2. 昆明理工大学建筑与城市规划学院，昆明 650500;
3. 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201;
4. 云南师范大学生命科学院，昆明 650500
2. Faculty of Architecture and City Planning, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500;
3. Faculty of Landscape and Horticulture, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;
4. School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650500
短链还原酶家族(Short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs)是迄今为止发现的最古老、最大的蛋白质超家族之一，存在各种生物形式中，如古细菌，原核生物，真核生物和病毒等[1-2]。SDR家族成员在脂类、氨基酸、碳水化合物、激素类、异生物质代谢和氧化还原反应传感机制中发挥重要作用。它们通常催化NADP(H)依赖的反应，其底物包括多元醇、类维生素A、类固醇、脂肪酸的衍生物和异源物质等[3-4]。已报到的SDRs具有广泛的生物学功能，不仅通过参与许多重要内固醇化合物的合成来调控植物生长发育，如油菜素内酯和强心苷等，还参与植物的胁迫应答。半定量RT-PCR分析证实，在草莓果实发育过程中，草莓短链还原酶基因FaSDR的表达量随着果实的着色快速升高，揭示该基因可能参与草莓果实成熟调控[5]。拟南芥的一个短链还原酶基因AtHSD1通过调节油菜素内酯生物合成，来调控植物的生长和发育[6, 7]。类固醇5α-还原酶(DET2)也属于SDR家族一员，是油菜素类固醇物质生物合成途径的限速酶，GbDET2基因在棉花纤维的起始和快速伸长过程中发挥着重要的作用[8]。从甘蓝型油菜中克隆的β-酮脂酰辅酶A还原酶基因BnKCR1和BnKCR2在植株中普遍表达，并在种子与根系中的表达最丰富，在酵母中异源表达这两个基因恢复了酵母脂肪酸延长酶的活性[9]。胡椒(CaMNR1)和拟南芥(AtSDR1)中的薄荷酮新薄荷醇还原酶(MNR)基因增强了植物对多种病原菌的抗性[10]。
类固醇5β还原酶5β-StR(3-o-Δ4，5 steroid 5β-reductase)也是SDR家族的一员，能够催化多种类固醇基质，在内固醇化合物生物合成途径上发挥作用。目前对于植物5β-StR的研究报道较少，Herl等[11]在2009年报道了一个拟南芥内固醇5β还原酶基因At5β-StR，其蛋白序列和三维模型都与毛花洋地黄(Digitalis lanata)黄体酮5β还原酶(Dl5β-POR)相似度较高，5β-POR是一种类固醇化合物—强心苷生物合成途径上的重要催化酶。半定量RT-PCR发现拟南芥At5β-StR在茎和根中表达量最高，并且在甘露醇诱导20 h后的表达明显增强，推测At5β-StR还参与植物渗透胁迫调控。同年，Edyta等[12]研究报道5β-StR因为其碳碳双键活性，所以催化能力要强于5β-POR。
小桐子(Jatropha curcas L.)又叫做膏桐、小油桐、老胖果、油芦子、麻疯树等。原产热带美洲，分布于我国广东、云南、四川、贵州、广西等省区[13]。小桐子果实含油率高达60%，可以提练出不含硫、无污染、符合欧四排放标准的生物柴油，是中国重点开发的绿色能源树种[14]。小桐子不择土壤，耐干旱瘠薄，又是干热河谷地区荒山造林的优良树种，具有广泛的开发利用前景[15-16]。本研究从小桐子中克隆得到一个类固醇5β还原酶基因Jc5β-StR，进行蛋白质序列和功能结构上的探讨，并分析其在不同组织和非生物胁迫下的表达变化，以期为进一步研究5β-StR基因的作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料供试材料小桐子(Jatropha curcas L.)取自于云南省昆明市昆明理工大学现代农业工程学院实验基地。取小桐子根、茎、叶、花、果皮和授粉后不同发育阶段(10、20、30、40、50和60 d)的种子，立即液氮速冻后保存在-80℃的环境中备用。每种组织从10株小桐子树上取样，来源于3株树上的组织混合作为1个组织样品，4次重复。
实验处理材料为稳定成熟期的小桐子幼苗，取长势基本一致的小桐子幼苗分别放置于NaCl(250 mmol/L)培养液、30% PEG 6000培养液和4℃培养箱中，机械损伤用消过毒的剪刀在每个小桐子叶片上各剪5下，注意不要剪断叶片主脉。4种处理后的0(对照)、3、6、12和24 h取幼嫩的叶片。各处理3次重复，材料用锡箔纸包好，立即液氮速冻后保存在-80℃的环境中备用。
1.2 方法 1.2.1 RNA的提取和cDNA第一链的合成小桐子RNA用TianGen公司植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Kit，DP432) 提取，cDNA链合成用大连宝生物公司(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)试剂盒，操作过程参考说明。产物放置于-20℃备用。
1.2.2 基因克隆Jc5β-StR基因克隆特异引物设计为Jc5β-StR-F(5' -CCTCAGCCACCAACTACTA-3' )和Jc5β-StR-R(5' -GTTCAAATCAAGGCACAAT-3' )，PCR扩增用大连宝生物公司的Taq酶(TaKaRa Ex Taq Hot Start Version)和5×PCR buffer，cDNA模板加入量为2 μL，操作过程均参考说明。PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃延伸5 min。将PCR产物连接到pMD18-T并双向测序，每个基因至少5个克隆。
1.2.3 cDNA序列及其编码氨基酸分析用NCBI网站中的ORF finder找出基因的开放读码框(open reading frame，ORF)和其BLASTp程序进行同源性分析; 用DNAMAN软件进行核酸翻译和多序列对比，采用MEGA7.0 Neighbor-joining方法构建进化树进行亲缘关系分析。利用ProtParam在线软件分析氨基酸残基数目、组成和蛋白质的基本性质等参数。利用ExPASy在线分析蛋白质一级结构和预测蛋白质功能位点。通过在线软件SOPMA预测蛋白质二级结构。用Modeling程序(http://swissmodel.expasy.org/)对蛋白质的三级结构进行预测。跨膜结构预测用TMHMM-2.0 server，信号肽预测用SignalP。
1.2.4 基因的表达分析用实时荧光定量PCR方法进行基因表达分析。根据测序结果设计特异引物序列为Jc5β-StR-qF(5' -GATTTGCCCAGATTAGACG-CT-3' )和Jc5β-StR-qR(5' -CAATCCCTCCTTCTTCGC-TAC-3' )。内参基因序列设计为β-actin-F(5' -GCAG-GCATCCACGAGACTACT-3' )和β-actin-R(5' -GTCA-GCAATACCAGGGAACATAG-3' )。分别对反转录后不同组织和不同处理材料叶片cDNA进行实时荧光定量PCR分析。反应体系为：2 μL cDNA模板、12.5 μL Premix TaqTM、0.5 μL Jc5β-StR-qF、0.5 μL Jc5β-StR-qR、加dd H2O至25 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃预变性30 s，59℃退火1 min，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，35个循环。根据厂商推荐，在罗氏LightCycler 480系统上进行。每个材料做3次独立重复，采用2-ΔΔCT方法分析处理数据，在组织表达分析中用表达量最低的组织作为校正子，在种子发育过程中的时序表达分析用第一发育阶段(10 d)的样品做校正子[17]。用SPSS软件进行显著性分析，Excel 2013作图。
2 结果 2.1 Jc5β-StR基因的克隆用RT-PCR方法对Jc5β-StR进行克隆，琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上观察得到一条大约1 200 bp的产物(图 1)，对其测序后，用ORF finder软件分析Jc5β-StR基因编码氨基酸序列，完整的ORF框编码区为1 173 bp，编码蛋白包含390个氨基酸(图 2)。
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| 图 1 Jc5β-StR基因电泳检测图 M：DNA marker; 1：Jc5β-StR的PCR产物 |
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| 图 2 Jc5β-StR全长序列及其推导的氨基酸序列 |
通过ProtParam软件分析表明，Jc5β-StR蛋白相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22，酸性氨基酸残基总数(Asp+Glu)为49个，碱性氨基酸残基总数(Arg+Lys)为34个，不稳定系数为41.40，为不稳定蛋白。原子总数是6 160个，分子式为C2017H3032N520O578S13。脂肪系数为84.31，疏水系数为-0.299，为亲水蛋白。
2.3 蛋白质二级结构及三级结构分析通过在线软件SOPMA对蛋白质进行二级结构预测，结果表明Jc5β-StR蛋白含有丰富的α螺旋(Alpha he1ix)占氨基酸残基总数的40.77%，其次是无规则卷曲(Random coil)占氨基酸残基总数的33.08%，延伸链(Extended strand)占氨基酸残基总数的17.18%，β-转角(Beta turn)占氨基酸残基总数的8.97%(图 3)。
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| 图 3 Jc5β-StR蛋白质二级结构 序列全长390个氨基酸; 竖线由长及短分别是α-螺旋，延伸链，β-转角和无规则卷曲 |
通过Prosite在线数据库分析，发现Jc5β-StR蛋白序列含有3类功能位点包括2个N-糖基化位点(N-glycosylation site)，7个豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)和7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(Casein kinase Ⅱ phosphorylation site)。登录http://swissmodel.expasy.org/中的MODELING，对小桐子Jc5β-StR蛋白三级建模，结果显示Jc5β-StR蛋白质三级结构模型以黄体酮5β还原酶(5β-POR)为模板，序列相似度为74.86%，建模结果如图 4所示。
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| 图 4 Jc5β-StR蛋白质三级结构 |
蛋白质亚细胞定位预测Jc5β-StR最有可能定位在细胞质。跨膜结构预测结果表明Jc5β-StR不具有跨膜结构域。信号肽预测结果表明Jc5β-StR不具有信号肽，说明它不是一个分泌蛋白。
2.5 Jc5β-StR序列一致性分析通过NCBI Blast序列比对发现5β-StR基因在多种植物中均存在，Jc5β-StR与大戟科蓖麻(Ricinus communis)序列一致性最高，为87%;其次与胡桃科核桃(Juglans regia)序列一致性为83%，与梧桐科可可树(Theobroma cacao)序列一致性为82%;与蔷薇科白梨(Pyrus bretschneideri)序列一致性为81%;与芸香科甜橙(Citrus sinensis)、锦葵科陆地棉(Gossypium hirsutum)、蔷薇科苹果(Malus domestica)和梅(Prunus mume)等序列一致性为80%;与大豆(Glycine max)、辣椒(Capsicum annuum)、油菜(Brassica napus)等其他几十种植物序列一致性为75%-79%。Jc5β-StR与不同种类植物序列一致性较高，说明该基因在植物进化过程中较保守。
Jc5β-StR属于NADB Rossmann超家族(图 5)。该蛋白编码一个短链还原酶家族(SDRs)的黄体酮5β还原酶(5β-POR)，Jc5β-StR也有含有SDRs的6个保守结构域(图 6)，表明Jc5β-StR是一个短链还原酶。结构域Ⅰ-Ⅲ在所有NADP依赖的SDRs中都存在，是典型的SDRs结构域，余下的3种Ⅳ-Ⅵ结构域，不是所有的SDRs都存在，特别是Ⅴ结构域(NFYYxxED)，是5β-POR类的典型结构域[11]。
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| 图 5 Jc5β-StR保守结构域预测 |
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| 图 6 Jc5β-StR与不同物种5β-StR氨基酸序列对比 横线序列Ⅰ-Ⅵ为SDRs的6个保守结构域; XP_012068258小桐子; NP_001310703蓖麻; XP_018836149核桃; XP 009360382白梨; XP 006472269甜橙; XP 016687805陆地棉 |
用MEAG7.0软件对Jc5β-StR蛋白氨基酸序列和其他植物的5β-StR蛋白进行进化分析，结果表明，Jc5β-StR的进化基本符合植物分类学分类，并具有明显的种属特性，如属蔷薇科的苹果和梨组成一个分支，Jc5β-StR与大戟科蓖麻聚在一枝(图 7)，说明其与蓖麻亲缘关系最近。
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| 图 7 不同植物5β-StR氨基酸序列进化树分析 标尺代表遗传距离; 数值代表从1 000次重复计算得到的Bootstrap百分比值 |
以β-actin作为内参，对小桐子Jc5β-StR在不同组织和种子不同发育阶段的表达情况进行qRT-PCR分析，分析结果表明，Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达，在种子和叶片中的表达量显著高于其他组织。Jc5β-StR在种子发育过程中的定量分析(图 8) 表明，该基因在种子整个生长发育期都有表达，在种子生长发育前期其表达水平不断增加，在种子生长发育的后期(50 d)达到最高值，然后下降。
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| 图 8 Jc5β-StR基因在不同组织(A)和种子不同发育时期(B)的表达 各柱状图上不同小写字母表示数据间差异显著(P < 0.05)，下同 |
Jc5β-StR在PEG、NaCl、机械损伤和低温4℃处理下表达都不同程度提高，PEG处理下表达水平变化显著，在第12 h达到最高值，为对照样品表达量的6倍左右。NaCl处理下12 h达到最高值，为对照样品的1.8倍左右。机械损伤处理下第6 h达到最高值，为对照样品的3.7倍左右。4℃处理下Jc5β-StR在第3小时表达水平就达到最高值，为对照样品的2.5倍左右，之后缓慢下降(图 9)。
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| 图 9 小桐子Jc5β-StR基因在不同非生物胁迫处理下的表达 |
本研究通过RT-PCR方法从小桐子中克隆了一个小桐子类固醇5β还原酶基因(Jc5β-StR)，分析其ORF大小为1 173 bp，编码蛋白包含390个氨基酸。预测其相对分子量为44.23 kD，理论等电点为5.22。蛋白质亚细胞定位预测其定位在细胞质，没有跨膜结构域，也不具有信号肽。Blast结果表明Jc5β-StR属于NADB Rossmann超家族。其序列与同属于大戟科的蓖麻5β-StR序列一致性最高，为87%，进化树分析表明其与蓖麻5β-StR亲缘关系最近。该蛋白编码一个短链还原酶家族(SDRs)的黄体酮5β还原酶(5β-POR)，也含有SDRs的6个保守结构域，证明Jc5β-StR是一个短链还原酶。
类固醇化合物对植物生长发育过程具有调节作用，Mandava报道了甾和皂苷对某些植物的生长过程均有调节作用，特别是甾醇和性激素对一些植物的生长具有促进作用[18]。种子作为小桐子的生殖器官，在发育过程中大量合成和累积类固醇化合物，结合本实验定量分析结果，Jc5β-StR在小桐子种子中高表达，并且在种子生长发育期表达量上升，种子成熟期(50 d)表达量达到最高值后下降，表达量变化过程与种子生长发育趋势一致，进一步验证了5β-StR在类固醇化合物生物合成途径上的重要作用。保守结构域预测还表明Jc5β-StR也属于SDRs家族一员，已报到的SDRs广泛参与植物的初级代谢和次级代谢，在植物生长发育和抗逆机制中发挥重要作用[5-11]。本研究小桐子幼苗在PEG、NaCl、机械损伤和低温这4种非生物胁迫处理下Jc5β-StR基因表达量都不同程度上调，由此推测Jc5β-StR也参与小桐子非生物胁迫应答。本研究为深入了解5β-StR基因的功能和小桐子的抗逆机制奠定了基础。
4 结论本研究报道了小桐子的一个内固醇5β还原酶基因Jc5β-StR。序列全长1 173 bp，编码390个氨基酸。该基因编码的蛋白含有SDRs的6个保守结构域。Jc5β-StR具有组织表达特异性，在种子中表达量最高，还受多种非生物胁迫诱导上调表达。
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