2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308
2. Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308
维生素B12（vitamin B12）又称钻胺素[1]，作为一种含钴的类咕啉化合物[2]，是唯一需要肠道分泌物帮助才能被吸收的维生素。维生素B12是维生素产品中价格最为昂贵的品种之一，具有广泛的生理学作用，它参与体内甲基转换以及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整，并参与广泛的蛋白质及脂肪代谢[3]。维生素B12在微生物中合成是受限的，由于其复杂的结构，超过30个基因参与到维生素B12的生物合成全过程，数量占到典型细菌基因组的1%[4]。生物合成维生素B12在自然界中有2条途径[5]：（1）好氧途径，此途径在Rhodobacter sphaeroides、Sinorhizobium meliloti和脱氮假单胞菌中有所研究；（2）厌氧途径，此途径在Bacillus megaterium、P.shemanii和Salmonella typhimurium中有所研究[6]。相比于厌氧发酵过程的丙酸杆菌，好氧发酵过程的脱氮假单胞菌表现出更快速的细胞生长和高效维生素B12的生产能力。
启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上所起到的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，而且决定了基因表达的时空顺序[7-9]，在确定启动子表达强度的研究中，大多是利用报告基因的表达量来达到研究目的，常用的报告基因有绿色荧光蛋白GFP（Green fluorescent protein）、红色荧光蛋白RFP（Red fluorescent protein）和β-半乳糖苷酶lacZ（β-galactosidase）等[10, 11]。根据在菌株中筛选强启动子的相关文献报道，某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前的启动子表现出较高的表达强度。热激蛋白（Heat shock protein，HSP）启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性，在基因表达调控中具有开关性作用[12]。Dong等[13]在氧化葡萄糖酸杆菌中发现高强度启动子Pdnak，分子伴侣蛋白启动子Pdnak在强化氧化葡萄糖酸杆菌中D-山梨醇脱氢酶关键基因sldAB1的表达时，有效缩短D-山梨醇的转化时间、提高L-山梨糖产量，转化时间比野生菌缩短了33.3%以及产量提高了11.2%，验证了Pdnak的高强度启动活性。
S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶（S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase，SUMT）催化尿卟啉原Ⅲ（Uroprophyrinogen Ⅲ）生成前咕啉-2，是维生素B12生物合成途径中的一个关键酶，由cobA基因编码。法国RPR公司曾经提高了脱氮假单胞菌中cobA基因的拷贝数，发现对提高维生素B12产量有所帮助[4]。本研究通过筛选高表达的启动子，能提高cobA基因的表达水平，并在质粒上过表达cobA增加其拷贝数，达到提高维生素B12产量的目的。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒本研究所用菌株和质粒均列于表 1。
本研究所用PCR引物用Primer 5.0软件进行设计，引物均合成于苏州金唯智生物科技有限公司，见表 2。
主要试剂：基因组DNA提取试剂盒（DP302-02），质粒小提试剂盒（D69-4302），胶回收试剂盒和柱式PCR产物纯化试剂盒（D6492-02）购于OMEGA公司，其他未特殊指明的试剂均购自索莱宝生物科技有限公司。
限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific公司，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix购自TaKaRa，2×Taq PCR MasterMix和DNA Marker购于北京天根生化科技有限公司。Gibson Assembly 1.2 Master Mix为纽英伦（NEW ENGLAND BioLabs）生物技术有限公司产品。
EDC-810基因扩增仪器：东胜国际贸易有限公司；EYETM凝胶自动成像仪：法国VILBER LOURMAT；SW-CJ-2FD超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；DYY-6C核酸电泳仪：北京市六一仪器；WY-2112B恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器有限公司；V-1600分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；5810R台式高速离心机：德国Eppendorf公司；SpectraMax M5多功能连续酶标仪：美国MD公司；Agilent 1260高效液相色谱分析仪：安捷伦科技有限公司；Leica MZFLⅢ荧光显微镜：购自东莞同创仪器有限公司。
大肠杆菌（Escherichia coli）采用LB（Luria-Bertani）培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固体培养基另加入琼脂15。
脱氮假单胞菌种子培养基（g/L）：KH2PO4 2.5，NaCl 2.5，NH4Cl 0.5，MgSO4 0.13，葡萄糖1，CaCl2 5，KOH将pH值调到pH 7.0-7.2。
发酵培养基（g/L）：蔗糖50，玉米浆（Corn steep liquor）60，（NH4）2SO4 2，CoCl2 0.006，KH2PO4 2.6，甜菜碱6，前体（DMBI）1，KOH将pH值调到pH 7.0-7.2。
补料培养基（g/L）：前体（DMBI）12，甜菜碱30，CoCl2 0.15，葡萄糖130。抗生素和使用浓度：卡那霉素50 μg/mL。
1.2 方法 1.2.1 启动子的在线预测利用启动子在线预测软件BPROM（http://www.softberry.com/berry.phtml?Topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb）来预测启动子的序列位置。
1.2.2 含不同强度启动子和gfp的重组菌的构建从脱单假单胞菌菌株中提取基因组，并以此为模板，扩增启动子PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE以及cobA基因自身启动子PcobA，与gfp基因overlap相连接。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测大小。用试剂盒回收目的片段，并和载体进行Gibson Assembly[15]，50℃反应1 h，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。转化液涂布于含卡那霉素50 µg/mL的LB平板上37℃过夜培养，挑取转化子进行菌落PCR验证，并对检测正确的菌株加入至LB液体中过夜培养，用质粒小提试剂盒提取重组质粒送到苏州金唯智生物技术有限公司进行测序。使用NCBI在线比对软件BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对。质粒通过三亲本转化到脱氮假单胞菌，挑取单菌落过夜培养后，用终浓度15%的甘油保存菌液，冻存于-80℃。
1.2.3 酶标仪检测重组菌的荧光值分别取-80℃冻存管，将含有不同启动子的重组菌株划线，30℃倒置培养4 d。分别挑取单菌落接种于含有30 mL种子液的250 mL三角瓶中，200 r/min、30℃培养36 h，按10%的接种量，接种到含30 mL发酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培养。每株重组菌株均设置两个平行。每隔4 h取样检测，分别取2 mL培养液，使用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次，去除培养基中的杂质和死细胞。使用NUNC 96孔黑色酶标板进行荧光检测，使用96孔白色细胞培养板进行OD600检测（荧光和OD600检测均做2个复孔，每孔加入200 μL洗涤后的细胞悬浮液），所用仪器为连续波长多功能酶标仪，操作软件为Softmax Pro。荧光强度检测参数设置为：激发波长485 nm，发射波长520 nm。OD600检测参数设置为：吸收光波长600 nm，并选择调整光程。同时，取10 μL发酵菌液于载玻片上并使用荧光显微镜进行荧光镜检，曝光时间选择为2 ms。
1.2.4 cobA过表达菌株的构建以脱氮假单胞菌基因组为模板，利用引物扩增大小为843 bp的cobA基因。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测大小，胶回收后，用Gibson assembly方法连接到质粒pBHR1 -PdnaK（载体需经Dpn1处理），构建得到质粒pBHR1-PdnaK-cobA。使用三亲本转化法，将构建得到的重组载体pBHR1-PdnaK-cobA导入到脱氮假单胞菌，验证正确的转化子被命名为重组菌脱氮假单胞菌pBHR1-PdnaK-cobA。
1.2.5 过表达cobA重组菌的摇瓶发酵及维生素B12产量测定将验证正确的过表达cobA基因的重组菌株，挑单菌落接种于含30 mL种子液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培养36 h，按10%的接种量，接种到含30 mL发酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培养144 h。以野生型脱氮假单胞菌为对照组，每株重组菌株均设置两个平行。菌体浓度采用测量吸光值法，取2 mL发酵液，定容至100 mL后，测量吸光值（OD600）。
维生素B12在液体发酵培养基中含量的测定方法是之前有过相关报道的高效液相色谱法（HPLC）[14]。发酵结束后取4 mL样品液体并向其中加入1 mL NaNO2 8%和1 mL冰醋酸，在热水中煮沸30 min。离心分离10 000 r/min、10 min并且将上清液通过0.22 μm膜过滤器（Φ= 0.22 μm），取滤液1 mL，加入2 %氰化钠溶液20 µL，过滤至上样瓶中。分析使用安捷伦（Agilent 1260）高效液相色谱法5c18-250a柱恒温设置为35℃。流动相为：水和乙腈，体积比为70:30且流速控制在0.8 mL/min，检测分析物质在361 nm处检测。
2 结果 2.1 启动子特征分析确定挑选的7个启动子片段区域，并使用原核生物启动子预测软件BPROM（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom & group=programs & subgroup=gfindb）评测启动子区域。使用软件均预测到-10区和-35区启动子核心序列的存在，该网站上标明利用该软件预测的启动子-10区和-35区的准确率在80%左右。并给出了相应的LDF（Linear discriminant function）预测得分，启动子预测的-35区和-10区，及相应的间隔碱基数分布信息，LDF预测得分，详见表 3。
PCR扩增启动子片段PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE、PcobA，gfp基因，获得的片段电泳图谱如图 1所示。片段的长度分别为512 bp、977 bp、568 bp、539 bp、588 bp、710 bp、980 bp和717 bp。
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| 图 1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 M：markerⅢ；1：gfp；2：PdnaJ；3：PhtpG；4：PdnaK；5：PcobA；6：PibpA；7：PcbpA；8：PgrpE |
将启动子片段与gfp片段overlap连接后切胶回收纯化后，与线性化载体用Gibson assembly方法组装（图 2）后转化到大肠杆菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑选单菌落进行PCR验证，PCR验证正确的送苏州金唯智公司进行测序，测序正确的质粒按照方法1.2.2构建含不同启动子强度和gfp报告基因的脱氮假单胞重组菌。
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| 图 2 重组质粒构建示意图 |
在脱氮假单胞菌中以gfp为报告基因评价各启动子的表达强度，质粒构建完成后获得7株重组菌株PibpA-gfp、PcbpA-gfp、Pdnak-gfp、PdnaJ-gfp、PhtpG-gfp、PgrpE-gfp、PcobA-gfp。并使用多功能荧光酶标仪检测培养细胞的荧光强度。启动子强度由测定得到的RFU/OD600值来表征。其中Pdnak-gfp、PhtpG-gfp和PdnaJ-gfp的荧光实验结果表明其含有的启动子表达强度较高。图 3中A、C、E显示，3株重组菌呈线性增长直到发酵28 h达到稳定期，RFU/OD600在对数中后期达到最大值。带有启动子Pdnak的菌株RFU和RFU/OD600的值明显高于其他两株菌。同时，将上述3株高荧光值菌株用荧光显微镜观察，结果显示重组菌株Pdnak-gfp有较强的荧光强度。酶标仪检测和显微镜镜检结果（图 3-B、D、F）表明，重组菌的荧光强度大小为Pdnak > PhtpG > PdnaJ，以最大RFU/OD600的值为标准，重组菌Pdnak约为PhtpG、PdnaJ构建的重组菌的1.5倍和18倍。
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| 图 3 重组菌的酶标仪检测结果和镜检结果 A、C、E：分别为含启动子PhtpG，PdnaJ，PdnaK脱氮假单胞杆菌株连续多功能酶标仪SpectraMAX M5检测结果；B、D、F：分别为三株菌株在荧光电子显微镜结果 |
使用强启动子PdnaK构建cobA的过表达重组菌。PCR扩增cobA片段，并与线性化载体pBHR1-PDnaK通过Gibson assembly获得重组质粒pBHR1-PdnaK-cobA。然后转化到大肠杆菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑选单菌落进行PCR验证，经验证正确的进行测序。使用三亲本转化法，将构建得到的重组载体pBHR1-PdnaK-cobA导入到脱氮假单胞菌，验证正确的转化子被命名为重组菌P. denitrifican pBHR1-PdnaK-cobA。
2.5 重组菌摇瓶发酵结果在脱氮假单胞菌中使用筛选得到的强启动子Pdnak提高维生素B12合成途径相关基因cobA的表达。对构建得到的工程菌株P. denitrificans-Pdnak-cobA进行发酵测定其维生素B12产量，对照组为野生型脱氮假单胞菌。用高效液相色谱测定维生素B12产量，结果如图 4所示，含有过表达质粒Pdnak-cobA的重组菌，维生素B12产量为75.5 mg/L，野生型菌株维生素B12产量为54.1 mg/L，明显高于野生型菌株21.5 mg/L。
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| 图 4 重组菌过表达cobA基因后生产维生素B12发酵产量 A：野生型菌株；B：重组菌株 |
核心启动子是一个含有两个保守序列即-35区和-10区的DNA序列，它是指一个RNA聚合酶全酶和转录起始点的结合位点[16]。按照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；从启动子诱导机制上分类，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子及自诱导启动子[17]。通常，强组成型的启动子可用于表达质粒载体的构建，以及在工程菌中代替目标基因自身的启动子[18-20]。虽然使用在线预测软件预测出了启动子-35区和-10区的序列，但其表达强度仍然需要进一步的实验验证。为了确保启动子强度检测结果的准确性，本研究利用连续多功能酶标仪和荧光显微镜进行启动子强度的检测。
细菌的代谢改造是进一步提高菌株生产性能的关键，为筛选得到可用于脱氮假单胞菌中代谢工程改造高表达的启动子，对脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列用启动子在线预测软件进行分析，利用GFP报告基因表达的荧光值来表征启动子的表达强度，并挑选高表达的启动子应用于提高脱氮假单胞菌中维生素B12合成途径相关基因的表达水平，以实现提高VB12产量的目的。本研究筛选得到Pdnak、PhtpG和PdnaJ在内的不同强度的启动子，使用GFP报告基因筛选得到高表达的启动子Pdnak，以最大RFU/OD600的值为标准，重组菌Pdnak约为PhtpG、PdnaJ的1.5倍和18倍，同时结合荧光显微镜检测结果均可知其高表达强度得到验证。并使用筛选的最强启动子Pdnak构建含维生素B12合成途径关键基因cobA的过表达菌株，同时以野生型菌株为对照组。发酵结果表明，脱氮假单胞菌pBHR1-Pdnak-cobA的维生素B12产量比野生型菌株高21.5 mg/L，实现了维生素B12产量的提高，为今后脱氮假单胞菌工业化大规模生产维生素B12提供可能性。如果今后想进一步优化脱氮假单胞菌生产维生素B12的能力，可以考虑通过启动子优化与酶的天然组合、过表达、支路途径敲除、发酵条件优化[21]等手段进一步提高维生素B12的产量。
4 结论本研究通过选取脱氮假单胞菌中某些编码热激蛋白和分子伴侣基因前含启动子在内的非编码序列，并与报告基因GFP相连，经酶标仪检测GFP的荧光值，筛选得到高表达的启动子Pdnak，构建了含启动子Pdnak及cobA基因的过表达载体，并成功转入生产维生素B12的脱氮假单胞菌中。根据发酵结果显示维生素B12产量明显提高，同时证明筛选强启动子用于关键基因的过表达能有效提高菌株产量。
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