膜预测在TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)网站上进行。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行MoSOS1保守区段预测。

2 结果 2.1 黄花草木樨MoSOS1基因的克隆

根据大豆(Glycine max)、绿豆(Vigna radiat)、拟南芥SOS1蛋白基因保守同源序列设计简并引物(MoSOS1-F1、MoSOS1-R1), 以黄花草木樨叶片总RNA反转录合成的cDNA为模板, PCR扩增出黄花草木樨MoSOS1保守核心cDNA片段, 经测序发现核心片段为369 bp(图 1-A)。用MoSOS1保守核心片段的已知序列, 设计引物进行3'RACE和5'RACE。3'RACE扩增产物经测序为3 074 bp(图 1-B), 5'RACE扩增产物经DNA测序为751 bp(图 1-C)。经DNAMAN软件序列拼接得到黄花草木樨MoSOS1的全长cDNA序列, 长度为3 931 bp(图 2)。根据MoSOS1拼接序列设计MoSOS1阅读框引物(MoSOS1-ORF-F1、MoSOS1-ORF-R1), PCR扩增出一条约3 000 bp的特异目的条带(图 3), 经克隆测序得到了黄花草木樨MoSOS1的开放阅读框(ORF)序列2 874 bp, 可编码957个氨基酸, 推测等电点为5.31, 分子量为112.8 kD。

2.2 黄花草木樨MoSOS1基因生物信息学分析 2.2.1 黄花草木樨MoSOS1基因编码氨基酸的一级和二级结构预测分析

通过在线工具ExPASy中ProtParam pI/Mw, 预测黄花草木樨MoSOS1基因编码蛋白质的一级结构显示, 该蛋白分子量为112.8 kD, 包含957个氨基酸残基。MoSOS1蛋白等电点(pI)为5.31, 有负电荷残基(Asp+Glu)102个, 正电荷残基(Arg+Lys)88个, 蛋白质三维结构不稳定系数(Ⅱ)为45.32, 平均疏水性(GRAVY)-0.000, 脂肪系数(AI)98.91。蛋白质不稳定系数大40, 蛋白质表现为不稳定状态。因此, 推测黄花草木樨MoSOS1基因编码的蛋白质为不稳定的酸性蛋白质。

MoSOS1蛋白二级结构预测在SOPMA在线(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl)预测, MoSOS1蛋白质二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲结构交错构成, 其中含α-螺旋43.68%, 延伸链12.96%, 无规卷曲43.36%(图 4)。

2.2.2 黄花草木樨MoSOS1蛋白信号肽预测和分析

根据SignalP 4.1 Server软件预测可知, 第20位谷氨酸残基具有较高的原始剪切分值0.509和最高的综合剪切位点分值0.298, 第1位甲硫氨酸残基具有最高的信号肽分值0.279。由于最后获得氨基酸残基的加权平均值较小, 为0.253, 推测MoSOS1基因所编码的蛋白不存在信号肽, 即为非分泌型蛋白, 说明该蛋白在细胞质合成后不能被转运(表 2)。

2.2.3 黄花草木樨MoSOS1蛋白的保守结构域预测及跨膜结构分析

NCBI保守结构预测表明, 黄花草木樨MoSOS1蛋白包含Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily和一个cNMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点及一个CAP_ED(Catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily(图 5-A)。运用在线分析软件TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/service/TMHMM/)分析目的蛋白的跨膜结构；发现MoSOS1含有8个跨膜区域, N、C端位于细胞外。多重序列比较表明, MoSOS1跨膜区氨基酸序列位置分别为5-27, 34-56, 61-78, 85-104, 119-141, 153-175, 190-208, 228-250(图 5-B)。

2.2.4 黄花草木樨MoSOS1蛋白的氨基酸序列多重比较分析

将推测的MoSOS1氨基酸序列与其它植物SOS1的氨基酸序列进行比较发现, 它与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、大豆(Glycine max)、绿豆(Vigna radiat)的同源性分别达到89%、84%和68%(图 6)。系统进化树分析表明, 黄花草木樨MoSOS1与鹰嘴豆和大豆亲缘关系最近, 而与山萮菜(Eutrema salsugineum)的亲缘关系较远(图 7)。由此表明MoSOS1是一类Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 与鹰嘴豆、大豆等的质膜SOS1具有相同功能。

2.3 黄花草木樨MoSOS1基因盐胁迫下表达分析

通过实时荧光定量PCR检测6周龄黄花草木樨幼苗盐胁迫48 h后MoSOS1基因的表达模式, 发现MoSOS1基因在根和地上部均有表达, 且表达量随着盐胁迫浓度的增加而有增加趋势。在100、150及200 mmol/L NaCl胁迫下, MoSOS1基因表达量要显著高于对照(P < 0.05), 且根部MoSOS1表达水平分别为地上部1.8、1.3和1.5倍(图 8)。由此表明MoSOS1的表达受盐胁迫诱导和调节, 且具有根部表达的特异性。

3 讨论

本文以RT-PCR及RACE方法, 成功克隆到黄花草木樨SOS1转运蛋白基因的cDNA, 其编码957个氨基酸, 同源比对结果显示MoSOS1蛋白与鹰嘴豆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源性最高, 达89%, 与大豆SOS1和绿豆SOS1的同源性分别达84%和68%, 说明SOS1蛋白在不同物种间具有较高的保守性。拟南芥SOS1蛋白C末端是调节活性的区域, 高度亲水, 其结构含有多个蛋白激酶作用位点, 参与钙调素的结合以及多种信号的启动反应^[24]。贾圆圆等^[25]研究发现刚毛柽柳(Tamarix hispida)ThSOS1蛋白C端具有一个较长的亲水性尾巴, 能够使SOS1与逆境相关调控因子发生互作, 从而适应盐渍环境。本实验也发现黄花草木樨MoSOS1蛋白C末端含有一个长的亲水性尾巴, 推测其能够与逆境相关调控因子发生互作, 从而调控细胞内的Na⁺含量。

Shi等^[6]研究发现拟南芥SOS1蛋白跨膜区与细菌、真菌质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白相似性极高, SOS1突变体对盐胁迫敏感, 系统发育分析表明SOS1是一类质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。Shi等^[17]经过酵母功能互补试验及SOS1-GFP定位证明拟南芥SOS1是质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。王澍等^[26]成功克隆到黄瓜(Cucumis sativus)SOS1基因全长cDNA, 亚细胞定位表明该蛋白存在于细胞膜上, 酵母功能互补试验显示CsSOS1参与Na⁺/H⁺的转运。系统发育分析显示MoSOS1氨基酸序列与高等植物中已知序列质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(SOS1)的同源性较高, 表明黄花草木樨MoSOS1是一类质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

刘峰等^[13]分析甘蔗SOS1蛋白二级结构发现该蛋白无规则卷曲所占比例最高, 为51.3%, 其次是α-螺旋占32.86%, 延伸链占15.84%, β-螺旋为0。郭庆水等^[27]分析木榄(Bruguiera gymnorrhiza)质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白二级结构发现其α-螺旋占50.13%, 无规则卷曲所占30.70%, 延伸链占13.96%, β-螺旋为5.2%。本实验分析表明黄花草木樨MoSOS1蛋白质二级结构与甘蔗SOS1及木榄SOS1蛋白类似, 主要由α-螺旋和无规卷曲结构交错构成, 其中含α-螺旋43.68%, 无规卷曲43.36%, 延伸链12.96%, β-螺旋为0%。此外, 刘峰等^[13]分析甘蔗ScSOS1蛋白包含CAP_ED(catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily和一个Crp domain(cAMP-receptor proteins), 含有一个ligand结合位点和一个cNMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点。王艳红等^[10]分析海滨锦葵耐盐基因KvSOS1蛋白发现其N-末端具有NhaP、Na⁺/H⁺ Exchanger、b_cpa1等保守结构域, C -末端有cNMP、Crp等保守结构域, 表明该基因属于Na⁺/H⁺转运蛋白家族成员。NCBI保守结构预测表明MoSOS1蛋白包含Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily, 一个cNMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点以及一个CAP_ED(Catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily, 说明MoSOS1与甘蔗ScSOS1和海滨锦葵KvSOS1蛋白具有相似结构, 属于Na⁺/H⁺转运蛋白家族成员, 参与细胞内Na⁺的调控转运。

程玉祥^[28]研究星星草(Puccinellia tenuiflora)质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1) 基因的克隆, 半定量RT-PCR分析表明PtSOS1基因表达明显受盐胁迫上调。郑琳琳等^[29]研究发现盐胁迫能诱导唐古特白刺(Nitraria tangutorum)质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白NtSOS1基因的表达。本实验发现黄花草木樨幼苗盐胁迫48 h后, MoSOS1基因在根和地上部均有表达, 且表达量随着盐胁迫浓度的增加而有增加趋势, 表明盐胁迫能上调MoSOS1基因的表达。Raquel等^[30]研究发现马铃薯(Solanum tuberosum)SOS1蛋白不仅具有Na⁺/H⁺逆向转运功能, 而且能调节植物不同器官间Na⁺分布。Yang等^[31]在拟南芥中过表达AtSOS1基因, 转基因植株能耐受200 mmol/L的NaCl处理, 且转基因植物木质部的Na⁺含量要明显低于非转基因植株, 说明SOS1蛋白在长距离的Na⁺运输中发挥作用。Shi等^[17]在拟南芥中过表达AtSOS1基因, 转基因植株上调SOS1基因的表达, 且盐处理下, 过表达SOS1基因植株在木质部蒸腾流及地上部积累更少的Na⁺, 且转基因植株提高耐盐性是通过限制Na⁺在细胞内积累, 从木质部吸收Na⁺, 从而降低地上部Na⁺含量。Guo等^[32]研究盐胁迫下野生型拟南芥和SOS突变体SOS1活性, 通过幼苗成像分析和电生理的研究, 表明SOS1具有在根部分生组织和茎维管束薄壁细胞表达的特异性, SOS1参与盐胁迫下Na⁺外排作用。本实验发现MoSOS1具有根部表达的特异性, 根部MoSOS1表达水平高于地上部。这可能是由于根部分生组织没有液泡, 盐胁迫下不能进行Na⁺区隔化^[33], 根部组织只有通过上调MoSOS1基因的表达, 将进入根系的Na⁺及时排除体外, 从而维持植株根系较低的Na⁺含量；另一方面, 有利于将木质部蒸腾流中的Na⁺及时吸收以减少地上部Na⁺含量, 从而维持植株地上部较低的Na⁺含量。

4 结论

黄花草木樨具有较强的抗旱耐盐性。本实验从黄花草木樨中成功克隆到MoSOS1基因, ORF 2 874 bp, 编码957个氨基酸。MoSOS1蛋白与鹰嘴豆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源性高达89%, 与大豆SOS1和绿豆SOS1的同源性分别达84%和68%。实验结果还表明在NaCl胁迫下, MoSOS1基因表达具有组织特异性, 根中表达量大于地上部, 在黄花草木樨耐盐分子机制中发挥作用。