人白介素10（Interleukin-10，IL-10）是一种通过跨膜受体介导的重要的免疫细胞调节因子，是重要的抗炎细胞因子之一。普遍认为，IL-10可以抑制炎症反应和各种肿瘤，增强体液免疫应答^[1-5]。IL-10是由多种细胞释放的，对T细胞、B细胞和骨髓瘤细胞有不同的影响^[6]，它可以下调Th1细胞因子的表达，促进B细胞的增值、生存。IL-10受体（IL-10R）由两条链组成，IL-10RA和IL-10RB，IL-10RA可以调节IL-10的免疫抑制信号，从而抑制促炎因子的合成^{[7, 8]}。IL-10RA可参与PEDF通路、EGF-β通路、AKT信号通路、JAK-STAT信号通路。IL-10RA的激活可导致非受体型酪氨酸激酶JAK1的激活，引发下游信号转导通路的激活，产生一系列的反应。JAK1是非受体型酪氨酸蛋白激酶的家族成员之一，JAK1的突变或者过度表达可以引发多种疾病，如子宫内膜癌、胃癌等^{[9, 10]}。因此，研究JAK1与IL-10RA之间的蛋白相互作用极具意义。

目前对于IL-10RA蛋白的研究主要是对下游的信号通路的激活等，IL-10RA与JAK1的相互作用的研究报道并不多。结合前期的工作，本实验室已成功构建并表达JAK1蛋白，接下来构建IL-10RA的真核表达质粒，并表达IL-10RA蛋白。共转染pENTER-IL-10RA-His和pENTER-JAK1-His重组质粒，用免疫印迹检测两者的表达，免疫共沉淀检测两者的相互作用，旨在为研究两者蛋白相互作用的机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料

DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；pENTER-JAK1-His质粒、Hela细胞和HEK293细胞由南方医科大学抗体工程研究所保存。

1.1.2 试剂

胎牛血清、1640培养基和DMEM培养基购自Hyclone公司；Total RNA小提试剂盒、和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；SuperScript^TM Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒和Lipofectamine^® 2000转染试剂购自Invitrogen公司；PrimeStar Max DNA聚合酶和DNA 2000核酸Marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶AsiS Ⅰ和MIu Ⅰ购自BioLabs公司；一步法克隆试剂盒购自biotool公司。引物合成和质粒测序由华大基因完成。蛋白Marker购自ThermoFisher；PVDF膜购自Bio-RAD公司。鼠源抗GAPDH抗体、鼠源抗His抗体、山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自Bioworld公司；兔源抗JAK1抗体购自Cell Signaling Technology公司，抗IL-10RA抗体（鼠源）由罗树红教授赠与。Protein G Agrose beads购自Millipore公司。

1.1.3 仪器设备

PCR扩增仪购自Life Technologies公司；蛋白电泳仪及转移装置购自BioRad公司；核酸电泳仪购自JUNYI。

1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成

在GenBank中获取IL-10RA基因序列（NM_001558），根据mRNA编码区，用Primier5.0软件进行引物设计，并在5'端加入保护碱基和酶切位点，上游引物：5'-GCCGCGATCGCCATGCTGCCGTGCCTCGTAGTGCTGC-3'（下划线为AsiS I酶切位点），下游引物：5'-GCATGCGCATCACTCACTTGACTGCAGGCTAGAG-3'（下划线为MIu I酶切位点）。扩增的IL10RA基因片段大小为1 756 bp。

1.2.2 IL-10RA基因的扩增

用含10%胎牛血清的1640培养基培养HeLa细胞，按照Total RNA小提试剂盒的步骤提取人Hela细胞的总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照SuperScript^TM Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒说明书将提取的RNA逆转录成cDNA。PCR体系：PrimeStar Max 25 μL，cDNA模板5 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，总体积为50 μL。PCR扩增反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 s，56℃ 5 s，72℃ 2 min，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.2.3 真核表达质粒pENTER-IL-10RA-His的构建

将pENTER-His质粒进行AsiS Ⅰ和MIu Ⅰ双酶切3 h，IL-10RA的PCR克隆产物和pENTER-His质粒用胶回收试剂盒回收产物。用一步法克隆试剂盒连接IL-10RA回收产物和回收的pENTER-His产物（IL-10RA和pENTER-His的摩尔比为5：1），16℃，20 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆于5 mL含Kana的LB培养基中，37℃摇床培养10 h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。质粒经PCR扩增和双酶切鉴定为阳性克隆后，送至华大基因科技有限公司测序鉴定。

1.2.4 HEK293细胞培养及IL-10RA质粒转染

用含10%胎牛血清的DMEM培养HEK293细胞。转染前1 d将细胞以4×10⁵细胞/孔接种于6孔板培养。次日待细胞生长至60%，按照Lipofectamine^® 2000转染试剂说明书转染，质粒（μg）：转染试剂（μL）为1:3的比例将空质粒、重组质粒pENTER-IL-10RA-His各2 μg转染至HEK293细胞，转染6 h后HEK293细胞换液，转染48 h后收细胞进行蛋白水平鉴定。

1.2.5 JAK1与IL10RA质粒共转染

转染前1 d将细胞以6×10⁶细胞/皿接种于10 cm培养皿中。用同样的方法将7 μg的pENTER-JAK1-His和3 μg的pENTER-IL-10RA-His重组质粒和30 μL转染试剂转染至HEK293细胞中，7 μg的pENTER-JAK1-His和3 μg的pENTER-IL-10RA-His分别转染作为对照组。48 h后收细胞进行蛋白水平鉴定。

1.2.6 免疫印迹检测蛋白的表达

将收集的蛋白样品加入等体积的SDS-loading buffer（2×），沸水煮15 min使蛋白变性，后14 000 r/min，室温离心15 min。经10% SDS-PAGE进行蛋白电泳。PVDF膜用甲醇浸泡5 min后进行电转移。PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入1:10 000用封闭液稀释的抗His标签的鼠抗和抗GAPDH抗体为一抗，室温孵育1 h。TBST工作液洗涤4次，每次8 min。加入山羊抗鼠IgG-HRP为二抗（1:10 000稀释），室温孵育1 h。TBST工作液洗涤6次，每次8 min。ECL显影。

1.2.7 免疫共沉淀鉴定IL-10RA和JAK1的相互作用

将共转染表达的JAK1和IL-10RA的细胞用细胞裂解液收集，充分裂解。制备的裂解液中加入2 μg的抗IL-10RA的抗体，以HEK293细胞为对照，4℃结合过夜。40 μL/管Protein G Agrose beads 5 000 r/min离心1 min，弃上清，用40 μL细胞裂解液重悬，加入到过夜反应的混合液中，4℃结合1 h。5 000 r/min离心1 min弃上清，重复4次，加入40 μL SDS-loading buffer（2×）准备蛋白电泳样品，免疫印迹法检测，这里抗IL-10RA的抗体和抗JAK1的抗体为一抗分别孵育相应位置的条带，相对应的山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP为二抗。

2 结果 2.1 人Hela细胞总RNA鉴定

提取的Hela的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳，结果（图 1）显示，有明显的28S和32S两条条带，OD_260/280约为1.98，说明此次提取的总RNA可用于逆转录cDNA。

2.2 IL-10RA扩增产物的鉴定

合成的引物以cDNA为模板经PCR扩增目的片段，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果（图 2）显示约1 756 bp可见特异性目的条带，与IL-10RA大小一致。

2.3 重组质粒的PCR鉴定

提取质粒并进行重组质粒的PCR鉴定。1%琼脂糖凝胶结果（图 3）在约1 756 bp可见特异性目的条带，与IL-10RA大小一致，说明重组质粒含有IL-10RA基因片段。

2.4 重组质粒的双酶切鉴定

分别用限制性内切酶AsiSⅠ和MIuⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图 4），在约1 756 bp和7 472 bp处可见IL-10RA基因和pENTER-His质粒的条带，说明重组质粒构建成功。

2.5 免疫印迹法鉴定重组质粒pENTER-IL-10RA-His在HEK293细胞的表达

收集转染48 h的HEK293细胞，Western blotting鉴定IL-10RA蛋白表达量（图 5），以未处理的HEK293细胞作为对照组。实验组HEK293细胞中转染pENTER-IL-10RA-His质粒，Western Blotting鉴定可见约63 kD的IL-10RA蛋白条带。

2.6 免疫印迹法鉴定共转染质粒pENTER-IL-10RA-His和pENTER-JAK1-His在HEK293的表达

收集共转染重组质粒pENTER-IL-10RA-His和pENTER-JAK1-His的HEK293细胞，检测其蛋白表达量，以未处理的HEK293细胞、单转质粒pENTER-IL-10RA-His、质粒pENTER-JAK1-His为对照组，Western Blotting鉴定。由图 6可知，实验组出现两条条带，位置在约63 kD和133 kD处；未处理的HEK293细胞未出现特异性条带；单转染的质粒pENTER-IL-10RA-His在约63 kD有条带出现；单转染的质粒pENTER-JAK1-His在133 kD处出现条带，这与共转染的结果相符，说明共转染质粒成功表达IL-10RA和JAK1蛋白。

2.7 免疫共沉淀检测IL-10RA和JAK1蛋白的相互作用

共转染JAK1和IL-10RA质粒的细胞裂解液用抗IL-10RA的抗体捕获裂解液中的IL-10RA，同时捕获的还有可以与之相互作用的JAK1蛋白。Protein G Agrose beads可特异性结合抗IL-10RA的抗体。加入Protein G Agrose beads后，抗IL-10RA的抗体和IL-10RA及与之相互作用的蛋白JAK1均结合在Protein G Agrose beads上，通过低速离心，使得与裂解液中的其他蛋白分离，Western Blotting鉴定（图 7）。HEK293细胞对照组只出现抗体的重链和轻链，而实验组除了抗体的重链和轻链，还有目的条带JAK1和IL-10RA的条带，这说明两个蛋白在HEK293细胞中存在相互作用，并且可以用免疫共沉淀检测。

3 讨论

自90年代开始，人类开始实施基因组计划，至2003年经过世界各国科学家的努力，提前完成了人全基因组测定。但是，大多数疾病并非仅仅因为基因改变造成，随后又提出后基因组计划，蛋白质组的研究占据及其重要的部分，但是对于蛋白质功能及其相互作用方面的研究仍相对缺乏。目前研究蛋白质相互作用技术方法很多，如噬菌体展示技术、串联亲和纯化技术、pull down，免疫共沉淀等^[11-17]。研究发现，IL-10可以调节相关细胞的神经炎症反应，而且也存在抗凋亡作用。IL-10通过与神经元上的IL-10RA相互作用，导致JAK1-STAT3通路的激活，抑制神经元凋亡和神经炎症^[18]。Wagner等^[19]发现JAK1激活程度不同可引起下游不同的信号转导通路，JAK1的抑制可某种程度上减轻自身免疫病及炎症，这提示未来JAK1的抑制剂可能可以应用于自身免疫性疾病的治疗。但是，目前对于IL-10RA蛋白的研究主要致力对下游信号通路的激活等，IL-10RA与JAK1的相互作用的研究报道并不多。因此，本研究尝试用免疫共沉淀的方法检测IL-10RA与JAK1的蛋白相互作用。而IL-10RA参与多条信号通路，因此与其存在相互作用的蛋白必然很多，现今用经典的免疫共沉淀的方法对这些相互作用蛋白尚并不能定量，而且检测过程繁琐而复杂。因此，尝试用免疫分析的方法如ELISA、时间分辨免疫分析、化学发光免疫分析等，以期对已知存在相互作用的蛋白进行简便快速的检测，同时也可为其他研究者寻找未报道的存在相互作用的蛋白提供便利，这将是未来的一个研究方向。

4 结论

本实验从Hela细胞中提取人总RNA，并通过逆转录PCR获得IL-10RA基因全长，以pENTER-His为载体构建重组真核表达质粒转染至HEK293细胞表达蛋白，Western blot可检测到与人IL-10RA大小一致的蛋白条带。共转染及免疫共沉淀均可检测到IL-10RA和JAK1。真核表达蛋白特异性较强，具有生物学活性，其结构更接近天然蛋白。