自1892年发现第一种植物病毒病——烟草花叶病^[1]，至今已报道了600种以上的病毒种类^[2]。植物病毒病给世界各地带来重大经济损失，据统计，全世界仅粮食作物每年因病毒病导致的损失高达200亿美元，经济作物因病毒病造成的损失，每年高达600亿美元^[3]。常见的病毒有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、黄瓜花叶病毒（Cuc-umber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）^[4]。植物病毒分布广、繁殖快、防治难，有植物“癌症”之称。病毒可通过螨类、线虫^[5]和真菌^[6]等介体传染和嫁接、汁液等无介体传染，尤其是近年来由褐飞虱（Nilaparvata lugens）传播的水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus，RDV）^{[7, 8]}和由烟粉虱（Bemisia tabaci）传播的TYLCV^[9]危害更为严重。病毒侵入寄主植物，在寄主细胞内完成自我复制后转运其他组织，最后使整株植物发病。病毒在植物体内主要有两个转运途径：通过胞间连丝在相邻细胞间的短距离胞间运动（Cell-to-cell movement）和通过维管束组织的长距离转运（Long-distacne systemic transport）^[10]。病毒能破坏细胞的代谢活动，引起植物的生理变化，常常表现出变色、坏死、畸形、皱缩、蕨叶、曲叶、卷叶、缩节、不孕、植株矮小、节间短、密集和果实畸形等，严重时可影响植物的生长和发育，降低作物的产量和质量，甚至使植物死亡。在大田作物、十字花科植物、茄科植物和果树上发生的病毒病逐年加重，并且有多种病毒复合侵染的现象。尤其对于百合、藏红花^{[11, 12]}、草莓、甘薯及菊花^{[13, 14]}等无性繁殖的植物来说，植株体内病毒随着栽培时间的延长而不断积累，导致品种退化、品质下降，严重影响经济效益。病毒病危害巨大，病毒的分离、鉴定及高效检测尤为重要。本文总结了植物病毒的检测方法、脱毒方法，认为传统的检测技术与当前的分子生物学技术结合能有效的检测病毒种类，种苗脱毒体系的建立是推广健康优质种苗行之有效的方法。

1 植物病毒病检测方法 1.1 生物学检测方法

生物学检测方法是根据寄主植物受病毒侵染后所产生的特异性症状来鉴定病毒病的一种方法^[15]。指示植物主要有两种：草本指示植物和木本指示植物。草本指示植物主要有藜科、茄科、豆科及葫芦科，通常情况下采用汁液摩擦接种法^[16]。吴凌娟等^[17]用指示植物千日红（Gomphrena globosa）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）等鉴定PVX；李春敏^[18]用黄瓜为指示植物鉴定核果坏死环斑病毒（PNRSV）。木本指示植物有GF305桃苗、白普贤樱花^[18]，使用最多的是双重芽接法^[19]，苹果潜隐病毒的常规检测主要是木本指示植物检测法^[20]。在接种病毒时选择健壮的指示植物，接种过程在防虫网下进行。该法受检测速度较慢，灵敏度较低，季节限制等因素影响，应用局限性较大。

1.2 电子显微观察法

1939年Kausche等^[21]首次用电子显微镜观察到了烟草花叶病毒的长形病毒粒子，开启了植物病毒病研究的序幕。电子显微观察是直接通过扫描电镜、透射电镜观察病毒粒子的形态结构以及病毒侵染寄主所引起的细胞显微结构的变化，检测方便、快速。观察病毒常用到的方法是负染色电镜法、超薄切片法。韦石泉等^[22]用负染色技术电镜观察，结果表明可检测出线条状和杆状病毒，如芜菁花叶病毒（TuMV）较为有效，但检测球形和短杆状病毒，如CMV甚为困难。谢礼等^[23]选取病叶做超薄切片电镜观察，结果发现蚕豆叶肉细胞产生严重病理变化，病变细胞线粒体增生和聚集，形状畸变，体积增大。不过近些年来建立了免疫吸附和修饰、免疫胶体金标记^[24]、图像分析等一整套病毒电镜检测研究方法，将免疫电镜新技术应用于检测蔬菜、花卉等作物的病毒病，首次报道了番茄花叶病毒（ToMV）的细胞病理学、葡萄扇叶病毒（GFLV）的细胞病理学^[25]，以及运动蛋白细胞定位和TuMV破坏光合作用的机制^[26]。

1.3 血清学方法

血清学方法现在被广泛应用于植物病毒的检测上，该法的原理是将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来。血清学方法主要有沉淀反应、琼胶扩散法、凝集反应、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、斑点免疫结合法等。其中酶联免疫吸附法最早是由Clark和Adnm于1977年提出的，现在已广泛应用到了各个领域，可检测豆类植物上TMV、大豆花叶病毒（SMV）、CMV、苜蓿花叶病毒（AMV）4种不同形态、不同分类组群的病毒^[27]。ELISA可以检验出单粒种子中携带的病毒，且能灵敏检验出种子不同部位如大豆的种皮、种胚、胚乳及胚根中的病毒。1982年，Hawkes等建立了点免疫结合测试技术（Dot immunobinding assay，DIA），用硝酸纤维素膜代替酶标板，使检测更为简便、快速、经济^[28]。1985年，Hibi等^[29]利用这种方法检测TMV获得了较为理想的结果。此后DIA进一步改良，发展了直接法、间接法及双抗体夹心法等检测方法，目前广泛应用于TuMv、SMV、CMV^[28]、斑豆花叶病毒（CpMV）、芋花叶病毒（DMV）、柑桔速衰病毒（CTV）^[30]和TYLCV^[31]等病毒的检测。血清学检测具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、花费少等优点，但对一些病毒含量低和含有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结果。同时也有一些病毒不能用血清学检测，血清学检测病毒是以病毒的外壳蛋白的抗原性进行检测的，而类病毒没有外壳蛋白，还有一些病毒在某些情况下缺乏外壳蛋白，因此不能用血清学方法检测^[32]。

1.4 分子生物学检测

通过分子生物学技术检测样品中是否有病原微生物的核酸，从而可以特异地判定采集样品中是否有相应的病原微生物。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应。其中核酸杂交和PCR技术以特异、快速、敏感的优点适用于样品的检测中，是当前应用较广泛的技术。在果树上，RT-PCR已被用来检测李痘病毒（PPV）、樱桃坏死锈斑驳病毒（CNRMV）、樱桃病毒A（CVA）^[33]、苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）^[34]和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）^[35]等。高雅红等^[36]建立了PPV的荧光定量RT-PCR检测方法。在RT-PCR的基础上衍生出一些新的技术如基因芯片、巢式RT-PCR、半巢式RT-PCR等。此外，陈定虎等^[37]采用RT-PCR方法结合纳米磁珠技术来检测PPV，结果表明该技术不仅能够检测到极低浓度的病毒，而且操作简单快速。逆转录环介导等温扩增技术（Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）作为近几年新发展的扩增方法，将反转录与核酸扩增同时进行，而且采用恒温扩增的方法，不仅省去了反转录的时间，更缩短了核酸扩增所用时间，具有检测速度快、灵敏度高及不需要昂贵的循环扩增仪器等优点，应用于多种动物病毒^[38]和植物病毒的检测，张雯娜等^[39]利用该技术快速检测SMV，丁小兰等^[40]建立了马铃薯帚顶病毒（PMTV）的RT-LAMP检测方法。从核酸的水平来检测病毒比血清学方法灵敏度更高，特异性更强，检测病毒的范围更广，可以克服血清学检测法和其他检测方法中的一些缺点，可以进行大批量的样本检测^[32]。但是，对不同的寄主植物、不同的病毒种或株系（分离物），各种方法的检测灵敏度各不相同，需在多次实验过程中找到最佳的方法。

2 脱除植物病毒的方法 2.1 茎尖组织培养脱毒法

茎尖培养脱毒是利用病毒在植物组织内分布不均匀的特点，在植物生长、分裂最为旺盛的地方，其含有的病毒颗粒相对较少，又因为病毒在植物体内随维管系统迁移，在茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒通过胞间连丝传递比较慢，而细胞分裂速度快，所以茎尖生长点部位几乎没有病毒，并且植物分生组织内含有较高的内源激素，可能对病毒的复制起到抑制作用。因此，可选用茎尖作为脱毒培养的材料。1952年法国的Morel等^[41]将带病毒的大丽菊茎尖切离培养，获得脱毒植株。1962年Belkengren和Miller^[42]首先用组织培养的方法获得了草莓无病毒苗，毛碧增等^[43]采用“多重分步法”脱毒方法获得了草莓脱毒苗，并建立了脱毒种苗的繁育体系，通过剥取0.5 mm的草莓苗茎尖，脱毒率可达到100%，脱毒原种苗繁殖系数为1:375，抗病性提高，田间生长旺，增产显著。高慧卿等^[44]对初代培养的百合无菌苗进行茎尖脱毒实验结果表明，CMV的脱毒率可达到82.29%。Kawarabayashi等^[45]利用茎尖脱毒法获取无LSV、CMV的植株和种球，有效的消除了病毒危害的现象，促进百合生长。平培元等^[46]报道了利用茎尖脱毒方法获得了杭白菊无毒苗的再生植株。同时，剥离茎尖的大小已成为脱毒是否成功的关键所在。切取茎尖的长度原则上是0.1-1 mm，若茎尖长度过小则不易成活，过大脱毒效果不好。何欢乐等^[47]相关分析结果表明，在相同的培养基上，茎尖越小成活率越低，茎尖越大成活率越高，大小为0.2 mm的茎尖成活率为16.67%，电镜下未检测到病毒粒子；大小为1 mm的茎尖成活率为83.33%，电镜下检测到7个病毒粒子，试管苗出现皱缩现象。刘辉辉^[14]选取0.3-0.5 mm杭白菊茎尖接种到适宜培养培养基中，结果发现脱毒的杭白菊的株高、茎粗、有效花朵数、分支数等性状与未脱毒的杭白菊存在显著差异。何新民等^[48]研究表明，以‘红姑娘2号’甘薯为材料，当剥取的茎尖为0.3-0.5 mm时，脱毒率为100%；茎尖为0.6-0.8 mm时，脱毒率为93.3%。茎尖脱毒实验中剥取的茎尖大小也与病毒种类有关，马铃薯S病毒（PVS）和PVX病毒离生长点很近，茎尖剥取长度须在0.2 mm以下，PVY离生长点较远，茎尖可切取0.3-0.5 mm，通过剥取合适的茎尖长度对提高脱毒效果有明显作用。

不同材料的茎尖剥取与脱毒率有关，黄远新等^[49]对带有甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）的‘渝薯2号’进行实验，结果发现切取叶原基处于突起态、半闭合态和闭合态0.22-0.35 mm大小的茎尖时，最终的脱毒效果差异显著，获得脱毒率分别为100%，83.9%和71.9%。赵军良^[50]发现选取0.2-0.5 mm带有一个叶原基的茎尖，脱毒效果最好，成活率也最高，经在田间用指示植物初步检测得知，脱毒率达到95%以上。病毒的复合侵染也会影响脱毒效果，单一病毒侵染植株，采用茎尖组织培养法较容易获得无毒的组培苗，若两种或两种以上的病毒复合侵染植株时，只采用茎尖脱毒法无法得到完全脱毒的组培苗。茎尖培养的过程中，会出现褐化、玻璃化、外植体污染等问题，选择适宜的消毒时间、适宜的培养基都是获得脱毒苗的关键。

2.2 热处理结合茎尖培养脱毒法

热处理脱毒法是利用高温可使蛋白质变性，从而使病毒钝化的原理。热处理的材料可以是已经长芽的茎块，也可以是组培瓶中长到约1 cm的小植株^[51]，将其在一定的温度下进行培养，使植株在此温度下的生长速度快于病毒的复制速度，切取不含有病毒的茎尖接种到适宜的培养基中，最终获得脱毒苗。热处理时的温度及处理时间的长短都应慎重选择，时间过长，会杀死芽眼，还可能对植物组织造成不良影响；时间过短达不到预期的脱毒效果，且热处理的温度和时间要基于不同病毒的钝化（致死）温度，TSWV致死最低温度为45℃，而TMV钝化温度超过90℃，大多数植物病毒的钝化温度在55-70℃之间^[3]。唐菖蒲茎尖组织于42℃处理5 d，脱除病毒的效果最佳^[52]。37℃恒温热处理30 d后ACLSV的脱除率为100%^[53]。Previati等^[54]sup>用热处理方法（20-30℃处理12 d或者在30℃处理18 d）去除菊花B病毒（CVB），采用ELISA方法进行检测，得到10%的脱毒植株。王莉等^[55]将草莓苗置于37-40℃培养4周，结果表明热处理与茎尖培养相结合可使草莓病毒脱除率达到72.7%-100%，效果稳定，是较为理想的脱除技术。何欢乐等^[38]通过二次脱毒法、改良热处理+茎尖培养法、冷处理+茎尖培养法进行草莓的脱毒，结果发现改良热处理（40℃水浴处理4 h）+茎尖培养法，茎尖成活率高达47.37%，脱毒率达到了100%，试管苗没有出现皱缩现象。赵霜^[56]采用茎尖脱毒法、化学脱毒法和热处理结合茎尖脱毒法对菊花体内的3种病毒（CVB、CMV和TMV）进行脱毒，结果发现热处理结合茎尖培养法的脱毒效果最佳，脱毒率达到94%。

近几年还发展出了变温处理结合茎尖培养来提高外植体成活率和脱毒率的方法。暗培养条件下变温热处理（38℃/32℃）适合大多数品种和砧木脱除苹果潜隐性病毒^[57]。经变温热处理比恒温热处理脱毒率高。热处理结合茎尖培养脱毒法一方面不存在消毒问题，使茎尖培养的存活率上升，可较少污染率；另一方面，解决了常规茎尖培养脱病毒所需的较小茎尖带来的操作困难和成活率较低的问题。

2.3 化学脱毒法

化学脱毒法是选用一些抗病毒药剂，通过将这些药剂加入到培养基中去除病毒，可显著提高无病毒植株的几率。其作用机理主要为竞争寄主细胞表面受体、阻碍病毒穿入脱壳、阻碍病毒生物合成和提高寄主抗病能力4种方式^[11]。常用的病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氢尿嘧啶（DHT）、双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）、放线菌素、碱性孔雀绿及环乙酰胺等，其中病毒唑是广谱性的抗病毒药物。采用化学脱毒方法，较容易脱除多种病毒，并且这种方法对取材要求不严，接种茎尖长度可大于1 mm，易于分化出苗，提高存活率^[58]。刘卫平等^[59]通过添加抗病毒药剂成功地脱除PVX。谢嘉华等^[60]研究表明，病毒唑对CMV、PVX、TMV等多种病毒的增殖有抑制作用，最终提高脱毒苗的产量。不同的抗病毒的药剂所达到的脱毒效果不同。Sharmas等^[61]采用化学脱毒与茎尖培养法脱除柑橘环斑病毒（ICRSV），结果发现25 mg/L的病毒唑脱毒率为37%，25 mg/L无环鸟苷（ACV）的脱毒率为20.8%，叠氮胸苷和DHT对ICRSV无脱毒效果。病毒脱除效果与抗病毒药剂处理时间有关，20 mg/L病毒醚处理时间由30 d延长至40 d后进行超低温处理，‘丰水’和‘美人酥’的ASGV脱除率分别由84.6%和60%提高至90%和80%^[62]。

化学脱毒法使用方便，操作简单，适用于病毒的大面积防治，对于病毒的复合侵染有明显的抑制作用，可以同时去除多种病毒。不足之处是，化学试剂可能会对环境造成危害。

2.4 超低温保存结合茎尖培养脱毒法

近年来，在植物超低温保存的过程中发现经过处理的植株体内的病毒量降低，甚至有些材料没有发现病毒的存在，之后被人们作为一种脱除病毒的方法。该脱毒法原理是含有病毒的顶端细胞液泡内含有大量的水分，在超低温（-80℃以下）保存过程中易形成水晶致死，而增殖较快的分生组织细胞胞质浓，含水少，因而在低温保存的过程中不易致死，最终能获得脱毒的植株。常用液氮做冷源。Brison等^[63]采用超低温保存结合茎尖离体培养方法使李属根状茎上的PPV的脱毒率达到50%，比单纯的茎尖培养的脱毒率多了近2倍，开创了超低温脱毒法。王壮伟^[64]采用超低温玻璃化结合茎尖培养获得了70%无苹果潜隐性病毒的植株。白建明等^[65]用超低温保存法和常规方法（茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养）来去除马铃薯试管苗中马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）和PVX，结果发现4种方法都可以去除PVX，其中超低温保存法的脱毒率最高，为59.13%。

该法的显著特点是脱毒率高，能同时处理大量材料，能够排除切取茎尖过程的操作问题，不需要昂贵的仪器设备，短时间内就可以生产出无毒植株，然而不足之处是其存活率较传统脱毒方法低，具体操作步骤繁琐，影响最终脱毒效果的因素较多。不同材料低温保存的温度仍需要通过大量的实验的摸索，低温引起的表观遗传现象尚需进一步研究。

2.5 组织培养脱毒法 2.5.1 愈伤组织培养脱毒法

愈伤组织培养脱毒法是通过选择适宜的外植体来诱导产生愈伤组织，然后愈伤组织再分化进而形成完整的再生植株。选择愈伤组织脱毒法是因为愈伤组织内病毒的复制速度慢于细胞的增殖速度，又或者是因为其中的有些细胞通过突变获得了抗病毒能力^[66]。该方法的外植体一般选为根、茎、叶等营养器官。许莉萍等^[67]用甘蔗心叶愈伤组织培养，最终发现花叶病的发病率为0%。在剪切外植体时，一方面要保证愈伤高诱导率，又要注意伤口破坏程度最小，减少酚类物质流出，减轻褐化程度。

2.5.2 花药培养脱毒法

该方法的外植体一般为花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。外植体需要一个脱分化形成愈伤组织的过程，愈伤组织经过再分化，形成丛生芽或产生胚状体，然后诱导长根，形成完整再生植株。覃兰英等^[68]最早通过花药愈伤组织诱导再生植株的途径，培育了‘因都卡’、‘达娜’等品种的花药脱毒苗。曹有龙等^[69]取4种供试品种4-5 mm花蕾诱导形成愈伤组织，最终结果表明花药培养脱毒率平均为73.5%。利用花药培养脱毒法，获得的草莓脱毒苗长势强，品质明显提高，产量较未脱毒草莓提高20%-45%^[70]。高庆玉等^[71]选取花药、幼叶和茎尖愈伤组织作为外植体接种在培养基中，以获得最终的完整植株，结果表明花药培养获得的植株脱毒效果最好，达到100%，而幼叶和茎尖愈伤组织培养的脱毒效果只有20%。花药培养脱毒法提高了脱毒率，降低了脱毒苗生产成本。但与茎尖分生组织培养相比，花药诱导分化成苗率低，培养周期长，不利于快速繁殖。

2.6 基因工程脱毒法

近些年来，选用基因工程技术来脱除植物体内的病毒也较为流行。目前研究结果显示，有效的抗病毒基因主要来源于病毒本身，如外壳蛋白（CP）基因、移动蛋白（MP）基因、复制酶（Replicase）基因、反义RNA（Antisense RNA）、正义RNA（Sense RNA）、RNA干扰（RNA interference，RNAi）等^[72]。通过体外构建的外源基因转化载体，转录后形成发夹结构RNA，有效诱导基因沉默，从而抵抗病毒的入侵和繁殖。Abel等^[73]通过植物基因工程技术将TMV外壳蛋白基因转入烟草，培育出能稳定遗传的抗病毒工程植株，由此开启了抗病毒植物基因工程这一新的领域。Gargouri-Bouzid等^[74]将PVY的CP基因通过农杆菌介导法导入马铃薯中，转基因马铃薯中表达的病毒CP可以介导马铃薯对PVY产生抗性。目前，已克隆了TMV、CMV、SMV、苜蓿花叶病毒（ALMV）、PVX、PVY等在内至少30种病毒的外壳蛋白基因，并成功地转至烟草、番茄、大豆、马铃薯等作物^[75]。反义RNA是指能与m RNA碱基互补配对的单链RNA，反义链RNA与其相应的m RNA互补，可使该基因的表达受到抑制。利用反义RNA作为抗病毒基因工程的策略有待于进一步完善^[76]。另一策略是利用非病毒来源的基因如植物中自然存在的抗性基因，来获得抗病毒植物。目前，用于植物抗病毒基因工程的非病毒来源的基因包括：植物、微生物的核糖体失活蛋白基因、α，β干扰素基因、PR蛋白基因、潜在自杀基因^[77]。在基因工程这些方法中，利用病毒外壳蛋白基因获得的转基因植株，其获得抗性效果最好，但一般只能延迟一年病害的发生，其他方法的机制仍需要进一步研究。

2.7 其他脱毒方法

除了上述脱毒方法，在实际生产中还常常用到嫁接脱毒法。嫁接脱毒法是将茎尖嫁接于无毒砧木上培养，可获得无病毒植株，缩短育苗周期，保持母本的优良性状。茎尖嫁接技术是目前在柑橘苗木繁育中应用最广的脱毒技术。茎尖嫁接成活率与砧木、接穗和茎尖大小等多种因素相关，在实际操作中可根据脱毒品种的具体情况进行选择^[78]。另外，也有研究者采用变温、二氧化碳处理与组培结合脱毒法，具体操作是在变温处理和组织培养的基础上结合高浓度二氧化碳和高温短期处理的方法脱去病毒，在葡萄上已初见成效^[79]。

3 展望

目前，针对病毒的检测技术有生物学检测方法、电子显微观察法、血清学方法、分子生物学检测，但实际对病毒进行检测时，一般采用多种方法，使得到的结果更为准确、可靠。血清学方法常和其他学科相结合、生物测定与电镜诊断结合，广泛地应用于病毒的检测中以提高检测效率、检测灵敏度。植物病毒病检测技术正在向着快速、高敏感性、高特异性和高通量并行性及自动化的方向发展。

对多种植物脱毒方法研究发现，只采用茎尖脱毒不能完全除去侵染的复合病毒，一般可同时采用两种或两种以上的脱毒方法，达到较好的脱毒效果。其中，在采用茎尖脱毒法脱除病毒时，要注意切取茎尖的大小、时间、形态。对于热处理结合茎尖培养脱毒法，可多采取变温的方法进行脱毒。由于化学药剂的选择范围广，对不同植物脱毒效果不同，且目前研究的报道较少，所以化学脱毒法还有待进一步的研究。传统的防治方法都具有其局限性，随着基因工程的发展，生物技术在植物病理学上得到应用，为防治植物病毒开辟了新途径。在基因工程脱毒法中，可选择多种抗性基因控制病毒或病毒复合侵染，制定抗病毒介体基因与抗病毒基因结合策略，更大程度的增加植物对病毒的抗性，减少病害的发生。在脱毒的过程中，需要考虑植物自身的性质与病毒的特质，这样既不影响植物自身的生长，又能得到较高的脱毒率。