煤基烟道气CO₂是引起温室效应的主要因素。过度的CO₂排放导致全球气候的变化、雾霾等一系列的环境问题，对生态环境和人类的健康及经济利益造成损害。国内外有关专家相继提出和建立了一些物理化学减排路径，如海洋深层储存法和利用乙醇胺类吸收剂对CO₂进行分离回收等，然而这些物理化学减排存在成本高、次生污染和不可再生等缺陷。生物减排近年来取得不少进展，特别是利用微藻减排深受关注。与陆生植物相比，微藻作为高效固碳的自养植物，具有生长周期短、繁殖快、适应环境性强等优点。微藻可以直接利用烟道气中的CO₂、氮硫元素作为其生长的营养原料，其生物质可以生产优质生物柴油及高值化工产品等。诸多应用微藻固定烟道气CO₂的研究^{[1, 2]}已显示微藻减排是一种环境友好的可行方案。

然而，利用微藻直接固定烟道气CO₂也存在一定的局限性。烟道气中高浓度的CO₂和氮硫氧化物直接通入培养液会导致pH急剧下降，进而抑制微藻的生长，导致微藻固碳体系持续性差。针对烟道气直接导入引起的培养液酸化问题，人们建立了通过空气稀释烟道气、向培养液中填加中和酸的碱性物质和利用pH反馈控制调节等方法来降低烟道气对微藻生长的不良影响^{[3, 4]}。但是这些方法的应用不仅增加了该固碳体系的成本，而且均不能从根本上解决烟道气导入造成的酸性环境对微藻生长的损害。

培育高抗酸性的微藻藻株或通过调控技术提高藻种对酸性环境的适应能力，是一个有效措施。Yue等^[5]在电厂附近的水体中分离出一株藻株，在10% CO₂的条件下，生长速率高达1.17 g/（L·d），且可以在70%的CO₂下生存，具有良好的耐酸性。Li等^[6]采用紫外诱变方法对栅藻进行处理，得到一株突变藻株，在12% CO₂和0.1 L/（L·min）通气比条件下，CO₂去除率达67%，显现出该藻株具有较好的高浓度CO₂耐受性。本研究通过对种子藻进行酸驯化和紫外诱导处理，旨在获得高抗酸性的藻株，从而使得藻株可以在通入烟道气的酸化条件下生存。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 微藻藻种

实验用藻种为斜生栅藻（Scenede-smus obliquus）株系SO-SX-01。该株系是本实验室从山西一煤电厂附近水体采集的微藻样品，经分离、纯化及鉴定所获得的栅藻，由本实验室保存。

1.1.2 培养基

栅藻培养基BG11配方如下：NaNO₃ 1 500 mg/L，K₂HPO₄·3H₂0 52.5 mg/L，MgSO₄ 36.6 mg/L，C₆H₈O₇ 6.6 mg/L，FeC₆H₅O₇NH₄OH 6 mg/L，NaEDTA·2H₂O 1.1 mg/L，CaCl₂ 36 mg/L，NaCO₃ 20 mg，H₃BO₃ 2.86 mg，MnCl₂·4H₂O 1.81 mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.08 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39 mg/L。

1.2 方法 1.2.1 标准培养条件

将在锥形瓶BG11培养基中培养的200 mL处于对数生长期的栅藻种子液（1 g/L）接种在装有700 mL BG11培养基的柱状玻璃管生物反应器中，接种后藻液浓度为0.2 g/L，培养箱内光照强度为8 000 lux，温度25℃，通气速率为2 L/min，二氧化碳浓度为2%。

1.2.2 模拟烟道气酸化条件

实验采用模拟烟道气的组分来替代工厂排放的烟道气。模拟烟道气中气体组分及比例：在一个100 L的钢瓶中装有15% CO₂、300 ppm SO₂、100 ppm NO和一定体积的N₂（通过N₂填充平衡压力并保证其它气体浓度）。把模拟的烟道气通入柱状玻璃管生物反应器培养基中，测定其pH的变化。

1.2.3 抗性诱导处理

（1）酸驯化处理：分别用不同pH的培养基作为酸化胁迫条件对种子藻进行耐酸性驯化。取预先培养的处于对数生长期浓度为1g/L种子藻200 mL 15份，放入250 mL锥形瓶中。用稀硫酸将瓶中培养基pH分别调至5、4.5、4和3等4个pH梯度，每个pH下培养10 h，每2 h调节一次pH。同时设置不进行酸驯化的作为对照，5个组每组设置3个重复。（2）紫外诱导处理：本实验应用低剂量紫外线处理种子藻，以诱导微藻抗性表达，提高其耐酸性。取对数生长期的种子藻放在250 mL锥形瓶中，分别放在紫外诱变箱（18 w）紫外处理0、1、5、10、15 min，每组设置3个重复。（3）酸驯化和紫外诱导复合处理：将在pH4.5酸驯化10 h的种子藻，置于紫外诱变箱内诱导5 min，同时设置一组未经处理的作为对照，每组设置3个重复。将处理后的种子藻接种到装有培养基的柱状玻璃管生物反应器中，通入模拟烟道气进行微藻培养2 d后停止通入烟道气，用2%浓度的CO₂供气，每天取样测试培养液pH和微藻生物量。

1.2.4 微藻生物量的测定

精确抽取5 mL藻液在预先称好的混合纤维素微孔滤膜（使用前用沸水煮3次烘干）过滤洗涤抽干，放在干燥箱中烘干后称重。

2 结果 2.1 模拟烟道气导致培养基pH降低及不同初始pH对栅藻生长的影响

将模拟烟道气通入不含藻的BG11培养基中，检测培养液pH的变化。如图 1所示，在通入烟道气后3 h，培养基的pH急剧下降到4.5左右，至15 h时，培养基pH下降稳定在3左右。培养液过低的pH严重影响微藻生长。造成pH下降的原因正是烟道气中高浓度的CO₂和氮硫氧化物引起的。

为了研究低pH环境对于微藻生长的影响，实验分别把种子藻接种在不同初始pH值的培养基中，测试微藻生长曲线和培养基pH变化曲线。如图 2-A所示，在初始pH4、5和7时，微藻生长在开始培养3 d内有差异，但差异未达显著水平（P < 0.05），生长趋势基本一致。当pH值降低为3和3.5时，在开始培养初期，微藻生长就严重受阻，与对照差异极显著（P < 0.01），尤其在培养基起始pH值为3时，微藻在生长的初期（1-4 d）就出现显著的生长停滞。

图 2-B显示用不同初始pH培养基培养微藻过程中的pH的变化曲线。在接入种子藻开始培养的4 d内，除初始pH3外，其他微藻培养液pH均上升，培养5 d后，培养液pH趋于稳定。初始pH3的培养液在培养前4 d内，pH基本不变，在第5、6天时，培养液pH迅速提高，而后呈轻微上升趋势。

2.2 酸驯化提高微藻耐酸性和在低pH条件下起始生长速率

图 3-A显示，与没有经过酸驯化的栅藻对照相比，经酸驯化的栅藻在起始阶段能较好适应酸环境，生长较快，生长延滞期显著缩短。特别是经pH4.5条件酸驯化的栅藻耐酸性和起始生长率最好（表 1），生长延滞期仅有1 d，而对照生长延滞期为4-5 d。

进一步检测经不同酸驯化的栅藻在模拟烟道气（2 d）和2% CO₂（9 d）气体培养条件下，藻液pH值。结果（图 3-B）显示，与对照微藻培养液pH值相比，酸驯化的栅藻连续培养可使培养液pH值在培养初期迅速升高；尤其是经pH4.5酸驯化的栅藻在培养第4天时，其藻液的pH就提高到6。

酸驯化提高了微藻的耐酸性和在低pH条件下起始生长速率，尤其是经过pH 4.5酸驯化的栅藻，生长表型最好（表 1），藻液pH回升快，进而促使微藻生物量增加。

2.3 紫外处理诱导微藻耐酸性

图 4显示不同时间紫外诱导栅藻在设定的培养条件（模拟烟道气2 d，2% CO₂通气9 d）下的pH变化曲线及生长曲线。经过紫外诱导5 min和10 min的栅藻比没有经过紫外诱导的微藻在低pH下生长快（图 4-A），且藻液pH回升也迅速（图 4-B）。表 2所示经过紫外诱导5 min和10 min的栅藻在生长初期的生长速率高于没有经过紫外诱导的微藻生长速率。经过1 min紫外诱导的栅藻的生长情况与对照没有显著差异，而经过紫外诱导15 min的栅藻没有生长，可能是由于长时间紫外照射杀死藻细胞。经过紫外诱导5 min的栅藻在生长初期平均生长速率最大，对初始低pH环境适应能力最强。

2.4 酸驯化和紫外诱导复合处理对微藻耐酸性影响

为了进一步提高栅藻的耐酸性，本实验对栅藻进行酸驯化和紫外诱导叠加处理。如图 5所示，经过酸驯化和紫外诱导复合处理的栅藻比对照组适应低pH，图 5-A。叠加处理的种子藻在初期培养3 d内，就使藻液pH就回升到6（图 5-B）。复合处理的栅藻生长初期的平均生长速率达到0.253 g/（d·L），明显高于单因子处理的pH4.5酸驯化（0.132 g/（d·L））和紫外诱导5 min（0.092 g/（d·L））的生长速率。表明酸驯化和紫外诱导相结合可以进一步增强栅藻耐低pH培养环境的能力。

3 讨论

用微藻来固定烟道气中的二氧化碳和氮硫氧化物是一个环境友好的解决方案。然而，烟道气通入培养液时，高浓度的二氧化碳和氮硫氧化物会造成培养液的酸化、pH偏低，对微藻生长造成了很大影响。蒋银莉^[7]研究发现烟道气通入培养液引起培养液pH下降（小于3.5）的主要原因是其中氮硫氧化物；刘琪^[8]以栅藻为材料，接种在初始pH值为3.6的培养基中，接种2-4 d后细胞密度下降60.6%，大部分栅藻细胞褪色；张虎等^[9]以小球藻为材料，培养基的pH值在低于7.0，高于9.0，其光合放氧、生长速率、生物质产率、总脂含量和产率都显著降低；吴运东等^[10]研究证实胞外碳酸酐酶活性随着pH的下降而下降，同时PSⅡ光合效率和叶绿素a合成下降。这些报道与本研究显示低pH值培养液严重阻滞接入微藻起始生长的结果一致。

已有研究显示，培养液pH的变化与接入微藻的生长快慢存在一定的关系。微藻本身光合作用及其生长可调节藻液pH，藻液pH的改变反过来也影响微藻的光合和生长过程。高文涛等^[11]发现微藻光合作用中碳酸酐酶起催化作用，并会产生OH^-，产生的OH ^-被输送到细胞外，导致藻液pH升高。本研究也发现在接入栅藻后，随着微藻的生长，培养液的pH很快开始上调，起始pH 3.5的培养基在第3天就上升到pH7左右。如果能提高种子藻的耐酸性和在接入低pH培养基后的起始生长速率，由于微藻的快速生长就可使培养液pH迅速升高至中性pH。反过来中性pH更有利于微藻生长，进一步使微藻培养系统pH调控能力得以提高和实现高生物量微藻的生产。因此，培育高耐酸性藻种或者通过抗性驯化提高用于规模化养殖的种子藻耐酸性则是解决培养液酸化的根本有效的途径^{[12, 13]}。

本研究则是通过对种子藻进行抗性驯化处理（酸驯化和紫外诱导）以提高用于规模化养殖的种子藻耐酸性和在低pH环境下的起始生长率。供试栅藻藻株本身最适生长pH为7，在pH3.5及以下时，生长严重受阻，即耐酸性差。过低的pH（ < pH 3.5）是制约微藻起始生长的主要因素。如果在低pH时，微藻能够快速生长，培养液pH就可较快地上升至正常生长pH。显然，提高种子藻耐酸性和在低pH条件下起始生长速率，将有助于克服烟道气酸化条件对微藻起始生长的严重抑制，提高微藻生物量和固碳水平。经驯化后，该栅藻藻株的种子藻在接入低pH培养基初期（5 d以内）不仅存活率高，而且生长迅速并大量吸收通入培养液中的CO₂，进而使藻液pH迅速上调至正常范围使微藻生长处于适宜状态。经过pH 4.5酸驯化后和紫外诱导5 min处理后，供试栅藻适应低pH的能力和起始生长速率显著提高，在低pH环境下的生长延滞期大幅缩短。紫外诱导和酸驯化相结合则会进一步提高栅藻的耐酸性平均起始生长速率达0.253g/（L·d），高于单因子pH 4.5酸驯化和紫外诱导5 min的栅藻平均起始生长速率（0.1322 g/（L·d）和0.092 g/（L·d））。

诸多研究显示，在抗逆性驯化/锻炼过程中，植物抗性相关基因被诱导激活表达，相应地细胞生理生化发生适应性改变。例如，对植物进行胁迫处理，常导致参与抗性反应的DREB转录因子的上调表达，细胞抗氧化酶系统活性增强和一些抗性化合物的积累，杨瑾等^[14]氮胁迫下提高了雨生红球藻细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量。因此推测酸驯化和紫外诱导提高微藻耐酸性和起始生长率的分子机理可能源于微藻抗逆性相关基因表达的弹性以及细胞生理生化的适应性变化。经过驯化的植物抵御胁迫能力显著提高，尽管这种获得的抗性不能遗传，但也是农业生产上常用的提高农业植物抗逆性的一个有效措施，如董爱玲等^[15]通过低温驯化比未经驯化的茄子提高了在低温胁迫下脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等含量。微藻经胁迫驯化处理后，也可提高其抗逆性。例如，饶本强等^[16]通过低温驯化提高了伪枝藻在低温胁迫下的生物量和生物活性。未来培育高效固碳、高耐酸性、高耐氮硫氧化物以及高生长率的工业微藻藻株依然是利用微藻直接固定转化烟道CO₂的重要研究领域。

4 结论

本研究从生产应用出发，以提高种子藻在接入低pH培养基初期（5 d左右）的耐酸性和起始生长率为目标，建立了酸驯化和紫外诱导处理提高种子藻耐酸性和起始生长速率的简便方法。酸驯化和紫外诱导处理能显著增强种子藻在接入培养基初期抵御酸性环境的能力、促使藻液pH迅速上调至中性和有利于应用烟道气培养微藻体系正常运转。