溶菌酶（lysozyme）是广泛存在于动植物的各种组织、体液及分泌物中的一种非特异性免疫因子，于1922年由Fleming发现^[1]。它通过切断细菌细胞壁的肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键而引起细胞裂解^[2]。根据溶菌酶的结构特征、作用方式和生物来源，可以将其分为六种类型：噬菌体T4溶菌酶（phage type）、植物溶菌酶（plant type）、微生物溶菌酶（bacteria type），以及3种动物型溶菌酶：C型（chicken type）、G型（goose type）和I型（invertebrate type）^[3]。就动物来源的3种溶菌酶而言，C型与G型、I型相比，其具有典型的二硫键结构和酶催化活性中心，以致它的结构稳定、抑菌功能显著，故目前已经在食品保鲜、饲料添加剂等领域被广泛应用。例如，李鑫等^[4]报道了溶菌酶作为饲料添加剂可以提高家禽免疫力和预防疾病，还有报道认为它在乳制品保鲜等方面具有良好的应用效果^[5]，但目前商业化的溶菌酶主要从鸡蛋清中提取，价格昂贵，使用成本高；此外，还有报道来源于微生物的溶菌酶在口腔制品中的应用^[6]。然而，迄今为止，水产生物来源溶菌酶的应用几乎未见报道，就它们所栖息的环境而言，较陆生动物更易遭受病原微生物的污染，以致其必然具有更强的免疫系统才能在复杂的环境中抵御病原菌的侵染，而C型溶菌酶作为一种非特异性的抑菌蛋白，在水产生物的免疫系统中发挥了重要作用，也因此成为制备绿色饲料添加剂或水产品保鲜剂的良好候选者。

目前，已发现C型溶菌酶基因存在于斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）^[7]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）^[8]、点带石斑鱼和赤点石斑鱼（Epinephelus coioides，Epinephelus akaara）^{[9, 10]}等硬骨鱼中。此外，在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）^[11]、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）^[12]、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）^[13]和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）^[14]等无脊椎动物中也发现存在C型溶菌酶基因。关于水产生物C型溶菌酶原核表达方面的研究报道较多，例如，来自日本对虾（Penaeus japonicus）^[15]、仿刺参（Apostichopus japonicus）^[16]、赤点石斑鱼^[10]和斑点叉尾鮰^[17]的C型溶菌酶基因已经在大肠杆菌中得到表达。但原核表达系统存在众所周知的缺点，如对表达产物不能进行翻译后加工修饰，以致表达的目的蛋白会形成不溶性的包涵体而缺乏活性^[18]；而巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori）作为真核表达宿主，有助于表达产物空间构象的形成以获得具有生物学活性的重组蛋白，并可进行目的蛋白的细胞外分泌表达以方便表达产物的后续处理，故是目前公认的外源蛋白表达的良好宿主^[19]。然而，迄今为止，基于真核表达系统的水产生物C型溶菌酶的重组DNA表达则鲜有报道，卞曙光等^[20]报道了凡纳滨对虾C型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达，且表达产物显示了对溶壁微球菌（Micrococcus lysodeik）具有良好的抑菌活性。

鉴于斑点叉尾鮰属于抗病力强、对于生态环境的适应能力较强的鱼类，我们在前期致力于鱼类抗菌肽的原核表达研究中，已经选择其作为研究对象，通过逆转录合成了来源于斑点叉尾鮰肝脏的第一链cDNA^[21]。本研究拟以此为基础，首先通过RT-PCR对斑点叉尾鮰C型溶菌酶的基因进行cDNA克隆；将其与真核表达载体pPICZαA连接后，电转入毕赤酵母X-33中，采用甲醇诱导表达；通过固化金属离子亲和层析（IMAC）对表达产物进行纯化后，经MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定其结构；进一步，通过琼脂糖扩散法和酶活力测定考察表达产物的抑菌活性，旨在建立斑点叉尾鮰C型溶菌酶的真核表达系统，为实现对其大规模的制备奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

毕赤酵母X-33和表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司（美国）；克隆载体pMD-19T simple购自TaKaRa公司（日本）；用于抑菌活性测定的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）为本实验室保藏；大肠杆菌DH5α购自天根生物科技有限公司（北京）。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶（Xho Ⅰ、XbaⅠ、Sac Ⅰ）和T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司（英国）；YNB（无机氮原）购自BIOSHARP公司（美国）；DNA分子量标准、蛋白质分子量标准、DNA割胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、酵母DNA提取试剂盒等均购自天根生物科技有限公司；蛋白质分子量标准购自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western Blot分析试剂购自康为世纪生物科技有限公司（北京）。

1.1.3 仪器

实验所用仪器及型号如下：恒温培养箱（XMT-A7000）、恒温摇床（ZHWY-200H），高速冷冻离心机（CT14RD）、恒温孵育器（eppendorf，Thermostat plus）、PCR仪（BIO-RAD，PTC-200）、聚丙烯酰氨凝胶电泳仪（BIO-RAD，PowerPac Basic）、电转仪（BIO-RAD，Gene PulserXcell）、蛋白质纯化仪（BIO-RAD，Profinia Protein Purification System）、赛多利斯切向回流超滤器（VIVAFLOW 200）。

1.2 方法 1.2.1 目的基因的扩增及克隆

利用实验室原有的斑点叉尾鮰肝脏第一链cDNA，参考其C型溶菌酶的全长cDNA序列（NM_001200789），设计用于3次PCR的引物如表 1所示，引物由上海生工生物工程有限公司合成。第一次PCR反应体系（10 μL）：10×Taq Plus Buffer 1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、F1和R1（10 μmol/L）各0.2 μL、模板0.3 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.1 μL、ddH₂O 7.4 μL；反应条件：94℃预热3 min、94℃变性40 s、55.6℃退火30 s、72℃延伸1 min，共循环30次，最后72℃延伸5 min。以第1次PCR产物为模板，利用F2和R2进行第2次PCR，反应体系和条件同上，除了退火温度改为58.9℃。以第2次PCR产物为模板，利用F2和R3进行第3次PCR，反应体系和条件同上，除了退火温度改为58.8℃。将最后一次PCR获得的目的片段“cflyC”与质粒pMD-19T连接后，转入大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.2 重组表达载体pPICZαA-cflyC的构建及鉴定

采用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ对使用第3次PCR产物构建的重组克隆质粒“pMD-19T-cflyC”进行双酶切，获得目的片段“cflyC”后，在T4 DNA连接酶作用下，将其与被同样酶处理过的表达载体pPICZαA连接（16℃，30 min），转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，通过双酶切和DNA测序验证重组表达载体pPICZαA-cflyC是否构建成功。

1.2.3 pPICZαA-cflyC电转入毕赤酵母及阳性转化子的筛选

重组表达载体“pPICZαA-cflyC”经测序确证后，采用Sac Ⅰ对其进行线性化处理，经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收DNA，通过电击法将其转入感受态毕赤酵母X-33中（电击条件：1 500 V、25 μF、200 Ω、5 ms），然后涂布于含100 μg/mL博来霉素的YPD平板（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%琼脂粉、2%葡萄糖）上，29℃培养3 d；挑取部分菌落分别接种在含更高浓度梯度博来霉素的YPD平板上，筛选高拷贝酵母转化子。同时，还将酵母细胞涂布于MM平板（YNB 13.4 g/L、甲醇5 mL/L、生物素0.4 mg /L、琼脂15 g/L）上以筛选甲醇利用快速型酵母转化子。对筛选到的酵母转化子提取基因组DNA，采用通用引物（5'AOX1：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）进行PCR鉴定。

1.2.4 重组cflyC的诱导表达及Western blot分析

挑取一个阳性转化子接种于5 mL YPD培养液中扩大培养24 h，取500 μL转接至50 mL MGY培养基（34%YNB 5 mL、10%甘油5 mL、0.02%生物素100 μL、1 mol/L磷酸钾缓冲液5 mL）培养24 h，再转入50 mL MM培养基（34% YNB 5 mL、甲醇250 μL、0.02%生物素100 μL、1 mol/L磷酸钾缓冲液5 mL），每隔24 h补加甲醇至终浓度0.5%。培养条件：pH 6.0、29℃、250 r/min；表达时间：24、48、72、96、120、144 h。各个表达时间的培养液经离心（11 000 r/min，15 min）取上清进行蛋白质沉淀（丙酮:上清=4:1），沉淀用于Tricine-SDS-PAGE分析（5%浓缩胶、12%分离胶、0.1 mol/L Tricine）；经Tricine-SDS-PAGE分析后的凝胶用于Western blot分析，100 V恒压1 h，将蛋白转至PVDF膜上，依次用抗his标签鼠单克隆抗体和HRP标记山羊抗鼠IgG孵育，最后采用HRP-DAB显色试剂盒显色。

1.2.5 表达产物的纯化及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定

选择表达时间为144 h的酵母转化子，对其进行1 000 mL的扩大培养，培养液经离心（11 000 r/min，15 min）后，收集上清过0.22 μm滤膜，通过切向回流超滤器对其进行超滤浓缩；浓缩液上蛋白质纯化仪，根据仪器使用说明书进行蛋白质纯化，采用Folin-酚法测定蛋白质浓度。经Tricine-SDS-PAGE电泳后切下目的条带，由上海中科新生命生物科技有限公司进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定。

1.2.6 重组cflyC的抑菌活性测定

将处于稳定生长期的枯草芽孢杆菌与营养琼脂混合（1:1 000，V/V）倒平板，凝固后打直径为6 mm的孔，加入50 μL含重组cflyC的培养液上清，37℃培养12 h，观察有无抑菌圈；同时，以50 μL含空质粒的酵母转化子的培养液上清为阴性对照。另一方面，取50 μL纯化的重组cflyC与150 μL稳定生长期的枯草芽孢杆菌混合，30℃恒温振荡培养2 h，每间隔1 min测定OD450的吸光值变化，以考察重组cflyC的酶活力^[17]；以鸡蛋清溶菌酶为阳性对照、PBS为阴性对照。

2 结果 2.1 目的基因的PCR扩增及测序

第一次PCR获得650 bp的编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶的全长cDNA片段（图 1-A）。第2次PCR获得411 bp的5'端依次含Xho Ⅰ位点和信号肽酶切位点Kex2、3'端含6×His标签的cDNA片段（图 1-B）；第3次PCR获得的是420 bp的在其3'端又添加了Xba Ⅰ位点和终止密码子ATG的目的片段“cflyC”（图 1-C）。将其与克隆载体pMD19-T连接后，测序结果如图 2-A所示：在cflyC的5'端成功添加了Xho Ⅰ和Kex2位点，在其3'端成功添加了6×His、ATG和Xba Ⅰ位点。除去各种位点，cflyC编码了由133个氨基酸残基组成的重组目的蛋白（127个残基的成熟肽+6个组氨酸）；8个保守的半胱氨酸残基和2个活性位点的氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）位于成熟肽中。

2.2 基于双酶切的重组表达载体pPICZαA-cflyC的鉴定

重组表达载体pPICZαA-cflyC的构建如图 2-B所示。采用质粒提取试剂盒从大肠杆菌DH5α中提取pPICZαA-cflyC后，经Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳后，在近目标分子量处显示了1个明显的目的条带（图 3）。另一方面，以5' AOX1为引物对其进行DNA测序，结果显示目的基因cflyC已连接至表达载体pPICZαA（DNA测序结果未显示），未发生任何核苷酸变异。由此证明，重组表达载体pPICZαA-cflyC已被成功构建。

2.3 重组酵母转化子的筛选及鉴定

将上述经测序确认的pPICZαA-cflyC电转入毕赤酵母后，首先在含低浓度博来霉素的培养基上筛选到数个长势良好的菌落，然后将其分别接种于含500 μg/mL博来霉素的培养基和MM培养基上，筛选到4株在该两种培养基上均长势优良的高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子。将它们接种于YPD培养液中培养24 h后，提取其酵母基因组DNA为模板，采用载体上的通用引物5'AOX1和3'AOX1进行PCR鉴定，结果如图 4所示，4株酵母菌均在理论分子量916 bp处有明显条带；而含空质粒pPICZαA的酵母转化子则未见此条带。

2.4 分时段的诱导表达结果及Western blot分析

用丙酮对诱导表达0、24、48、72、96、120和144 h的培养液上清进行沉淀后，经Tricine-SDS-PAGE分析，结果（图 5）显示，随着表达时间的延长，在理论分子量15.1 kD处的条带逐渐加深，至144 h时，条带显示最深，故选择该时间作为扩大培养时的表达时间。进一步将凝胶上的条带电转至PVDF膜，与抗His标签的鼠单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（二抗）反应，进行Western blot鉴定，由于在转膜过程中蛋白条带可能会发生偏离，结果（图 6）显示在16 kD附近有明显杂交条带，而2个空白对照均未见任何条带，此结果初步证明重组cflyC在毕赤酵母X-33中得到成功表达。

2.5 重组cflyC的纯化及其基于MALDI-TOF-TOF质谱的结构鉴定

将扩大制备1 L的培养液上清经切向回流超滤浓缩10倍后，通过IMAC柱层析和脱盐后的产物经Tricine-SDS-PAGE分析（图 7-A）显示，在近理论分子量15.1 kD处有单一条带，证明获得了纯化的产物，福林酚法测得其浓度为550 μg/mL，推算至表达量为2.75 mg/L。将此条带用作MALDI-TOF-TOF质谱分析（图 7-B），结果共捕获到7个肽段，它们由8-20个氨基酸残基组成，大约占了重组cflyC总长的70%；其中m/z为131 5.689 6和226 8.007 3的两个峰最明显，分别表示12个残基（QQGITAWVAWRR）和20个残基（AINHNTDGSTDYGIFQMNNR）的肽段，两者分别位于重组cflyC的第100-111位和第42-61位氨基酸残基；其他肽段分别位于重组cflyC的第3-10、14-33、34-41、62-70、117-133位氨基酸残基。MALDI-TOF-TOF质谱的分析结果证明了纯化的表达产物是预期的重组cflyC。

2.6 重组cflyC的抑菌活性

基于琼脂糖扩散法的测定结果（图 8-A）显示，浓缩10倍后的含重组cflyC的培养液上清对枯草芽孢杆菌显示了明显的抑菌圈，而含空质粒pPICZαA的培养液上清并未显示抑菌圈。另一方面，通过溶菌酶活性测定方法考察了纯化的重组cflyC对枯草芽孢杆菌的抑菌活性，结果（图 8-B）显示，随着重组cflyC与枯草芽孢杆菌作用时间的增加，混合液OD₄₅₀吸光值的下降程度逐渐增大；作为阳性对照的鸡蛋清溶菌酶显示了更明显的抑菌活性；但阴性对照则显示OD₄₅₀吸光值无明显变化。

3 讨论

本研究通过构建毕赤酵母表达系统，在0.5%甲醇、pH6.0、29℃、250 r/min、144 h的表达条件下获得了表达量为2.75 mg/L的重组斑点叉尾鮰C型溶菌酶，经鉴定该重组蛋白具有对枯草芽孢杆菌的抑菌活性，但由于表达量较低，未能进一步考察对于其他不同种类细菌的抑菌活性。关于表达量低的问题可能与使用的编码基因的密码子有关，本研究使用的是通过RT-PCR获得的编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶的天然cDNA，经JAVA Codon Adaption Tool（http://www.jcat.de/Start.jsp）检测存在9个对于毕赤酵母而言的低频密码子。Yang等^[22]将黑曲霉lip2基因进行密码子优化后在毕赤酵母中表达，获得的重组蛋白在酶活力和表达量方面都有明显提高，分别提高了11.6和5.3倍。因此，后续研究拟根据毕赤酵母的密码子偏爱性，对编码斑点叉尾鮰C型溶菌酶的密码子进行优化，以期提高目的蛋白的表达量，为进一步考察重组cflyC的抑菌活性及研究其抑菌机理奠定基础。

本研究构建的重组表达载体pPICZαA-cflyC上的信号肽酶切位点是Lys-Arg残基，而表达的重组cflyC的N末端正好也是Lys和Arg残基（图 2-A），因此，极有可能获得的目的蛋白是N末端缺少了Lys和Arg残基的重组蛋白，其对重组cflyC的空间结构和活性的影响如何还未知。虽然重组cflyC对枯草芽孢杆菌具有一定的抑菌活性，但因为缺乏对其他细菌的抑菌活性测定结果，所以无法判断是否对抑菌谱有影响。针对这一问题，后续研究拟考虑将目的蛋白N末端的Arg残基（碱性）改为His残基（碱性），这样基本上不会改变重组cflyC的结构和等电点等性质。

另一方面，本研究在实验室摇瓶制备阶段，以YNB（无机氮源）作为培养基的氮源，而不是传统的BMMY培养基使用的有机氮源（酵母膏和蛋白胨），不仅节省了成本，也大大方便了培养液的后续处理，并且为今后在发酵罐中扩大制备时对发酵条件的优化和确定提供了极其重要的参考依据。考虑到大规模生产时不可能将纯化产物作为产品，故对含重组cflyC的培养液上清进行了抑菌活性测定，结果证明其具有抑制枯草芽孢杆菌的活性，这为将来进一步扩大制备时确定培养液的后续处理方法及产品的形式奠定了重要的基础。

4 结论

本研究建立了基于毕赤酵母表达系统的斑点叉尾鮰C型溶菌酶的制备方法，确定最佳表达条件为：0.5%甲醇、pH 6.0、29℃、250 r/min、培养时间144 h；表达产物经固化金属离子亲和层析（IMAC）获得纯化的重组蛋白，MALDI-TOF-TOF质谱分析进一步证明该重组蛋白为预期的重组cflyC，分子量为15.1 kD。经测定，重组cflyC对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性。