黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是目前发现的寄主范围和分布最广、危害最严重的病毒之一，能侵染85科365属1 000多种植物[1]，通过蚜虫、种子、菟丝子和汁液摩擦接种等多种途径传播[2]。
CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，基因组为三分体单链正义RNA[1]。RNA1编码1a蛋白；RNA2编码2a蛋白，其亚基因组RNA4A编码病毒沉默抑制子2b蛋白[3, 4]，1a和2a蛋白均参与病毒的复制[5, 6]；RNA3编码3a移动蛋白（Movement protein，MP），参与病毒移动[7, 8]，其亚基因组RNA4编码外壳蛋白（Coat protein，CP），决定病毒粒子的移动及病毒的蚜传活性[9, 10]。CMV依据基因组RNA3的5'端非编码区和CP基因序列，划分为CMV Ⅰ和CMV Ⅱ组[1]。CMV Ⅰ进一步划分为CMV IA和CMV IB亚组，其亚组间核苷酸序列相似性为92%-95%[11]。有些CMV还携带基因组大小为332-405 nt单链、线状卫星RNA（Satellite RNA，satRNA）[12]。
CMV在我国新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等蔬菜中均有发生，且不同寄主的CMV均归为CMV IB亚组，然而辣椒的CMV在血清学和CP序列中存在较大的变异[13-15]。目前，不同地域的西番莲、加工番茄、烟草等植物中的CMV分离物的CP基因通过原核表达，制备了高特异性抗体，从而为快速地检测不同地域、不同寄主中的CMV奠定了基础[16, 17]。因此本研究从感染CMV的辣椒中提取dsRNA，利用RT-PCR技术克隆了RNA1、RNA2、RNA3全基因组片段，并通过原核表达CP基因制备基因工程多克隆抗体，以期为我国新疆CMV高效、快速血清学检测提供保障。
1 材料与方法 1.1 材料2012年从石河子蔬菜研究所采集感染CMV，编号为LJ-10辣椒样本提取dsRNA[18]。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3），原核表达载体pET-22b为本实验室保存。
1.2 方法 1.2.1 引物根据GenBank登录CMV株系或分离物序列设计引物，由上海生工生物技术有限公司合成（表 1）。
从LJ-10样本上提取的dsRNA为模板逆转录合成cDNA，具体反应体系为：dsRNA 3 μL、随机引物2 μL、DEPC-H2O 5 μL混匀，95℃ 10 min，立即冰浴2-5 min。继续加入5 μL 5 × AMV buffer、0.3 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、0.7 μL AMV（10 U/μL）、3 μL 2.5 mmol/L dNTPs、6 μL DEPC-H2O，为25 μL体系。混匀，42℃ 60 min，最后70℃ 15 min，-20℃保存备用。
以cDNA为模板进行PCR扩增，回收、纯化预期大小的PCR产物后，连接至pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB（含50 μg/L氨苄青霉素）培养基上37℃培养14-16 h，挑取单菌落，提取质粒DNA，酶切鉴定重组质粒正确后，由上海英骏生物技术有限公司北京测序部公司进行序列测定。
1.2.3 序列分析用DNASTAR软件进行序列相似性比较，用遗传进化分析软件MEGA5.0邻接法（Neighbor-Joining）计算序列间的遗传距离。Bootstrap为1 000重抽样统计评价各枝的置信度，同时，进化树构建中引入花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）ER（U15730）株系为外群。所用分离物如下：CMV亚组IA：Fny（D00356、D00355、D10538）；Leg（D16403、D16406、D16405）；Mf（AJ276479、AJ276480、AJ276481）；Y（D12537、D12538、D12499）；O（*、D10209、D00385）。CMV亚组IB：Nt9（D28778、D28779、D28780）；Tfn（Y16924、Y16925、Y16926）；IX（U20220、U20218、U20219）；SD（AF071551、D86330、AB008777）；IA（AB042292、AB042293、AB042294）；Phy（DQ402477、DQ412731、DQ412732）。CMV亚组Ⅱ：Q（X02733、X00985、M21464）；Ly（AF198101、AF198102、AF198103）；S（Y10884、Y10885、U37227、AF063610）；LS（AF416899、AF416900、AF127976）；Trk7（AJ007933、AJ007934、L15336）。
1.2.4 原核表达蛋白纯化与多克隆抗体制备根据辣椒上获得的CMV RNA3序列设计合成CMV S/CMV A引物，扩增CP基因，之后利用Noc I/BamH I双酶切，将LJ-10 CP基因重组到原核表达载体pET-22b，构建重组质粒pET-CMV CP，转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，以空载体pET-22b为对照，37℃ 1 mmol/L IPTG诱导2-6 h，经SDS-PAGE检测蛋白表达。按照Novagen公司的Ni NTA His-bind resin亲和柱洗脱目的蛋白，生理盐水透析，冷冻干燥。将纯化后的抗原按照常规方法免疫4只4个月大、2.1 kg健康新西兰雄性大白兔，免疫4次后取抗原，亲和纯化分离血清，-20℃保存。
1.2.5 多克隆抗体效价测定与Western-blot分析取0.1 g样本新鲜嫩叶加入10×体积的缓冲液（PBST + 2% PVP）充分研磨，离心后的上清为抗原，以制备的CMV多克隆抗体为一抗，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG为二抗，进行间接ELISA，用酶标仪在波长为405 nm处读取吸光度值，P/N≥2视为阳性样品。
为进一步验证所制备的CMV抗体的有效效价，以本文制备的CMV CP基因的多克隆抗体为第一抗体，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，以NBT和BCIP为显色底物，取0.1 g已用间接ELISA方法检测含有CMV病毒的植株叶片，用液氮充分研磨，加10×总蛋白提取液（0.5 mol/L Tris-HCl pH8.0+4% β-巯基乙醇+ 40%蔗糖+0.2% SDS）充分混匀，冰浴30 min，4℃ 10 000 r/min离心20 min，取上清，用于蛋白质印迹检测。
2 结果 2.1 CMV基因组结构分析以从辣椒上提取的dsRNA为模板，利用RT-PCR和TA克隆技术获得辣椒LJ-10的CMV全基因组序列。其中RNA1长3 357 nt，内含1a ORF（97-3 075，2 979 nt），推导编码993 aa的1a蛋白；RNA2长3 042 nt，内含2a ORF（76-2 649，2 574 nt）和2b ORF（2 411-2 743，333 nt），分别推导编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白；RNA3长2 212 nt，内含3a ORF（122-958，837 nt）和CP ORF（1 257-1 910，654 nt），分别推导编码279 aa的3a蛋白和218 aa的CP蛋白。
2.2 CMV基因组序列分析CMV LJ-10基因组序列与GenBank上登陆的CMV亚组IA、亚组IB、亚组Ⅱ不同分离物构建系统进化树。RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a、CP系统进化树和序列相似性分析结果（图 1）显示，LJ-10属于CMV亚组IB。
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| 图 1 CMV 1a（A）、2a（B）、2b（C）、3a（D）和CP（E）核苷酸序列系统进化树 绿色指定的菌株来自CMV亚组IA，蓝色指定的菌株来自CMV亚组IB，红色指定的菌株来自CMV自亚组Ⅱ |
进一步将CMV LJ-10与CMV亚组IB 6个分离物进行序列比较发现，LJ-10 RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a与SD（中国，烟草）分离物序列相似性较高（表 2），亲缘关系较近在系统进化树上处于一个分支（图 1-A、B、C、D）。
LJ-10、IA（日本，未知）、IX（美国，番茄）3个分离物的CP核苷酸序列相似性较低，为92.2%-93.3%；与其他SD、Phy（中国大陆，不详）、Nt9（中国台湾，不详）、Tfn（意大利，番茄）4个分离物的相似性也较低，为92.7%-93.9%；SD、Phy、Nt9、Tfn 4个分离物间相似性较高，为94.7%-99.7%（表 2）。以CP核苷酸序列构建的系统进化树上LJ-10与SD分离物的亲缘关系较远，与IX、IA亲缘关系较近处于一个分支（图 1-E）。
CMV LJ-10的1a、2a、2b、3a、CP氨基酸序列比对与系统进化树分析结果与核苷酸序列分析结果基本一致。
2.3 CMV CP原核表达蛋白的多克隆抗体制备构建重组质粒pET-CMV CP 37℃ 1 mmol/L IPTG诱导2-6 h获得分子量约为27 kD与预期目的大小一致的重组表达蛋白（图 2）。CMV CP蛋白长218 aa，推导编码大小约24 kD蛋白质，本文使用Noc I/Bam HI双酶切将CMV CP基因构建至原核表达载体pET-22b，获得重组质粒pET-CMV CP。即CMV CP蛋白融合pET22b载体C端含6个His标签的21 aa，所以实际表达蛋白大小约为27 kD。
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| 图 2 CMV CP表达产物的SDS-PAGE分析 M：蛋白质分子量标准；1：pET-22b未经IPTG诱导的总蛋白产物；2：pET-22b经IPTG诱导的总蛋白产物；3：pET-CMV CP未经IPTG诱导的总蛋白产物；4：pET-CMV CP经IPTG诱导的总蛋白产物 |
将CMV CP原核表达重组蛋白纯化后免疫兔子制备多克隆抗体。以未免疫的兔血清为对照，采用常规间接ELASA法测定，制备的抗血清可与0.2 μg/孔纯化抗原有很强的特异反应。
2.4 CMV多克隆抗体的效价分析2015年7-8月，从石河子蔬菜花卉研究所和石河子大学北区试验田采集辣椒和加工番茄样本，以本实验制备的CMV抗体为一抗，间接ELISA可有效检出CMV，辣椒和加工番茄上CMV的检出率分别为54.1%（13/24）和60%（6/10）。
为了进一步验证ELISA实验结果的准确性，将ELISA检测为阳性的辣椒和加工番茄样品提取的总蛋白为抗原，进行Western-blot检测，结果同样显示与预期大小一致的大小约24 kD蛋白质（图 3和图 4）。间接ELISA和Western blot分析结果显示，本文制备的CMV抗血清1﹕500-1 000稀释均可有效地检测新疆辣椒和加工番茄上CMV。
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| 图 3 感染CMV的辣椒叶组织的Western blot特异性检测 M：蛋白质分子量标准；1：健康辣椒叶组织；2-4：感染CMV的辣椒叶组织 |
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| 图 4 感染CMV的加工番茄叶组织的Western blot特异性检测 M：蛋白质分子量标准；1：健康加工番茄叶组织；2-4：感染CMV的加工番茄叶组织 |
CMV是迄今已知病毒中寄主范围最广泛的病毒，具有高度变异性和强适应性，在寄主上产生花叶，矮化，厥叶，褪绿，过敏性坏死等症状，这些症状大多以混合性出现，在新疆CMV也常与其它病毒混合侵染[19]，产生多种不同的症状[20]。通常CMV亚组I引起较严重的坏死、失绿、矮化或蕨叶等症状，而CMV亚组Ⅱ只引起较温和的斑驳和花叶症状，并在接种叶上产生蚀纹斑[1, 21-22]。已报道CMV亚组IA和CMV亚组Ⅱ在全世界范围内都有分布，而CMV亚组IB主要在亚洲地区，且CMV亚组IB的变异率高于CMV亚组IA和CMV亚组Ⅱ变异率[11]。
新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等等不同寄主植物上的CMV均归为CMV IB亚组，使用从美国NEOGEN生物技术有限公司购买的CMV Ⅰ型抗体可以有效检测番茄、南瓜等寄主上CMV，然而从新疆石河子蔬菜研究所蔬菜种子繁育基地上采集的辣椒样品上其检出率极低，在加工番茄上也存在漏检的现象[15]。酶联免疫吸附法（Enzyme linked immol/Lunosorbent assay，ELISA）是目前应用非常广泛的适用于大田大量样品病毒病的快速检测的免疫学方法，利用病毒外壳蛋白制备基因工程抗体，已广泛应用于CMV抗血清的制备[16]。
CMV是新疆加工番茄、辣椒等经济类蔬菜上危害最严重的病毒[23-25]，因此本文从美国NEOGEN公司CMV Ⅰ型抗体血清学检测为阴性的新疆石河子蔬菜研究所采集辣椒LJ-10克隆、分析了CMV全基因组序列，并以其CP基因制备了多克隆抗体，为新疆CMV检测、预防及研究病毒与寄主互作奠定了基础。
4 结论序列分析及系统进化树结果表明，新疆辣椒LJ-10 CMV分离物属于CMV亚组IB；成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体，制备了相应的多克隆抗体，抗血清效价为1:500-1 000，能够有效的用于新疆辣椒和加工番茄的检测。
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