农药是化学品中毒性较高、降解缓慢的一种物质^[1]，其易随降雨、径流及灌溉水等进入地表水、地下水和土壤等不同区域^[2]。农药进入水体后，易对水中的生物造成影响，严重时可引起水生生物急性中毒，即使未导致生物死亡，也可在生物体内富集，通过食物链危害人群健康^[3]。随着人们环境保护意识的增强和生活质量的提高，农药功用逐渐从杀死转为调控，品种不断更新，全面进入高效化时代。据报道，不同农药在不同环境生物条件下降解速度、生物活性、环境风险等均存在差异^[4]。新型农药的开发被认为是提高效率、减少用量的绿色化学之路^[5]，对于农业生产和环境保护具有重要意义。

腈苯唑(Fenbuconazole)属于唑类农药。唑类农药作为杀菌剂具有高效、广谱、低毒、持续时间长等特点，自1976年以来数10种唑类农药被推向市场^[6]，2003-2004年销售额年增长率为47.7%，在所有农药类别中高居第一位^[7]。吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，该类杀菌剂活性高，杀菌谱广，作用机制独特，对环境友好，是继三唑类杀菌剂之后一个新的里程碑^[8]。恶霜灵(Metoxazon)属于酰胺类农药。酰胺类除草剂在市场中所占份额极大，2009年，我国酰胺类除草剂交易额达15亿元，占我国农用除草剂总金额的18%^[9]。研究发现部分酰胺类农药残效期较长，且具有明显的致突变性^{[10, 11]}。戊菌隆(Pencycurone)属于脲类新型农药，由日本特殊农药公司和德国拜耳公司联合开发的脲类杀菌剂，无内吸性，其具有良好的保护和持效活性^[12]。在法国的河流表面水中，唑类农药，包括腈苯唑，检出的浓度从几纳克水平到最大的微克水平(丙环唑1.75 μg/L，Propiconazole)^[13]。吡唑醚菌酯在美国加利福尼亚的一个河口被频繁检出，每升浓度从几十到两百多纳克^[14]。我国福建省九龙江流域水中农药污染，监测结果显示存在82种农药，普遍的污染浓度达到几十纳克甚至100纳克以上，最高的为腐霉利(Procymidone)(3 904 ng/L)^[15]。孙广大^[16]于2008年在九龙江口及厦门西海域表层水和沉积物中，检测出除传统的有机磷和有机氯农药，苯胺类、酰胺类、唑类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、苯胺基嘧啶等“新型”农药也被大量检出，说明农业地区流域的水环境中存在多种类农药复合污染状况。

研究农药的急性、亚慢性与慢性毒性一般利用水中食物链的代表生物如藻类、蚤与鱼类等，并用得到的实验数据评价农药对水生生物的影响^[17]。斑马鱼(Danio rerio)具有体型小、繁殖速度快、饲养管理简便、其胚胎的整个发育过程透明可见等优点，多数国际组织和国家已将斑马鱼作为制定环境毒性标准的模式动物^[18-20]。经济合作与发展组织(OECD)于1996已制定了详细的操作指南^[21]。

有研究认为斑马鱼胚胎比成鱼对有毒化合物更加敏感，用斑马鱼胚胎为受试生物进行急性毒性研究更为适宜^[22]。近年来关于农药对斑马鱼胚胎发育影响的报道不为少见^{[23, 24]}，其中关于唑类农药对斑马鱼的发育毒性有较深入的研究^{[25, 26]}。但是新型农药在环境浓度下的毒性作用比较鲜有报道。本实验研究腈苯唑、吡唑醚菌酯、恶霜灵、戊菌隆对斑马鱼胚胎发育的毒性作用，通过分析相同浓度分别单独作用及4种农药联合暴露后斑马鱼胚胎的存活率、孵化率、畸形发生率、ATP酶活性以及心脏功能各生理指标，比较常见的4种农药的毒性，为新型农药的合理使用提供科学依据，也为完善农药对水环境污染效应评估标准提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂

戊菌隆(纯度≥96%)、吡唑醚菌酯(纯度≥96%)、腈苯唑(纯度≥96%)、恶霜灵(纯度≥96%)购于Sigma-Aldrich公司；先以丙酮为助溶剂溶解配制浓度为50 μg/L储备液，4℃避光保存。蛋白含量测定及ATP酶活性测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 实验用鱼和鱼卵收集

斑马鱼(WT-U系)喂养根据Westerfield^[27]的方法进行，饲养于厦门大学生命科学学院斑马鱼养殖中心。循环养殖水，水温26±1℃，光照周期14 h光照/10 h黑暗，每天喂食新鲜孵化的丰年虫(Artemia nauplii)2-3次。

实验前1 d晚上，将雌雄鱼按照2:1比例放置在孵化槽中，并用隔板将雌雄分开，第2天早上9点左右打开隔板，开灯给予光照刺激使其交配产卵。0.5-1 h内收集鱼卵，用斑马鱼养殖液清洗并在显微镜下观察，选取受精胚胎用于暴露实验。

1.2 方法 1.2.1 暴露实验

实验前将农药储备液用培养液(3.5 g/L NaCl，0.05 g/L NaHCOl₃，0.05g/L KCl，0.05 g/L CaCl₂)分别配制终浓度为50 ng/L的单种农药曝污液及4种农药混合曝污液(即4种农药分别为12.5 ng/L，总浓度为50 ng/L)，共5个曝污组，并设空白组和对照组(丙酮浓度为0.1%。丙酮作为助溶剂适宜浓度为≤0.1%^[28])，每个实验组设5个平行组。分别置于直径90 mm培养皿中，注入曝污培养液30 mL，每皿培养100枚斑马鱼胚胎。实验期间28±0.5℃恒温培养，每隔12 h更换等量等浓度的培养液并清理死亡胚胎。

1.2.2 相关形态学指标的统计及计算

分别于斑马鱼胚胎12、24、36、48、72 hpf(Hour post-fertilization)时，观察胚胎的存活(肉眼观察胚胎变白或者显微镜下观察胚胎絮状凝结、心脏不跳动即可判定死亡)，统计存活率。48 hpf时，统计孵化率(胚胎出膜并能游动视为已孵化)，72 hpf时统计畸形率(主要指心包囊水肿、卵黄囊水肿和脊柱弯曲)。

存活率(%)=存活胚胎数/总胚胎数×100%

孵化率(%)=已孵化胚胎数/总胚胎数×100%

畸形率(%)=畸形胚胎数/存活胚胎数×100%

1.2.3 心率及相关功能指标的分析

根据Incardona等^[29]、Chen等^[30]的方法测量及计算。将斑马鱼仔鱼(每个处理组设5个平行，每个平行随机取3条)，固定于6%的甲基纤维素中，并于28±0.5℃下静置5-10 min，直到仔鱼心跳稳定后于显微镜下对20 s内心房和心室的搏动次数进行记录并摄影，分别测量心室舒张/收缩末期的长轴(a)，短轴(b)长，记录胚胎20 s内心跳次数，计算1 min心率(HR)、心室舒张/收缩容积(EDV/ESV)、每搏输出量(SV)、心输出量(CO)。采用Incardona^[29]的方法，记录一个完整心跳所经历的时间帧数，每条仔鱼测3次，取3次所得到的数值的标准偏差作为这条仔鱼的心律参数，获得它们的心律参数分析心律不齐。

1.2.4 ATP酶活性测定

选择72 hpf的仔鱼以超纯水荡洗后用液氮速冻，保存于-80℃冰箱。实验前将样品于冰盒上解冻，按1:4的比例加入生理盐水，在匀浆器内仔细研磨。准备好的匀浆液在冷冻离心机上，4℃下，4 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白含量和酶活性。

蛋白含量测定、Na⁺/K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶活性的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。计算酶活力时，定义每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmoL无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmol Pi/mg pro/h)。

1.2.5 数据分析

应用SPSS软件对数据进行处理。结果采用平均值±标准误差(Mean±SE)表示，单因素方差分析(one-way ANOVA)的方法进行统计学分析，组间数据用Tukey HSD法进行显著性水平分析，设定P < 0.05表示差异显著。

2 结果 2.1 四种农药暴露对斑马鱼胚胎存活率及孵化率的影响

斑马鱼胚胎分别经4种农药单独暴露及联合暴露72 h，胚胎的存活率与溶剂对照组相比无显著性差异(结果未显示)。胚胎孵化率，恶霜灵、腈苯唑及联合暴露组与溶剂对照组相比显著下降，吡唑醚菌酯、戊菌隆组无显著差异(图 1)。

2.2 四种农药暴露对斑马鱼仔鱼囊肿率及脊柱弯曲率的影响

图 2、图 3显示，各暴露组的脊柱弯曲率显著上升，其中腈苯唑作用最明显。囊肿率在各农药单独暴露组也表现出明显上升，在戊菌隆、恶霜灵和腈苯唑组出现显著差异，但联合暴露组与对照组无显著差异。

2.3 四种农药暴露对斑马鱼仔鱼心脏功能指标的影响

除恶霜灵与对照组无差异，其他各暴露实验组显示心率显著下降(图 4)；从心室容量的变化而言，恶霜灵及联合作用导致EDV显著上升，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑没有产生显著的影响，而ESV在恶霜灵组及联合作用组与溶剂对照相比无差异，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑暴露使ESV下降(图 5-A)；恶霜灵暴露及联合暴露导致每搏输出量(SV)显著上升(图 5-B)；心输出量CO在恶霜灵组显著增加，在吡唑醚菌酯、戊菌隆和腈苯唑组显著下降，联合作用组与对照组无显著差异(图 5-C)。各农药暴露组均导致仔鱼出现心律不齐，恶霜灵、腈苯唑及联合暴露组呈现心律不齐效应显著(图 6)。

2.4 四种农药对斑马鱼仔鱼ATP酶活性的影响

斑马鱼胚胎经恶霜灵暴露72 h，其仔鱼组织的Na⁺/K⁺-ATP酶活性表现出显著上升，在联合作用组则出现显著降低，其它暴露组均与对照组无差异；Ca²⁺-ATP酶活性在吡唑醚菌酯、恶霜灵、腈苯唑暴露组显著上升，而联合作用组为显著下降(图 7)。

3 讨论

鱼类是对化学污染物较敏感的脊椎动物之一，其胚胎发育阶段更为敏感，生理和器官形成方面更易受到外界环境影响^[31]。心包囊肿、脊柱弯曲等是斑马鱼胚胎毒性检测实验中常出现的毒性反应^[32]。已有研究表明，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺等农药诱导斑马鱼胚胎出现心包囊水肿、躯干弯曲等症状^[23]；戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津等农药在高浓度时对斑马鱼胚胎发育显著表现出心包囊肿和脊柱弯曲^[33]；斑马鱼胚胎在β-氯氰菊酯暴露后幼鱼体轴表现出严重致畸效应^[34]；还有表面活性剂^[35]、四溴联苯醚^[36]、四氯二苯并-p-二噁英^[37]、重金属铜、镉、汞^{[38, 39]}等都会引起斑马鱼胚胎发育畸形。本实验结果显示各农药暴露组对斑马鱼仔鱼出现显著的心包囊和卵黄囊水肿、脊柱弯曲等反应，表明4种农药对斑马鱼胚胎具有发育毒性。

Ca²⁺-ATP酶是质膜上钙离子转运系统中最重要的部分，可利用ATP水解的能量维持细胞内外钙离子浓度^[40]。Na⁺/ K⁺-ATP酶在水生生物体内普遍存在，是横跨质膜的一种固有蛋白，也是组成Na⁺/ K⁺泵活性的主要部分，对维持细胞内离子的转运以及能量代谢有着重要作用^[40]。体轴的弯曲通常是由于体轴肌肉组织损坏，包括肌肉细胞坏死及肌纤维受损，或脊椎骨自身发生畸形所致^[41]。此外，Ca²⁺通道功能紊乱也会导致脊柱弯曲^[41]。本实验结果显示，斑马鱼胚胎在各农药暴露后Ca²⁺-ATP酶、Na⁺/ K⁺-ATP酶活性上升，联合作用中两种ATP酶活性下降，两种ATP酶活性的上升或下降引起Ca²⁺通道功能紊乱都引起脊柱弯曲^[41]。所以，Na⁺/ K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性的改变可能是农药导致斑马鱼胚胎脊柱弯曲的原因之一。ATP酶活性作为生态毒理学指标可以作为水体农药监测的生物标志物^[42]。

心脏作为胚胎发育过程中最早发挥功能的器官，其完善的循环功能对于胚胎正常发育起关键作用。斑马鱼发育过程中心血管在20 hpf开始形成，能够收缩但尚未与发育中的血液循环系统相连，发育至30 hpf时心脏分化出心室和心房，36 hpf时开始规律心跳^[43]。正常生长条件下，48 hpf时主要的器官系统完成形态发生并开始破膜孵化，此时心脏功能已相对比较完善，是斑马鱼胚胎发育进程的一个重要转折点。心率易受外界因素如温度、污染等影响，有研究表明化学污染物暴露会使斑马鱼心率上升或下降^[44]。心律不齐是心血管疾病危害的病症之一，而引起心律不齐的原因很多，研究表明K⁺和Ca²⁺失调在心律不齐中有重要影响^[45]。本实验结果显示4种农药单独暴露后表现心率下降趋势，心室容量有不同程度的上升或下降，致使每搏输出量及心输出量出现上升或下降，从而使各暴露组表现出心律不齐。4种农药的暴露均可致斑马鱼胚胎心脏功能异常。

生物处于胁迫条件下时，酶活性会随之变化，可表现为抑制或诱导，还能反映能量代谢的变化^[46]。本实验结果中各农药单独暴露组Na⁺/ K⁺-ATP酶和Ca²⁺ -ATP酶的活性被诱导，联合作用则抑制了两种ATP酶活性，提示虽然农药的浓度相同，联合暴露对这两种ATP酶活性的影响更大。ATP酶在细胞内具有重要功能^[47]，在离子平衡和渗透压稳态的维持方面具有重要作用^[48]。K⁺和Ca²⁺的转运相互协调和制约共同维持心肌细胞动作电位的稳定^[49]，Ca²⁺ -ATP酶活性的改变会影响心脏功能^{[50, 51]}，所以Na⁺/ K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性的改变也是农药暴露影响鱼类胚胎心脏功能的原因。

4 结论

通过对腈苯唑、吡唑醚菌酯、恶霜灵、戊菌隆等4种新型农药在相同浓度下斑马鱼胚胎的暴露实验，结果表明，在低浓度下4种农药单独作用均可导致斑马鱼胚胎发育的毒性，尤其心脏发育受毒性影响较敏感；从导致脊柱弯曲及心律不齐效应来看腈苯唑毒性最强；Na⁺/ K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶是功能较广泛的酶，联合暴露抑制这两种ATP酶的活性，可能对斑马鱼许多生理活动产生不利的影响。