胸腺素 (Thymosin) 是一类在人类的健康和疾病中发挥不同重要作用的小分子蛋白。根据等电点的不同分为3个家族：胸腺素α(pI < pH5.0)，胸腺素β(pH5.0 < pI < ph7.0)，胸腺素γ(pI > pH7.0)^[1]。胸腺素β10是β族胸腺素中的一个重要成员，属于Tβ4的一种类似物^[2]，包括43个氨基酸残基，具有两个α螺旋结构。目前对Tβ10的研究集中于其在肿瘤^[3-7]、胚胎^[8]、神经发育系统^[9]和炎症细胞^[10-12]中的差异表达，以及Tβ10在血管发生^[13]、细胞生长和凋亡^[14-16]方面的作用。同时，Tβ10被认为与细胞骨架结构有关，影响细胞形态、细胞增殖、运动型等^[17-20]。本实验室通过前期实验结果，发现Tβ10在鹿茸快速生长期高度表达，说明Tβ10可能与鹿茸的生长和再生相关。通过构建梅花鹿Tβ10基因的真核表达载体，以期为研究其在鹿茸生长和再生中的作用机制提供有力的工具。

1 材料与方法 1.1 材料

表达载体VR1012、E.coli DH5α菌株、鹿茸材料和293T细胞由本实验室保存。TRIZOL和双抗购自Invitrogen公司；pMD-18 T vector、反转录试剂盒、PCR相关试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒等购自TaKaRa公司；转染试剂Fugene^®6购自Promega公司；鼠抗HA单克隆抗体和鼠抗Tubulin单克隆抗体购自covance公司；Alexa Fluor 488绿色荧光标记二抗购自Thermo Fisher公司；DAPI购自Roche公司；碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠二抗购自Jackson公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；细胞爬片、6孔板购自Nest公司；其他生化试剂均为国产分析纯或进口分装试剂。PCR引物由长春华大中天生物技术有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

293T细胞培养于DMEM培养基，加入10%血清和1%双抗，37℃，5% CO₂条件下培养。待细胞生长至汇合度90%时传代培养。

1.2.2 鹿茸cDNA的获取

新鲜的梅花鹿茸取下后迅速放入液氮中，冷冻后置于液氮中研磨，0.05 g组织加入1 mL TRIZOL试剂，匀浆后室温静置10 min，加入0.3 mL氯仿剧烈震荡15 s，室温静置2-3 min，4℃条件下12 000 r/min离心20 min，上清加入1/5体积的5 mol/L NaCl混匀，再加入1/3体积的氯仿，震荡15 s，静置2 min，4℃条件下10 000 r/min离心15 min，上清加入1/2上清体积的混合液 (0.8 mol/L柠檬酸钠，1.2 mol/L NaCl) 与1/2上清体积的异丙醇，震荡后4℃放置90 min，4℃条件下10 000 r/min离心15 min，弃上清，75%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，4℃条件下7 500 r/min离心5 min，弃上清，干燥15 min，DEPC水溶解沉淀RNA。使用逆转录酶以及Oligo (dt) 进行逆转录PCR获得cDNA。

1.2.3 Tβ10基因的PCR扩增和亚克隆载体构建

以转录组测序得到的序列设计引物，上游引物：5'-TCTAGAGCCACCATGGCAGACAAGC-3'(引入Xba Ⅰ酶切位点和kozak序列) 下游引物：5'-GGATCCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTTTGCTTGCTTC-3'(引入HA标签和BamH Ⅰ酶切位点) 进行PCR扩增，程序为94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增30个循环，最后72℃延伸10 min。所得片段经胶回收后与pMD-18 T亚克隆载体16℃连接过夜。转化感受态DH5α细胞，接种氨苄抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，提取质粒后进行酶切鉴定和测序鉴定。

1.2.4 真核表达载体构建和鉴定

取测序正确的pMD-18 T-Tβ10-HA质粒和真核表达质粒VR1012分别进行Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，将目的片段和载体片段经胶回收后使用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态DH5α细胞，接种卡那抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，提取质粒后进行酶切鉴定。

1.2.5 VR1012-Tβ10-HA转染293T细胞

在6孔细胞培养板中加入细胞爬片，再将胰酶消化后的293T细胞接种于细胞培养板。在5% CO₂、37℃的细胞培养箱中生长至汇合度达到70%。使用Fugene^®6转染试剂将重组质粒VR1012-Tβ10-HA转入293T细胞。

1.2.6 免疫印迹

转染36-48 h后收集细胞，PBS冲洗1次除去残留培养基，RIPA裂解缓冲液裂解细胞。加入上样缓冲液混合并煮沸10 min致蛋白变性，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离样品。通过半干转仪将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在5%的脱脂牛奶中在室温封闭30 min，PBST溶液冲洗1次，加入含有一抗的1% PBS脱脂牛奶，室温摇动孵育1-2 h或者4℃过夜，弃一抗，用PBST溶液漂洗3次，每次5 min。再加入混有对应二抗的1%PBS脱脂牛奶，室温摇动孵育45 min。再用PBST溶液漂洗3次，PBS溶液漂洗1次，最后加入酶联二抗的显色底物，至特异性条带清晰可见时，终止反应。

1.2.7 免疫荧光

293T细胞接种于放置有细胞爬片的24孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到20%-50%时使用Fugene^®6转染试剂转染VR1012-Tβ10-HA。24 h后弃上清，加入4%多聚甲醛溶液，室温固定10 min。弃去固定液，用0.1%的Triton X-100室温孵育8 min，用含有10% FBS的PBS溶液室温封闭10 min。PBS溶液冲洗1次，加入一抗，室温孵育1-2 h。弃去一抗，用PBST溶液冲洗3次。将对应二抗溶液加入孔板中，室温孵育1 h。弃去二抗，用PBST冲洗3次。加入含有1 μg/mL DAPI的PBS溶液，孵育5 min后用PBS溶液冲洗1次。取出细胞爬片，细胞面冲下倒扣于载玻片上，使用荧光显微镜采集荧光图像，分析蛋白的表达及细胞定位情况。

2 结果 2.1 Tβ10 cDNA的PCR扩增结果

从梅花鹿鹿茸组织中提取细胞总RNA，使用nano drop 2000测定OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.9，通过琼脂糖凝胶电泳可见3条清晰条带，分别为28S、18S和5S (图 1，第1泳道)，说明RNA无污染，纯度较好。经RT-PCR技术获取cDNA，以其为模板，根据转录组测序得到的序列设计引物，进行PCR反应。经琼脂糖凝胶电泳以DNA Marker为对照，在100-250 bp左右可见一条特异性亮带，与预期大小相符 (图 1，第4泳道)。PCR产物经胶回收后，连接至亚克隆载体pMD-18 T (图 2，第3泳道)。质粒线性大小应为2 867 bp，但由于质粒的超螺旋结构，在电泳结果呈现出1 000-2 000 bp大小的条带。连接后的重组质粒经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，在2 000-3 000 bp和100-250 bp两处可见特异性条带 (图 2，第4泳道)，分别为pMD-18 T线性片段及Tβ10-HA片段。提示目的片段成功插入到pMD-18 T载体中。采用通用引物RV-M测序，结果证明插入片段无突变，构建成功。测序结果与转录组数据库中序列匹配率为100%。

2.2 真核表达载体VR1012-Tβ10-HA双酶切鉴定

取测序正确的重组质粒经双酶切获取目的片段，插入到真核表达载体VR1012中，并进行琼脂糖凝胶电泳分析 (图 2)。质粒线性大小应为5 000 bp左右，但由于质粒的超螺旋结构，在电泳结果呈现出2 000-3 000 bp大小的条带。经双酶切鉴定，在5 000 bp和100-250 bp两处可见特异性条带，分别为VR1012线性片段及Tβ10-HA片段，证明VR1012-Tβ10-HA构建成功。

2.3 梅花鹿Tβ10基因及蛋白序列分析

分析梅花鹿Tβ10基因可知，其全长为129 bp，共编码42个氨基酸。预测的与肌动蛋白结合的首要位点为18LKKTET23(图 3)。将梅花鹿Tβ10与人、牛、马、小鼠、大鼠和猪等不同物种的Tβ10基因序列和氨基酸序列进行同源性比较，得出核苷酸同源性分别为86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分别为86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。说明在进化上梅花鹿Tβ10与牛和猪Tβ10较为接近。

2.4 Western blotting分析结果

转染VR1012-Tβ10-HA质粒转染293T细胞，48 h后收取细胞进行Western blotting分析，结果 (图 4) 表明，与转染空载体VR1012的对照细胞样品相比，转染VR1012-Tβ10-HA的样品在6 kD处可见一特异性条带，说明梅花鹿Tβ10基因在293T细胞中得到了表达。

2.5 免疫荧光分析结果

通过荧光显微镜观察可见，转染重组质粒的细胞可见明显的绿色荧光，说明梅花鹿Tβ10基因得到了表达。同时蛋白主要表达于细胞质中，细胞核内几乎无表达。而未转染的293T细胞和转染空载体的阴性对照则未见绿色荧光。再次说明了梅花鹿Tβ10在293T细胞中得到了成功表达 (图 5)。

3 讨论

胸腺素β10是一种普遍存在于各种组织细胞当中的淋巴细胞生长因子，参与多种重要的生理和病理活动，一直是研究的热点。鹿茸是目前发现的唯一可再生哺乳动物器官，鹿茸生长速度极快，最快时可以1-2 cm的速度迅速生长，最终可长至120 cm。鹿茸的快速生长和再生机制目前尚不明确。通过对鹿茸不同生长时期的转录组数据库进行测序分析，发现Tβ10在快速生长期表达量上调，说明其可能与鹿茸的生长发育有一定关系。本研究通过构建梅花鹿Tβ10真核表达载体，为进一步研究其在鹿茸生长发育过程中的作用奠定了基础。

由于鹿茸软骨中存在较多蛋白，本研究采用改良的Trizol法来提取总RNA。该方法可除去绝大部分蛋白及多糖杂质，得到较为纯净的RNA。同时，本研究首次成功克隆得到了Tβ10的基因序列，与人、牛、马、小鼠、大鼠和猪等不同物种的Tβ10基因序列和氨基酸序列进行同源性比较，得出核苷酸同源性分别为86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分别为86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。说明Tβ10在进化上非常保守，梅花鹿Tβ10的氨基酸序列与牛和猪Tβ10更为接近，与人、马、大鼠和小鼠Tβ10的C端有一定差异，这是否会影响梅花鹿Tβ10的功能，是未来要研究的一个内容。

利用本实验所构建的Tβ10真核表达质粒，可以通过瞬时转染或稳定转染软骨细胞，研究Tβ10是否可以促进软骨细胞生长，刺激软骨细胞分化；同时可以利用本研究发现的Tβ10序列，构建原核表达质粒，获得重组Tβ10蛋白，研究其对软骨细胞增值的影响，从而深入探索Tβ10在鹿茸软骨细胞快速增长过程中所起的作用。

4 结论

本研究从梅花鹿鹿茸中获得了Tβ10的cDNA，通过Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点连入VR1012真核表达质粒，成功构建梅花鹿Tβ10真核表达载体，使用Western blotting和免疫荧光技术验证了其在293T细胞中的表达。