2. 成都市第三人民医院病理科，成都 610031
2. Department of Pathology, the Third People's Hospital of Chengdu, Chengdu 610031
在全世界范围内，肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最为常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居所有肿瘤第二位[1]。目前除了肝移植、手术以及放化疗等治疗手段外，分子靶向药物在治疗肝细胞癌方面也取得了许多重要的进展[2]。目前靶向肝细胞癌药物主要包括化学药物和多肽药物，其中索拉菲尼、舒尼替尼、瓦他拉尼等分子靶向化学药物已在临床上应用[3]。除此之外，靶向肝细胞癌的多肽药物的研究也取得明显进展，多肽药物是由人工合成的或经分离纯化得到的活性多肽，先前研究发现一些小分子多肽在抑制肿瘤的发生与发展中起着重要的作用。例如，蛋氨酸脑啡肽（Methionine enkephalin，MENK）是具有增强体液免疫和提高细胞杀伤作用的内源性多肽，研究表明MENK通过精确调控树状细胞的阿片类药物受体介导的功能来发挥抗肿瘤的活性[4]。研究证实从家蚕幼虫中分离得到的抗菌肽CecropinXJ能抑制肝癌细胞的生长并诱导凋亡，这暗示着CecropinXJ或许可作为抗肝癌的多肽药物[5]。
本实验室前期通过噬菌体随机12肽库筛选得到了一个多肽9R-P201，实验证实9R-P201可显著抑制肝癌HepG2细胞的存活、增殖和迁移并诱导凋亡[6, 7]。为了探寻多肽9R-P201在转录组水平抑制肝细胞癌的形成发展的机理，本研究利用转录组测序对9R-P201处理HepG2细胞前后的基因表达谱进行分析，筛选出了一系列差异表达基因，并证明其生物学功能。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞HepG2细胞株来自于四川大学生命学院，由本实验室保管；9R-P201购自上海强耀生物科技有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司；100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素购自Hyclone公司；胎牛血清购自Biowest公司；Trizol Regent购自Invitrogen公司；转录组测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养HepG2细胞用含有10%胎牛血清（Biowest），100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素（Hyclone）的DMEM培养基（Gibco），并置于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞3.0×105个接种于6孔板中，培养过夜至细胞融合度达到80 %左右，用80 μg/mL的9R-P201（上海强耀生物）作用于HepG2细胞，处理24 h后，收集细胞用于后续的RNA提取。
1.2.2 RNA提取及质量检测收集好的9R-P201处理和未处理的HepG2细胞用Trizol试剂（Invitrogen）按试剂说明书提取细胞总RNA。1 %琼脂糖凝胶电泳和酶标仪（Biotech）鉴定RNA的纯度、浓度及完整性，合格的总RNA保存于-80℃冰箱待用。
1.2.3 RNA文库构建、测序RNA检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠进行富集并随机打断，以短片段RNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase和DNA polymerase I合成二链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，最后进行PCR富集得到链特异性cDNA文库，使用Illumina HiSeq 4000测序仪进行文库测序。
1.2.4 转录组测序数据的处理、比对和组装测序原始测序数据通过去除带接头和低质量的reads后获得高质量的clean reads。使用Tophat2软件将clean reads比对到hg19参考基因组上，用Cufflinks软件按照hg19参考基因组进行组装[8]。
1.2.5 可变剪接鉴定、基因融合事件鉴定和SNP位点分析使用rMATS软件进行可变剪接的鉴定，在本次转录组测序分析中我们主要对常见的5种可变剪接类型进行统计。使用tophat-fusion软件来鉴定基因融合，最后使用Circos可视化工具来绘制基因融合示意图[9]。将每个样品的测序结果与参考基因组相比，使用SAMTOOLS软件检测SNP位点，并使用ANNOVAR工具对SNP位点进行注释[10]。
1.2.6 差异表达基因及功能富集分析采用Audic S算法进行差异表达分析，将错误发现率（False discovery rate，FDR）校正后的q < 0.05且差异倍数|log2FC|≥1的视为差异表达基因，并对筛选得到的差异表达基因进行聚类分析。利用GO数据库和KEGG数据库对差异表达的基因进行GO与信号通路富集分析，以q < 0.05为显著性阈值[11, 12]。
2 结果 2.1 转录组测序与差异分析基因分析转录组测序得到对照组和处理组总的reads数分别有46 698 580和39 332 045条，过滤得到clean reads数所占的比例分别为99.45%和97.46%。本次转录组测序共检测到18 152个基因，按照差异表达筛选标准得到差异表达基因403个，其中上调269个下调134个，我们对筛选得到的差异表达基因分析表明9R-P201处理后基因整体呈上调趋势（图 1）。
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| 图 1 差异表达基因分析 A：差异表达基因在对照组和处理组中表达水平比较的箱线图；B：差异表达基因的聚类热图 |
对常见的5种可变剪接类型的数量进行了统计，结果发现在本次转录组测序中一共检测到276个可变剪接，其中外显子跳跃（Exon skipping，ES）最多有126个而内含子保留（Intron Retention，RI）最少有12个，此外3'端可变剪接（Alternative 3' splice site，A3SS）有54个、5'端可变剪接（Alternative 5' splice site，A5SS）有60个、互斥外显子（Mutually exclusive exon，MXE）有24个（图 2-A）。
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| 图 2 可变剪接、基因融合、SNP分析结果 A：5种常见的可变剪接的鉴定；B：用circos软件对基因融合进行可视化；C：SNP位点的统计结果 |
异常的融合基因可以引起恶性血液疾病以及肿瘤，为此进行了基因融合分析。结果共鉴定得到45个基因融合，发现基因融合事件主要发生在11号、12号和19号染色体上（图 2-B）。在这45个基因融合中，FTH1、GAPDH、KRT7等基因与其它基因发生融合的频率比较高（表 1）。
通过在对照组和处理组进行SNP分析发现在对照组和处理组中分别得到SNP位点2 180个和3 377个，其中对照组的2 180个SNP包括816个非同义突变SNP（Nonsynonymous SNP）和1 364个同义突变SNP（Synonymous SNP），处理组的3 377个SNP包括1 249个非同义突变SNP（Nonsynonymous SNP）和2 128个同义突变SNP（Synonymous SNP）；同义突变SNP和非同义突变SNP中都包括6种类型SNP突变，结果（图 2-C）发现C/T的突变频率最高而A/T的突变频率最低。
2.4 差异表达基因功能分析通过GO和KEGG富集分析对403个差异表达基因进行功能注释，以q < 0.05为显著性阈值。GO富集分析一共富集上34条GO term，包括生物学过程（BP）18条、细胞成分（CC）8条以及分子功能（MF）8条，其中富集上与肿瘤相关的GO term有细胞生长（q = 5.05E-08）、细胞移动（q = 8.19 E-07）、细胞信号转导（q = 9.91 E-06）等（图 3-A）。KEGG信号通路富集分析结果（图 3-B）表明，差异表达基因显著地富集上肿瘤转录失调（q = 4.66 E-08）、细胞因子受体相互作用（q = 3.84 E-06）、细胞间隙连接（q = 3.40E-05）等信号通路。
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| 图 3 差异表达基因功能富集分析 A：差异表达基因的GO功能富集分析；B：差异表达基因的KEGG信号通路富集分析 |
本次转录组测序筛选得到显著性差异表达基因有403个，其中上调的有269个而下调的有134个。GO和KEGG分析结果表明差异表达基因显著参与了与肿瘤相关的生物学进程和信号通路。对5种主要的可变剪接类型进行统计，共得到可变剪接位点276个。本研究中一共得到SNP位点5 557个。在SNP位点中，非同义突变SNP位点有2 065个而同义突变SNP位点有3 492个，同义突变所占的比例在70%左右而非同义突变占30%左右，这与文献报道的结果一致[13]。同时在SNP突变类型中，C/T和A/G突变的频率最高，这可能是因为在人类基因组中存在大量的CpG岛，同时CpG岛中的C常常是甲基化的并容易发生脱氨基而转变为T[14]。另外，我们这些获取的SNP位点还存在一定的假阳性，如肝细胞癌HepG2细胞系经过长时间的培养，其染色体经常存在非整数倍的染色体变化并且包含如删除和复制等的染色体改变，这些染色体的变化会直接影响SNP的检测结果[15]。由于RNA-seq检测的RNA在进行编辑的过程中也会导致序列变异从而可能被错误地注释为SNP，因此一些检测到的序列变异有可能是RNA编辑位点，而不是真正的SNP[16, 17]。此外，由于无法保证对照组与处理组RNA样本的完全一致，多肽9R-P201处理后导致的SNP中还会存在由于对照组与处理组RNA样本不一致导致的SNP假阳性。对基因融合进行鉴定，共得到45个基因融合位点，其中FTH1基因与其它基因发生融合的次数有17次；研究发现FTH1基因在离子储存和转运起重要作用并调控细胞内离子内稳态[18]。
综上所述，这些显著差异表达的基因可能在多肽9R-P201激活的生物学功能和信号通路中起着重要的功能。同时可变剪接、SNP位点、基因融合等基因组结构的改变也暗示多肽9R-P201在这些事件上对肝癌HepG2细胞的调控影响。当然，9R-P201对于肝癌细胞的调控不仅局限于基因来发挥作用，通过发现更多的9R-P201下游调控因子以及信号通路将为基于9R-P201多肽为基础的药物开发将提供更多的支撑。
4 结论在肝癌发生发展过程中涉及多个与癌症相关的生物学过程和信号通路的改变。本研究分析了肝癌HepG2细胞在9R-P201作用下基因差异表达情况、可变剪接、SNP位点和基因融合等。共得到可变剪接位点276个、SNP位点5 557个及基因融合位点45个。此外，还得到显著差异表达的基因403个，其中上调269个，下调134个。基因功能注释结果表明差异表达基因富集上多个与肿瘤密切相关的生物学进程和信号通路，预示这些基因在9R-P201对肝癌HepG2细胞的调控过程中发挥重要的作用。
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