2. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301
2. South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301
10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是从我国特有珙桐科植物喜树中分离出的天然生物碱，也是一种新型有效的抗肿瘤药物[1]，通过抑制拓朴异构酶Ⅰ（Topoosomerase Ⅰ，Topo-Ⅰ）干扰肿瘤细胞的DNA复制，抑制肿瘤细胞生长[2, 3]。白藜芦醇（Resveratrol，Res）是广泛分布在葡萄、花生、桑葚、虎杖、决明等植物中的非黄酮类多酚化合物。近年来有报道Res对肝癌、胃癌、自血病、宫颈癌、食管癌等均有较好的抗肿瘤效果，而且对人体正常机体没有明显的毒副作用[4-6]。黑色素瘤是目前位居人类皮肤癌第三位的肿瘤疾病，因其恶性程度高，易转移，导致患者生存率低，引起了研究者的广泛重视[7-9]。因此，不断发掘治疗黑色素瘤的新药物，提高患者的生存率成为当前重要任务。如今医学界已逐渐注重发挥中医学的优势，从天然植物中筛选出具有抗瘤活性的成分作为防治黑色素瘤的重要候选药物[10]。合成黑色素是黑素瘤细胞增殖生长过程中的重要特征，其过程主要由酪氨酸酶基因家族调控。其中，酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成的关键限度酶，其基因家族受小眼相关转录因子（MITF）的调节。MITF是黑素细胞的特异性转录因子，可以直接结合并激活酪氨酸酶启动子，上调酪氨酸酶基因的表达，促进黑色素的生成[11-13]。本研究以小鼠黑色素瘤B16F10细胞为模型，研究HCPT和Res对该细胞株增殖及黑色素合成的影响，通过分析药物作用下TYR活性变化、TYR和MITF基因的表达水平，初步阐明两种天然产物抑制B16F10细胞黑色素合成的作用机理，旨为深入研究HCPT和Res抗黑色素瘤机理及其相关药物开发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠黑色素瘤B16F10细胞购自中国科学院菌种保藏中心；10-羟基喜树碱（纯度98%以上）、白藜芦醇（纯度98%以上）、左旋多巴（L-DOPA）购自阿拉丁试剂有限公司；MTT（四甲基偶氮唑蓝）、DMSO（二甲基亚砜）购自SIGMA；DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素购自上海立菲生物技术有限公司；PCR试剂盒和RT-PCR试剂盒购自东盛生物科技有限公司，PCR引物由华大基因公司合成。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃，5% CO2条件下常规培养B16F10细胞，待细胞生长至近融合状态，以500 μL胰蛋白酶消化传代，每3天传代1次。
1.2.2 细胞活力检测取处于最佳生长状态的B16F10细胞，常规处理，细胞悬浮液密度调整到7×104-9×104个/mL，以每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养。
1.2.2.1 药物溶剂对细胞活力影响实验24 h后，实验分为3组：实验组为正常培养和终浓度0.5% DMSO的处理组，调零组只加培养液不接种细胞。设1、2、3、4、5和6 d共6个时间点，每个时间点4个重复。到时间点时，每孔加10 μL MTT（5 mg/mL，PBS配制），常规孵育4 h。弃掉培养液，每孔加150 μL DMSO，室温震荡15 min，使紫蓝色结晶物充分溶解。使用酶标仪测定各孔492 nm处吸光度（OD）值。记录结果，OD = OD实验组 -OD调零组。
1.2.2.2 药试实验24 h后，实验分为两组：对照组和实验组（浓度为20、40、80、120、160和200 μmol/L HCPT处理组或浓度40、80、120、160和200 μmol/L Res的处理组）。设24、48、72 h共3个时间点，每个时间点4个重复。到时间点时，每孔加入10 μL MTT，常规孵育4 h。弃掉培养液，每孔加150 μL DMSO，室温震荡15 min，使紫蓝色结晶物充分溶解。使用酶标仪测定各孔492 nm处OD值。记录结果。
取状态最佳的B16F10细胞以（7-9）×104个/mL的密度铺板于6孔细胞培养板中，24 h后，加HCPT和Res至供试浓度进行处理，48 h后用倒置显微镜观察细胞形态变化并拍片记录。
1.2.4 黑素含量测定选取处于最佳生长状态的B16F10细胞，常规处理，细胞悬浮液密度调整到7×104-9×104个/mL，以每孔2 mL细胞悬液接种于6孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养。24 h后换液，实验组分别加入不同浓度HCPT（终浓度为20、40、80、120、160、200 μmol/L）和Res（终浓度为40、80、120、160和200 μmol/L）。药物作用72 h后，收获细胞，将细胞悬浮液离心后用pH=7.2 PBS洗涤两次，加入1 mol/L NaOH，置80℃水浴中30 min，使细胞团块完全溶解，再加入超纯水将NaOH的终浓度稀释至0.2 mol/L。混合均匀，取各组溶液放入96孔板中，每孔100 μL，设立8个重孔。用酶标仪在492 nm测定OD值。黑素含量（%）=（OD实验组/OD对照组）×100%。
1.2.5 酪氨酸酶活性测定选取处于最佳生长状态的B16F10细胞，常规处理，细胞悬液调整细胞浓度为7×104-9×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。实验分两组：实验组调整HCPT终浓度为20、40、80、120、160和200 μmol/L，Res终浓度为40、80、120、160和200 μmol/L，并设对照组，每一浓度设立4个重复。药物作用72 d后，弃去上清液，用pH 7.2的PBS洗涤，每孔加入1% Triton X-100溶液100 μL，手动平稳震荡5 min，接着在-20℃冰箱冻存1 h。随后在室温中融化，使细胞裂解，37℃预温后每孔加入0.1% L-DOPA溶液（PBS配制）100 μL，37℃反应2 h，用酶标仪在492 nm测定OD值。酪氨酸酶活性激活率（%）=（OD实验组/OD对照组）× 100%。
1.2.6 半定量逆转录-聚合酶链式反应（Semi-RT-PCR）分析法采用通用RNA提取试剂盒（参照试剂说明书）提取以上述浓度HCPT和Res处理48 h的B16F10细胞总RNA，并反转录成cDNA用于PCR扩增。目的基因PCR引物如下。TYR：上游5'-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGT-3'，下游5'-TGGTG-CTTCATGGGCAAAATC-3'。MITF：上游5'-AAGTG-GTCTGCGGTGTCTCC-3'，下游5'-GTTGTTGGTAAA-GGTGATGG-3'。β-actin：上游5'-CGAGCGGGAAA-TCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3'，下游5'-CGTCA-TACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。其中先以对照组的cDNA为模板，PCR的反应条件为：94℃ 60 s，64℃ 60 s，72℃ 60 s，设定系列循环数（25、26、27、28、29、31、33和35），通过琼脂糖凝胶中电泳分析，筛选并确定每个基因进行Semi-RT-PCR分析的合适循环数，最后再按照该循环数，利用Semi-RT-PCR技术分析各基因mRNA相对表达量。
1.2.7 数据处理实验结果用ORIGIN7.5统计软件处理，数据用均数±标准差（x± s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为两组间的差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 HCPT和Res抑制B16F10细胞增殖B16F10细胞在接种后第2天完成第1次倍增，进入对数生长阶段。药试试验中，选择铺板培养24 h作为加药起点时间。以0.5% DMSO处理的B16F10细胞，其生长活力与正常生长细胞相比，总体上没有明显差异（图 1），表明DMSO在终浓度低于0.5%的情况下对B16F10细胞活力没有显著影响，可作为供试药物的溶剂。
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| 图 1 DMSO对B16F10细胞活力的影响（n=4，x± s） |
利用MTT法测定不同浓度HCPT和Res对B16F10细胞增值生长的影响。HCPT诱导B16F10细胞24、48和72 h，细胞增殖均受到明显抑制，抑制率50%以上，其中24和48 h处理浓度间抑制率差异不明显；48和72 h处理抑制率比24 h明显增加，表明HCPT对B16F10细胞增殖抑制存在一定时效性；72 h处理，随着HCPT浓度增加，细胞抑制率逐渐增加，处理浓度200 μmol/L时，抑制率达到84.20%，表现出一定浓度依赖性（表 1）。Res低浓度（20-40 μmol/L）诱导处理，药物作用24 h后其对B16F10细胞增值有促进作用；处理48和72 h对细胞增值生长没有明显影响。然而，较高浓度Res（80-200 μmol/L）作用下，处理24、48和72 h均对B16F10细胞生长有明显的增值抑制作用，且随着浓度的加大，诱导作用延长，增值抑制作用增加，抑制率最高达到68%（表 2）。
用倒置相差显微镜观察药物诱导B16F10细胞48 h的形态变化。对照组B16F10细胞形态饱满，呈爪形或梭形，细胞膜完整，核区清晰，折光性好，增殖速度快（图 2-A，B，C）。40 μmol/L HCPT处理后，部分细胞出现降解，核区皱缩或膨大，细胞贴壁能力差，呈团块状生长，同时出现大量凋亡小体（图 2-D）。80和160 μmol/L HCPT处理组，细胞数量大幅度减少，大部分细胞细胞核皱缩，细胞解体成碎片或形成凋亡小体（图 2-E，F）。40 μmol/L Res处理组，多细胞未出现明显的形态异常，仍保持良好的增殖状（图 2-J），80 μmol/L Res处理组贴壁细胞未见明显减少，部分细胞核区空泡化并逐渐解体，在细胞周围出现颗粒状的凋亡小体（图 2-H），160 μmol/L Res处理组只有少数细胞贴壁生长，大部分细胞完全解体为颗粒状凋亡小体或形状不规则碎片，部分细胞核区皱缩，且异常细胞聚集成团（图 2-I）。综合观察表明表现HCPT和Res对B16F10细胞具有明显的凋亡诱导作用，其中80 μmol/L以上处理浓度的诱导作用尤为明显，而且HCPT凋亡诱导作用明显优于Res，40 μmol/L的浓度处理细胞已表现出一定的凋亡特征。
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| 图 2 HCPT和Res对B16F10细胞显微形态的影响 A-C：CK；D-F：40、80和160 μmol/L HCPT处理48 h；J-I：40、80和160 μmol/LRes处理48 h（×200） |
与对照组相比，HCPT浓度在40和80 μmol/L时对B16F10细胞黑色素合成量具有显著性抑制作用，黑色素生成量分别下降到87.6%和78.4%，呈现一定浓度依赖性；当HCPT浓度大于80 μmol/L后，黑色素合成量有持续下降趋势，但浓度间差异不明显，其中200 μmol/L处理组黑色素合成量为73.1%（图 3-A）。Res诱导作用下，B16F10细胞黑色素合成也受到显著抑制，在20-200 μmol/L Res处理下，与对照组比较，细胞黑色素生成量下降到82%-88%，期间增加Res处理浓度，黑色素生成量虽有下降趋势，但浓度间差异不明显（图 3-B）。
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| 图 3 HCPT和Res对B16F10细胞黑色素合成的影响（n=4，x± s） |
不同浓度HCPT处理对B16F10细胞中酪氨酸酶活性具有显著性抑制作用，20-200 μmol/L间浓度处理下，随着浓度的增大，抑制效果有逐渐增强趋势，呈现一定浓度依赖性，其中200 μmol/L HCPT处理组，酪氨酸酶活性降低至71.8%（图 4-A）。不同浓度Res处理对B16F10细胞中酪氨酸酶活性也具有显著性抑制作用，在20-200 μmol/L Res的诱导下，与对照组相比，酪氨酸酶活性下降到80%-90%，不同浓度处理间，没有明显浓度依赖性（图 4-B）。
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| 图 4 HCPT和Res对B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响（n=4，x± s） |
在PCR反应中，目标产物的数量随着循环数呈指数级增长。在反应过程中，随着酶活力的下降及体系中各底物浓度的下降，反应速率逐渐变慢，最后反应进入一个平台期，反应产物的浓度不再呈指数级增长。在达到平台期之前，产物的相对浓度一定程度上反映了初始模版的相对浓度。因此，要首先确定内参基因β-actin以及目的基因TYR和MITF扩增过程中的反应平台期。β-actin和TYR基因在31个循环时，扩增达到平台期（图 5），因此本实验选择29个循环作为扩增循环数。MITF基因在35个循环时，扩增达到平台期，我们选择33个循环作为扩增循环数。
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| 图 5 三基因片段不同循环数的扩增结果 1-8：循环数分别是25、26、27、28、29、31、33和35的扩增结果 |
利用Semi-RT-PCR实验检测HCPT诱导B16F10细胞凋亡TYR mRNA的表达量变化。β-actin mRNA的表达量在不同浓度HCPT诱导下保持稳定不变，说明该实验过程中没有其他因素干扰TYR mRNA的表达（图 6）。与对照组比较，HCPT（20、40、80、120和160 μmol/L）诱导细胞48 h，MITF和TYR mRNA表达受到显著抑制，其中MITF mRNA表达抑制尤为显著，TYR mRNA随着HCPT浓度增加，表达量总体呈现降低趋势。MITF蛋白是TYR基因的调控因子，结果表明HCPT可能通过抑制MITF mRNA表达下调TYR mRNA的水平，从而降低TYR活性，进而抑制细胞黑色素的生成。
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| 图 6 HCPT对B16F10细胞MITF and TYR mRNA相对表达影响 1：CK；2-6：20、40、80、120和160 μmol/L HCPT分别诱导48 h |
120和160 μmol/L Res分别诱导细胞48 h，MITF mRNA表达量明显下降，低浓度（20、40和80 μmol/L）Res对细胞TYR mRNA表达没有显著影响（图 7），表明Res也可能通过抑制MITF mRNA表达下调TYR mRNA的水平，从而降低TYR活性，进而抑制细胞黑色素的生成。
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| 图 7 Res对B16F10细胞TYR和MITF mRNA相对表达影响 1：CK；2-6：20、40、80、120和160μmol/LRes分别诱导处理48 h |
研究表明HCPT能够通过干扰肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制其增殖生长[14, 15]。HCPT具有抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性而使DNA断裂的独特机制。它能选择性作用于Topo-Ⅰ，形成稳定的“药物-Topo-Ⅰ-DNA复合物”。该复合物抑制最初由Topo-Ⅰ介导的DNA裂解和重新连接反应，使处于细胞周期中S期DNA复制时形成的复制叉与已断裂的DNA链冲突，会造成不可逆的复制叉阻滞、双链DNA断裂和可逆的可解离复合物转变成不可逆的复合物，最终导致肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡，表现出显著的肿瘤活性[2]。Res对肿瘤也有确切的抑制作用，可作用于肿瘤的起始、促进、发展这3个阶段[16]，但其作用机制很复杂，尚未明确。Res可引起细胞生长抑制，细胞周期阻滞及细胞凋亡的生物学变化，而且变化程度与其浓度有关[17]。Res对肿瘤细胞增殖有双相性，低浓度促进细胞增殖，高浓度抑制细胞增殖，其抑制作用呈量效关系[18]。同时，Res还具有抗肿瘤迁移的作用[19]。有研究报道，Res（25-100 μmol/L）可抑制黑色素肿瘤细胞增殖，引起其细胞周期改变[20]。本研究也发现HCPT和Res对小鼠黑色素瘤B16F10细胞均具有显著的增殖抑制作用，同时药物诱导下的细胞形态观察发现两种药物对目标细胞具有显著的凋亡诱导作用，因此这两种药物也很可能通过促进小鼠黑色素瘤B16F10细胞凋亡，抑制其增殖生长，表现出抗肿瘤活性。两者的抗肿瘤具体分子机制仍不清楚，需深入研究。
恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高的恶性肿瘤，其具有逃避凋亡、易转移等重要特点。合成黑色素是黑素瘤细胞增殖生长过程的重要特征，其过程主要由黑素合成关键限速酶TYR基因家族调控，而TYR基因家族调节因子MITF可以上调酪氨酸酶基因表达，促进黑色素的生成[11-13]。本研究发现HCPT和Res可能通过抑制MITF mRNA表达下调TYR mRNA的水平，从而降低TYR活性，进而抑制细胞黑色素的生成。也有研究者发现乳酸菌发酵的豆奶提取物可通过抑制B16F0黑素细胞的TYR和MITF活性和表达，从而减少黑色素的合成[21]。该提取物抑制黑色素的作用机制与本研究的结果基本一致。然而，黑色素的合成过程也有酪氨酸酶基因家族中的酪氨酸相关蛋白1（TRP-1）和酪氨酸相关蛋白2（TRP-2）的参与，Res对这两种相关蛋白是否有影响有待研究。
4 结论本研究发现HCPT和Res对B16F10细胞增殖都有抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用增强。HCPT和Res可能通过诱导细胞凋亡抑制B16F10细胞的增殖，同时通过下调MITF基因转录，抑制TYR mRNA的表达及TYR酶活性，进而抑制细胞黑色素的生成。
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