真菌在工农业生产与人们日常生活中起着重要作用，一些真菌能用于大规模工业生产制取人类需求的各类产品，如黑曲霉（Aspergillus niger）用于柠檬酸和葡萄糖酸的大规模工业发酵^{[1, 2]}，米曲霉（Aspergillus oryzae）用于大豆发酵、大米糖化以及酒精饮料和米醋的生产^[3]。但不少真菌也是植物病原菌，已有研究表明，植物真菌病害导致全世界农作物产量损失超过10%^[4]，并且部分真菌还会感染人类，对人类健康造成严重问题，如烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）和土曲霉（Aspergillus terreus）的感染可导致人的免疫功能下降，甚至危及生命，而孢子的产生是导致植物病害以及人类感染的主要原因。因此加强真菌生长、孢子形成和发育以及次级代谢的相关研究，弄清其相关调控机制，对人类生活、生产、经济发展以及生命健康等都具有重要作用。

COP9信号复合体（COP9 signalosome，CSN）是一种多功能的蛋白复合物。最早由Wei等^[5]在研究拟南芥光形态学建成机制中发现，该复合体可通过泛素降解途径调节植物对光信号的应答，使植物体完成从暗生长到光形态建成的转换，对植物生长发育、幼苗成活和抵抗病原物应答等起重要作用^[6]。有研究表明，COP9信号复合体能与众多真核生物中蛋白激酶、转录因子、泛素水解酶及泛素连接酶E3等相互作用，影响相关细胞信号通路，对人和动物胚胎的形成与发育^[7]，肿瘤的发生与发展^{[8, 9]}，真核细胞DNA损伤修复^[10]，DNA转录水平的控制^{[11, 12]}，细胞周期及细胞分化、发育^[13]等起重要作用。

关于COP9信号复合体的研究主要集中在人类和动植物中，真菌方面主要集中在构巢曲霉、粗糙脉孢菌、裂殖酵母和酿酒酵母等几个模式真菌^[14]，对其他真菌的相关研究相对较少，国内关于COP9信号复合体的研究起步较晚，真菌COP9信号复合体研究更少。Nahlik等^[15]和Licursi等^[16]的研究表明，COP9信号复合体参与了真菌一系列生理生化过程。本课题组研究发现烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）诱导产孢子囊时COP9信号复合体csn4亚基基因转录拷贝数最大，当硼抑制烟草疫霉菌产生孢子囊时，csn4基因的转录量也显著减少，这暗示csn4亚基可能参与调控烟草疫霉菌孢子囊的产生^[17]。基于以上原因，本文从真菌COP9信号复合体的组成和结构特征、调控真菌生长发育的机制以及协调次级代谢等方面进行综述，以期为进一步研究COP9信号复合体在真菌中的作用提供参考。

1 真菌COP9信号复合体组成及结构特征

除真菌外，COP9信号复合体在真核生物中都由8个亚基（Csn1-Csn8）组成，而真菌的亚基数量不固定^[14]。已有文献报道的5种真菌（都是模式生物）中，盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）有8个亚基，粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）有7个亚基，裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）有6个亚基，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只有一个亚基，即Csn5亚基。但无论亚基数量如何变化，真菌COP9信号复合体均含有Csn5亚基^[18]。这表明Csn5亚基在真菌中的保守性最高且可能对于COP9信号复合体在真菌中发挥作用是必须的。

通常真菌COP9信号复合体含有两个功能结构域：PCI（Proteasome，COP9 and initiation factor 3）和MPN（Mpr1p and Pad1p N-terminal）结构域^[19]。PCI结构域一般存在于Csn1-4、Csn7和Csn8亚基中，而MPN结构域存在于Csn5和Csn6亚基中。进一步对PCI结构域的研究表明，PCI结构域由两个亚结构域（Subdomain）构成：羧基端有一个“翼状螺旋”（Winged helix）结构域；氨基端有一个四肽的重复单位，一直从PCI结构域氨基酸序列的内部延伸到N末端^[20]。MPN结构域分为两类，第一类含有JAMM基序，具有特异性肽酶活性，存在于Csn5亚基中；第二类无肽酶活性，存在于Csn6亚基中^{[21, 22]}。

目前，对于COP9信号复合体结构域的功能研究还不是很清晰。在研究裂殖酵母的Csn1亚基时发现，Csn1与Csn2、Csn3和csn4亚基都有强烈的相互作用，而位于氨基酸序列C端一侧的PCI结构域对于维持亚基之间的相互作用至关重要^[23]，由此推测，PCI结构域的功能是维持亚基之间的有效整合，调节复合体稳定性，从而保证复合体的生物学功能。第一类MPN结构域具有金属蛋白酶活性，这一活性引发与泛素相关的Nedd8（Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8）从CSN的靶蛋白上脱落，即去Nedd化（Deneddylation），从而抑制蛋白质的降解^{[21, 24, 25]}；第二类MPN结构域由于不存在肽酶活性，可能在CSN的组装、稳定性及活性方面起作用。

此外，典型的八亚基COP9信号复合体、26S蛋白酶体“盖子”结构（26S proteasome lid）和翻译起始因子3（Elongation initiator factor 3，eIF3）在氨基酸序列和三维结构上都具有相似性，且COP9信号复合体与“盖子”结构的同源性最高，CSN的每一个亚基都能在“盖子”结构中找到与之相似的亚基。这预示着这些复合体在功能上可能存在某些联系，3种复合体均通过影响蛋白质的合成和稳定性来调控蛋白质水平，eIF3参与蛋白质合成，“盖子”结构参与蛋白质降解，而CSN在蛋白质合成和降解中存在多种功能^[26]。

2 COP9信号复合体调控真菌生长发育的机制

COP9信号复合体在调节真菌蛋白翻译后的加工过程中发挥核心作用。近年来，针对COP9信号复合体生物学功能的研究主要集中在泛素化途径中的作用，通过对E3-泛素连接酶活性的调节来调控泛素化降解途径，从而控制与靶蛋白相关的生命过程，最终调控真菌生长、发育，来响应外界生物和环境因素的变化，使真菌能够更好的适应环境，维持正常的生命活动。

2.1 参与调控真菌泛素化途径

泛素化降解途径是真核细胞内重要的蛋白质控制系统，其主要机理是在ATP的参与下将游离的、非活化状态下的泛素分子（Ubiquitin，Ub）通过E1-泛素活化酶、E2-泛素结合酶、E3-泛素连接酶使泛素分子被激活并泛素化底物，最终形成泛素链，被26S蛋白酶体识别，使得蛋白质降解或活性发生改变，调控大部分生命活动。

COP9信号复合体参与调控泛素化途径主要是通过与Cullins蛋白相互作用。而Cullin蛋白是Cullin-Ring泛素连接酶（CRL，一大类E3-泛素连接酶复合体的统称）的组成部分。SCFs（Skp1-Cullin-F-box）是CRL中最大的群体，由Skp1蛋白亚基将Cullin蛋白和F-box连接形成，F-box蛋白亚基用于识别被标记降解的蛋白质^{[27, 28]}。同时Cullin蛋白通过Nedd8进行修饰即Nedd化（Neddylation），激活CRL泛素连接酶^{[29, 30]}，从而泛素化底物。但是，活化的CRL泛素连接酶不仅能对靶蛋白进行泛素化修饰，还可以催化自身泛素化降解，因此，活化的CRL泛素连接酶很不稳定。而COP9信号复合体的作用底物恰恰是Cullins蛋白，能够将Nedd8从Cullin上脱落下来即去Nedd化（Deneddylation），从而导致基于Cullin的泛素连接酶失活^{[14, 31]}，维持了CRL泛素连接酶的稳定性。因此COP9信号复合体的主要功能是调节蛋白泛素化作用，影响蛋白的功能和稳定性，至于其他调控过程还需进一步研究。

2.2 调控真菌生物节律和光信号响应来影响真菌孢子的形成与发育

典型的真菌发育过程包括无性发育和有性发育两大过程。环境条件适宜时，真菌通常进行无性发育，产生无性孢子，包括游动孢子、孢囊孢子、分生孢子及厚垣孢子。在营养生长后期或环境不适情况下，真菌转入有性生殖产生有性孢子，包括卵孢子、接合孢子、子囊孢子及担孢子。外界环境条件的变化能够影响真菌的发育，尤其是在发育初期，而COP9信号复合体能够响应环境信号，来调节真菌孢子的形成和发育。

目前研究发现真菌模式生物脉孢菌（Neurospora）正常的生物节律受CSN复合体的调控，其机制是磷酸化的生物钟蛋白frequency（FRQ）以F-box蛋白FWD1作为底物受体，通过CSN维持SCF-FWD1的稳定性和活性从而触发FRQ振荡器泛素化来调节生物节律，而在脉孢菌的csn2突变体中，SCF-FWD1的稳定性不能得到维持，使得FRQ蛋白在细胞内稳定存在而不能被降解，破坏生物钟节律，从而导致脉孢菌分生孢子产生节律出现异常^[32-34]。

真菌感受光信号同样与COP9信号复合体有关。通常黑暗条件有利于构巢曲霉在封闭的子实体（闭囊壳）中产生有性的子囊孢子，从而进行有性发育；光照条件抑制构巢曲霉的有性周期，从而有利于分生孢子的形成^{[35, 36]}。Busch等^[37]研究发现CSN缺失的构巢曲霉无法感受光信号，导致光控制的发育受损，虽然构巢曲霉CSN突变体在光条件下也会引发有性周期并发育形成原基，但不能形成成熟的有性子实体，可能是由于构巢曲霉CSN突变体对氧化应激非常敏感而无法处理细胞内产生的ROS信号^[15]，因此在原基阶段被阻滞而不能形成子实体。而关于velvet复合体的研究进一步证实了真菌COP9信号复合体参与真菌光信号的响应调控。velvet复合体是Bayram等在真菌中发现一个异源三聚体（VelB/VeA/LaeA）并命名为velvet复合体^[38]，也是一种调节蛋白。该复合体的VeA亚基是一个光敏蛋白（能够感受红光和蓝光），在VelB和LaeA两个亚基之间起桥梁作用，而VeA亚基是一个高磷酸化蛋白^[39]，该蛋白的降解途径受COP9信号复合体控制^{[14, 15]}。

此外，研究发现，COP9信号复合体在响应光信号过程中，还通过调节激素的产生来调控真菌的发育。psi（precocious sexual inducers）因子是一类脂氧化物的信息素，根据其组成结构和羟基位置的不同分3种（psiA、psiB和psiC），能够影响真菌有性和无性孢子形成^[40-42]，它们均由psi因子合成加氧酶Ppo（psi factor producing oxygenases，Ppo）调控产生，包括PpoA、PpoB、PpoC^[43]。3种psi因子（psiA、psiB和psiC）产生的比例决定无性和有性发育之间的平衡^{[41, 44]}。有研究报道CSN复合体缺失会降低构巢曲霉发育阶段ppoC的表达水平，并且会伴随着ppoA表达的增加，导致构巢曲霉有性发育增加^[15]。Tsitsigiannis等^[40]的研究同样表明ppoC基因缺失或ppoA的超表达都会增加构巢曲霉的有性发育，然而该研究还显示，在构巢曲霉veA突变体中几乎没有检测到ppoA表达，而在构巢曲霉csnD突变菌株中表达增加，这表明构巢曲霉VeA和CsnD均可调节ppoA的表达，且两者对ppoA表达的调节呈现出一种拮抗关系。综合上述研究结果，CSN很可能是通过调控velvet复合体进一步调节ppoA的表达，并且ppoC缺失或者ppoA超表达可能是CSN突变体菌株在光下无法抑制有性发育的原因之一。

2.3 参与细胞壁降解酶合成、氨基酸和脂质代谢来调控真菌生长

现有研究结果主要集中于COP9信号复合体对真菌发育及次级代谢的影响，关于COP9信号复合体对真菌生长影响的报道较少，但也有研究表明COP9信号复合体能够影响真菌正常的生长。Nahlik等^[15]在研究构巢曲霉csnE突变体时发现，细胞壁降解酶的表达降低。构巢曲霉的csnD或csnE任一基因缺失，与野生型菌株相比均出现细胞变小的表型^[37]。He等^[32]发现，脉胞菌（Neurospora）csn2突变体比野生型的菌丝生长缓慢，且气生菌丝较少。综合上述研究结果，推测CSN能够调控真菌细胞壁降解酶的合成，从而对细胞壁重塑起到重要作用，进一步抑制了真菌的生长。此外，Licursi等^[16]为了进一步表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中CSN的功能，利用转录组学和蛋白质组学方法分析表明，Csn5参与调控氨基酸和脂质代谢，特别是细胞膜上麦角固醇的生物合成，其突变体表现出锌离子被动输入，这可能是由于麦角固醇含量降低使得细胞膜对一价、二价阳离子的透性增加，进而影响了对锌离子的吸收。

3 COP9信号复合体协调真菌次级代谢产物合成

真菌次级代谢是指在一定生长时期中合成一些对真菌本身并无明确作用物质的过程。真菌能够产生多种多样的次级代谢产物，不论从结构还是活性上来讲都较为独特，具有很高的研究价值，也是目前人类较为关注的研究热点。然而，同一菌种在不同环境下其次级代谢途径也会完全不同^[45]，同时真菌中次级代谢的控制通常能够调控真菌生长和发育^{[14, 46, 47]}。但目前对于真菌次级代谢的调控机制还不明确。大量研究显示，对CSN控制过程的调控，可严重影响生物体的次级代谢。

现已发现，在植物CSN突变体中赤霉素和茉莉酸的生物合成减少，从而导致对病原体的抗性减弱、抗坏血酸（维生素C）的生物合成升高^[48-50]。在真菌模式生物构巢曲霉中，CSN的第五亚基csnE基因缺失，对构巢曲霉的激素类物质psi因子产生作用，改变了psi因子之间的比例，从而抑制了构巢曲霉无性发育，破坏了构巢曲霉正常的有性发育。另外，对构巢曲霉csnE突变体的代谢产物指纹分析结果显示，仅在发育时期就有超过100多种代谢物在突变体中富集，如苔色酸的衍生物和杂色曲霉素的中间体等^[15]。Busch等^[37]在构巢曲霉CSN缺陷突变体中发现有红色素积累，菌丝呈现红色；Helmstaedt等^[51]对构巢曲霉candA突变体的研究显示，菌丝也呈现红色，而candA是编码Cand1（Cullin-associated Nedd8-dissociated protein 1）的基因之一，Cand1有助于COP9信号复合体的去Nedd化过程^[52]，这一结果进一步说明，出现这种红色表型的关键是neddylation-deneddylation功能失调，并且进一步鉴定表明这种红色物质可能是与苔色酸相关的代谢物：orcinol、diorcinol、cordyol C、violaceol I和violaceol Ⅱ^[15]。

此外，目前关于真菌沉默基因簇的研究引起了研究者的广泛关注，而CSN突变体可以激活某些沉默基因簇。Gerke等^[53]在研究构巢曲霉csnE突变体转录组中发现，多个先前沉默的基因簇被活化，其中包括聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的编码基因，而PKS的产物为2，4-dihydroxy-3-methyl-6-（2-oxopropyl）benzaldehyde（DHMBA），进一步研究确定DHMBA具有抗菌活性，有研究显示DHMBA可作为合成azaphilones的中间体^[54]，azaphilones是具有吡喃酮-醌结构的颜料，其中一些显示出生物活性，如抗微生物和抗肿瘤活性^{[55, 56]}，并且可能将azaphilones作为未来的食品着色剂^[57]。然而，其他被激活基因簇的相应产物尚未得到鉴定，这些代谢物的细胞或生态学功能目前也是未知的。

4 结语

COP9信号复合体作为真核生物中重要的高度保守的调控蛋白复合物，自发现以来，在生物体中的作用一直备受关注，国内外已有大量的相关文献，但缺乏在真菌中的系统分析研究，同时存在一些亟待解决的问题。关于COP9信号复合体的亚基组成以及所含结构域已基本掌握，但对于部分真菌所含CSN亚基的数量以及每个亚基的功能仍需进一步确认。另外，结构域的功能以及如何发挥作用还有待进一步的研究。CSN与蛋白酶体“盖子”结构和翻译起始因子eIF3具有相似性，但这些复合体在功能上的联系还并不清晰。

目前对COP9复合体研究最多的是其对CRL泛素连接酶的调控，然而CRL泛素连接酶有很多种，因此，为进一步阐明CSN在生物体中的角色，CRL的鉴定将是未来研究的主要任务之一。在构巢曲霉中仅仅以Cullin1蛋白为核心的SCF（Skp1-Cullin1-F-box）复合物的底物受体亚基F-box蛋白就有70多种^[58]。在构巢曲霉中已经发现了一种SCF，F-box蛋白为GrrA，在该菌子实体成熟的晚期发挥着重要的作用^[59]。虽然多个研究结果已表明COP9复合体参与调控真菌产生次级代谢产物的种类与数量，包括各种抗生素、真菌毒素等^[60]，但其调节过程和机理并不清楚，难于实现定向调控真菌次级代谢产物，因此加强CSN对真菌次级代谢的调控研究，对控制真菌次级代谢的产生、更好服务于人类经济社会发展具有重要意义。

COP9信号复合体能够调控真菌发育，而孢子是导致真菌病害传播和流行的关键。因此，加强对COP9信号复合体影响病原真菌发育形成孢子的研究至关重要。近期本实验室首次克隆了烟草疫霉csn4基因，并定量分析了csn4基因在烟草疫霉不同生长发育时期的拷贝数量。研究结果显示，在烟草疫霉发育形成孢子囊时期csn4基因拷贝数量比营养生长阶段显著升高（数据未发表）。同时研究发现，当硼抑制烟草疫霉孢子囊形成时，烟草疫霉的csn4基因转录数量相比未处理组显著减少，这表明COP9信号复合体csn4亚基与烟草疫霉产孢子囊相关。但具体的生物学过程还不得而知，仍需进行进一步研究。

目前国际上关于真菌COP9信号复合体的研究主要集中在几个模式真菌中，有关COP9信号复合体在真菌生命代谢中的地位与作用还处于积累阶段，国内相关研究更少。因此这些未知领域必将会吸引无数学者进行更多的相关研究，随着研究的深入，真菌COP9信号复合体的调控作用将会越来越清楚，有助于调控真菌有益与有害次级代谢产物、控制病原真菌孢子产生、防控病原真菌对寄主的侵染。